烟草查尔酮合成酶NtCHS1基因及其应用
【专利摘要】本发明公开了烟草查尔酮合成酶NtCHS1基因，编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过实验证明，改变烟草中查尔酮合成酶基因的表达水平，可以调节烟草花色、株高以及绿原酸和芸香苷等类黄酮化合物的含量，因此，本发明构建了含有NtCHS1基因的重组表达载体、NtCHS1基因沉默载体，并转化烟草植株。本发明通过过表达或沉默技术调节NtCHS1基因的表达，可以获得花色深浅各异或株高较低的转基因烟草植株，提高了烟草的观赏价值；并且可以提高烟草中绿原酸和芸香苷合成，实现了利用烟草大量生产芸香苷和绿原酸的目的，使得烟草叶片获得了更广泛的应用，具有重大的经济价值和应用前景。
【专利说明】
烟草查尔酬合成酶NtCHSI基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及烟草查尔酬合成酶化CHS1基因，W及该基因在调控烟草株高、花色，及 绿原酸、芸香巧等类黄酬化合物的含量中的应用。本发明还设及含有该基因的重组表达载 体，W及其在制备烟草绿原酸和芸香巧等酪类化合物中的应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 烟草是我国主要的经济作物之一，种植面积和产量均居世界首位。烟草生物产量 大，含有大量的化学成分，在卷烟工业、医药、食品、饲料W及农药等方面都有重要的用途。 但我国对烟草的利用方式比较单一，目前主要用于制备卷烟等烟制品，没有充分发挥其多 种功效的生物学特性综合利用。
[0003] 绿原酸(化lorogenic acid，CGA)，又称咖啡单宁酸、咖啡较酸，是一种重要的活性 物质，具有屯、血管保护、抗氧化、抗紫外及抗福射、抗诱变及抗癌、保肝利胆、抗菌、抗病毒、 降脂降糖、免疫调节等作用。绿原酸在植物中分布广泛，主要存在于忍冬科忍冬属、菊科葛 属及杜仲科杜仲属等植物中。在杜仲、金银花、咖啡、菊花等植物中的含量非常高。芸香巧 (Rutin),别名芦下、维生素 P、紫搬皮巧等。芸香巧存在于槐米、香椿、养麦等多种植物中，特 别是在槐花中含量较高。芸香巧具有丰富的药理学活性，如抗炎、抗病毒、凉血止血、降低毛 细血管壁脆性等作用。目前芸香巧在临床上常用于防治脑溢血、高血压、视网膜出血、紫癒 和急性出血性肾炎等疾病。绿原酸和芸香巧在医药、化工和食品等领域都具有广泛的应用。
[0004] 我国在芸香巧和绿原酸的生物合成、药理活性、提取纯化W及开发利用等方面的 研究较为滞后。现有技术中，绿原酸和芸香巧的主要来源是从天然植物中提取。但是，对于 任何一种天然化合物，单纯依靠天然植物资源，均不利于可持续发展。因此，扩大其来源途 径势在必行。目前，利用基因工程方法对次生代谢途径的遗传特性进行改造，合成编码代谢 途径中限速酶基因，导入细胞内增加其表达量和提高目标代谢产物的产量是最常用的策 略，已发展为具有广阔应用前景的热点研究领域。
[0005] 芸香巧和绿原酸均属于酪类物质，在植物中酪类化合物通过苯丙烷代谢途径合 成。在苯丙烷代谢途径中，肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等酪类酸是中间产物，运些酸可 进一步转化为香豆素、绿原酸，也可W形成CoA醋、咖啡酸，再进一步转化为类黄酬、木质素 等多酪类物质。查尔酬合成酶(化alconesynthase，C服，EC 2.3.1.74)是类黄酬代谢途径中 的第一个关键酶，也是重要的限速酶。它催化3分子的丙二酷-CoA和1分子的对香豆酷-CoA 结合形成查尔酬，查尔酬进一步衍生转化构成各类黄酬化合物。目前CHS的研究多集中在植 物花青素合成途径方面，C服基因的过量表达引起转基因植株花和果皮中色素的积累。
[0006] 烟草是典型的基因工程模式植物，目前烟草已经作为生物反应器成功应用于多种 药用蛋白、抗体W及疫苗的生产。因此，本发明利用基因工程方法，通过调控烟草花中CHS基 因的表达量，形成各类颜色的烟草花制品，提高了烟草的观赏价值;通过超表达CHS基因，获 得能够高产芸香巧、绿原酸等强药理活性物质的烟草植株或烟草悬浮细胞系，对提高烟草 在医药、食品等领域的利用价值有非常重要的意义。
【发明内容】
[0007]针对上述现有技术，本发明从普通烟草中克隆获得了化CHS1基因（包括编码区和 调控区）。本发明的实验证明，通过基因过表达和基因沉默改变烟草中化CHS1基因的表达水 平，可W调节烟草株高、花色及绿原酸、芸香巧等类黄酬化合物的含量。本发明为改良烟草 品质，提高烟草在医药、食品等领域的利用价值有非常重要的意义。
[000引本发明还构建了含有化CHS1基因的重组表达载体，W及化CHS1基因沉默载体，并 将其导入烟草中，增强或减弱了其原有基因的表达，从而可调控烟草的花色(变深或变浅）、 株高(变矮），W及绿原酸和芸香巧的合成能力(含量升高或降低）。
[0009] 本发明是通过W下技术方案实现的：
[0010] 烟草查尔酬合成酶化CHS1基因，包括启动子和编码区（编码区即为狭义上的烟草 查尔酬合成酶化CHS1基因），启动子的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，编码区的核巧酸序 列如SEQ ID NO. 2所示(该序列中，第16~195位为外显子序列；第196~1184位为内含子序 列，第1185~2176位外显子序列）；其所编码的氨基酸（查尔酬合成酶）的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 所述烟草查尔酬合成酶化CHS1基因，通过控制其表达量，可W调控烟草花色、烟草 株高，W及绿原酸和芸香巧等类黄酬化合物的含量高低，具体为:过表达化CHS1基因，可W 加深烟草花色，提高烟草植株中绿原酸和芸香巧等类黄酬的含量，获得高产绿原酸和芸香 巧的转基因材料;抑制化CHS1基因的表达，可W使烟草花色变浅，降低株高，降低草植株中 绿原酸和芸香巧等类黄酬的含量。
[0012] 一种含有化CHS1基因的重组表达载体，其上装载有化CHS1基因，所用载体为任意 一种可用于根瘤农杆菌转化植株的双元载体，如pBI系列载体(如pBI 121)，pCHF系列载体 (如pCHFl)、Gateway?系列载体(如PH2GW7)或其他衍生植物表达载体，优选的，为PC3301- ZDS载体。
[0013] 所述含有化CHS1基因的重组表达载体的构建方法为：从烟草中提取总RNA，进行 cDNA反转录，然后利用特异性引物进行PCR扩增，得扩增产物(为烟草查尔酬合成酶化CHS1 基因的外显子）；将扩增产物与载体(如PC3301-ZDS载体)连接，即得到含有化CHS1基因的重 组表达载体。
[0014] 所述特异性引物为：
[0015] 化C服1-F:ATCTAGAAACCCTAGTAATCGTCCATC；
[0016] NtCHSl-R:TGAGCTCCCACTAAGTAGCAACACTGTG;如沈Q ID NO.7、8所示；其中，限制性 内酶切位点为引物中下划线标注序列，分别为XbaI酶切位点：TCTAGA; Sac I酶切位点： GAGCTCo
[0017] 所述含有化CHS1基因的重组表达载体，将其导入烟草植株中，获得转基因植物A， 该转基因植物A具有如下（1)或(2)中至少一种特征：
[0018] (1)转基因植物A的花色深于野生型植物；
[0019] (2)转基因植物A的绿原酸、芸香巧等黄酬类化合物的含量高于野生型植物。
[0020] 因此，所述含有化CHS1基因的重组表达载体具有W下用途：
[0021] (1)在调节烟草花色(使花色加深）中的应用。
[0022] (2)在调节烟草植株中绿原酸、芸香巧等黄酬类化合物的含量(提高含量）中的应 用。
[0023] (3)在制备绿原酸和芸香巧中的应用。
[0024] 将含有化CHS1基因的重组表达载体，导入烟草植株中，获得转基因植物A的具体方 式可W为:将含有化CHS1基因的重组表达载体转化根瘤农杆菌(如LBA4404菌株）（该菌株可 通过常规市场途径购买得到），获得含化CHS1基因的根瘤农杆菌菌株，然后转化烟草受体， 再通过组织培养技术获得转基因烟草植株。进一步，培养该植株，并提取、分离、纯化，得到 烟草绿原酸和芸香巧。
[0025] 一种化CHS1基因沉默载体(RNAi干扰载体），其上装载有化CHS1基因的干扰片段 (序列如SEQ ID NO.4所示），所用载体为任意一种可用于根瘤农杆菌转化植株的干扰载体， 如pTCK系列载体(如PTCK303等），GatewayTW系列载体(如抑aLSCATE等)或其他衍生植物表 达载体。
[0026] 优选的，所述化C服1基因沉默载体(RNAi干扰载体），是采用Gateway重组克隆技术 构建的，其构建方法包括W下两步：
[0027] (1)8?反应构建入口克隆:将干扰片段(序列如569 10^.4所示)在8?〇1〇11日3611 n enzyme mix催化作用下重组到入口克隆PD0NRTM201上，经BP反应构建入口克隆；
[00%]所述干扰片段的制备方法为：从烟草中提取总RNA，进行cDNA反转录，经两步PCR (用特异性引物组合Fi-chs/Ri-chs和attBl/attB2)扩增，即获得两端含有特异性结合位点 的干扰片段at巧-PCR产物。所述特异性引物组合Fi-chs/Ri-chs和attBl/attB2的序列如下 所示：
[00 巧]Fi-chs:AAAAAGCAGGCTTCGTATCACTAATAGCGAGCAT;
[0030] Ri-chs：AGAAAGCTGGGTCGGGCATGTCTACACCAC；
[0031] attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT;
[0032] at巧2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT;如沈Q ID N0.9、10、ll、12所示；
[0033] 所述BP反应的反应体系为:TE buffer 6ul，入口克隆PD0NRTM201 lul，干扰片段 lul，BP cion曰seTMn Enzyme Mix 2ul;
[0034] 所述BP反应的具体步骤如下:干扰片段和PD0NRTM201混合反应物在25°C条件下反 应2~化，然后加入化L的蛋白酶K，37°C溫育lOmin终止BP反应，即得入口载体质粒；
[0035] (2)LR反应构建RNAi干扰载体:将上述入口载体质粒与抑7GWIWG2(I)重组整合，经 LR反应构建RNAi干扰载体。
[0036] 所述LR反应的反应体系为:TE buffer 6ul，表达载体抑7GWIWG2(I)lul，入口载体 质粒lul，LR clonaseTMEElnzyme Mix 化 1(反应条件同BP反应）。
[0037] 所述化CHS1基因沉默载体(RNAi干扰载体），将其导入烟草植株中，可获得转基因 植物B(该转基因植物B中的化CHS1基因的表达受到抑制或失活），该转基因植物B具有如下 (1)或(2)或(3)中至少一种特征：
[0038] (1)转基因植物B的花色浅于野生型植物；
[0039] (2)转基因植物B的株高低于野生型植物；
[0040] (3)转基因植物B的绿原酸、芸香巧等黄酬类化合物的含量低于野生型植物。
[0041] 因此，所述化CHS1基因沉默载体(RNAi干扰载体)具有W下用途：
[0042] (1)在调节烟草花色(使花色变浅）中的应用。
[0043] (2)在调节烟草株高(变矮）中的应用。
[0044] (3)在调节烟草植株中绿原酸、芸香巧等黄酬类化合物的含量(降低含量）中的应 用。
[0045] 将化CHS1基因沉默载体，导入烟草植株中，获得转基因植物B的具体方式可W为： 将化CHS1基因沉默载体转化根瘤农杆菌（如LBA4404菌株），获得含化CHS1基因沉默载体的 根瘤农杆菌菌株，然后转化烟草受体，再通过组织培养技术获得转基因烟草植株。
[0046] 一种含化CHS1基因的根瘤农杆菌，是由上述含有化CHS1基因的重组表达载体或 化CHS 1基因沉默载体转化根瘤农杆菌所得。
[0047] -种制备烟草绿原酸和芸香巧的方法(提高烟草中绿原酸和芸香巧含量的方法）： 将上述含有化CHS1基因的重组表达载体转化根瘤农杆菌（如LBA4404菌株），获得含化CHS1 基因的根瘤农杆菌菌株，然后转化烟草受体，通过组织培养技术获得转化成功的烟草植株， 培养该植株，提取得到烟草绿原酸和芸香巧。
[0048] 本发明通过实验证明，通过改变烟草中查尔酬合成酶基因（NtCHSl)的表达水平， 可W调节烟草花色、株高W及绿原酸和芸香巧等类黄酬化合物的含量。在重要的双子叶模 式植物烟草中验证了化CHS1基因在上述应用中的作用。过表达化C服1基因可W加深烟草花 色，提高类黄酬含量，获得高产绿原酸和芸香巧的转基因材料;抑制化CHS1基因的表达，可 W使烟草花色变浅，降低株高，降低类黄酬含量。因此，本发明发现了简单有效的调节植物 花色、株高W及类黄酬含量的方法，同时也为培育高绿原酸和芸香巧含量的烟草基因工程 品系提供一种新的方法。
[0049] 本发明通过过表达或沉默技术调节化CHS1基因的表达，调节植物花色和株高的方 法，是采用基因工程方法，将化CHS 1基因导入烟草植株或抑制植株内源化C服1基因，从而获 得了花色深浅各异或株高较低的转基因烟草植株，提高烟草的观赏价值。本发明对利用基 因工程烟草，提供规模化的观赏烟草新品系具有重要意义。
[0050] 本发明从烟草中克隆化CHS1基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用根瘤农 杆菌介导，将化CHS1基因导入烟草并再生出植株，PCR检测外源目的基因化CHS1的整合情 况，高效液相色谱测定烟草中芸香巧和绿原酸的含量，筛选获得芸香巧和绿原酸含量提高 的转基因烟草植株。查尔酬合成酶(NtCHSl)是烟草植物合成芸香巧的关键酶和限速酶，增 强查尔酬合成酶的活性，可W提高烟草芸香巧的含量，同时可W提高上游合成途径中绿原 酸的含量。本发明将化CHS1基因转化烟草，提高烟草中绿原酸和芸香巧合成，获得高绿原酸 和芸香巧含量的烟草新植株，为培育高绿原酸和芸香巧含量的烟草基因工程品系提供一种 新的方法。
[0051] 本发明的通过转化化CHS1基因提高烟草中绿原酸和芸香巧含量的方法，是采用基 因工程方法，将化CHS1基因导入烟草植株中，获得了绿原酸和芸香巧含量显著提高的转基 因烟草植株，最高分别可达到7.42mg/g和5.42mg/g，分别是非转基因烟草(绿原酸4.73mg/ g，芸香巧3.48mg/g)的1.55倍和1.56倍，从而实现了利用烟草大量生产芸香巧和绿原酸的 目的，使得烟草叶片获得了更广泛的应用。本发明对利用基因工程烟草，提供规模化生产绿 原酸和芸香巧的新原料具有重要意义，具有重大的经济价值和应用前景，尤其在医疗、保健 领域。
【附图说明】
[0052] 图1:T0代过表达转基因烟草DM水平检测结果，其中，对照是W非转化烟草基因组 DNA为模板时，没有扩增出目的条带;转化成功的转基因阳性植株扩增出特异的一条亮带。
[0053] 图2:T0代过表达转基因阳性烟草植株RNA水平检测结果，其中，CK为非转化烟草的 化CHS1基因的表达水平，〇1-0、(：-2-0、(：-3-0、(：-5-0为转基因烟草的不同株系（一棵转基因 植株代表一个株系）的化CHS1基因的表达水平。
[0054] 图3:T0代干扰转基因阳性烟草植株RNA水平检测结果，其中，CK为非转化烟草的 化CHS 1基因的表达水平，C-1-R、C-2-R、C-5-R、C-6-R为转基因烟草的不同株系（一棵转基因 植株代表一个株系）的化CHS1基因的表达水平。
[0055] 图4:T1代过表达转基因阳性烟草植株中花色图片，其中，CK为非转化烟草的花色， C-1-0，C-2-0，C-3-0，C-5-0为过表达化CHS1基因的转基因植株的花色。
[0056] 图5:T1代干扰转基因阳性烟草植株中花色图片，其中，CK为非转化烟草的花色，(：- 1-尺，(：-2-1?，(：-5-1?，(：-6-1?为抑制化(：服1基因表达的转基因植株的花色。
[0057] 图6:T1代干扰转基因阳性烟草植株株高图片，其中，CK为非转化烟草的株高，CR为 抑制化CHS 1基因表达的转基因植株的株高。
[005引图7:T1代过表达转基因阳性烟草植株中绿原酸含量结果，其中，CK为非转化烟草 的绿原酸含量，C20、C30、C50为过量表达化CHS1基因的转基因植株的绿原酸含量。
[0059] 图8:T1代干扰转基因阳性烟草植株中绿原酸含量结果，其中，CK为非转化烟草的 绿原酸含量，C1R，C2R，C5R，C6R为抑制化C服1基因表达的转基因植株的绿原酸含量。
[0060] 图9:T1代过表达转基因阳性烟草植株中芸香巧含量结果，其中，CK为非转化烟草 的芸香巧含量，C20、C30、C50为过量表达化CHS 1基因的转基因植株的芸香巧含量。
[0061] 图10:T1代干扰转基因阳性烟草植株中芸香巧含量结果，其中，CK为非转化烟草的 芸香巧含量，(：11?，〔21?，〔31?，〔61?为抑制化(：服1基因表达的转基因植株的芸香巧含量。
【具体实施方式】
[0062] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0063] 下述实施例中所设及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所设及的技术、实验方 法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规技术、实验方法，检测方法等。
[0064] 实施例1烟草化CHS1基因启动子序列的扩增
[0065] 取1克烟草品种红花大金元幼嫩叶片，液氮速冻后迅速用研鉢研碎，进行基因组 DNA提取。利用上游引物化CHSl-pro-F: TTTTAAGTCGTAGGCTCTCTTGCTC(如SEQ ID NO. 13所 示）和下游引物化C服l-pr〇-R:TTTCGCCGGAAAAAATGATGGAC(如SEQ ID NO. 14所示)扩增获得 全长为2482bp的PCR产物，如SEQ ID N0.1所示。
[0066] 实施例2烟草化C服1基因的克隆
[0067] 利用实施例1中提取的基因组D N A，利用上游引物N t C H S 1 - D F : GCCCTTAGCGTCGACATGGTGA(女曰 SEQ ID NO . 1 5所示）和下游弓| 物 NtCHS 1-DR : ACTTAGCTGCAGCAAAGGGC(如沈Q ID NO. 16所示)扩增获得全长为2190bp的PCR产物。序列分 析发现，NtC服1基因组DM包含两个外显子和一个内含子，如如SEQ ID NO.2所示。
[006引实施例3烟草化C服1基因的克隆
[0069] 取1克烟草品种红花大金元幼嫩叶片，液氮速冻后迅速用研鉢研碎，进行总RNA提 取、cDNA反转录。
[0070] 根据烟草化CHS1基因的编码序列（如SEQ ID NO.2所示），设计扩增出完整编码框 的上下游引物，上游和下游引物序列中分别包括限制性酶切位点（运可视选用的载体而 定），W便构建表达载体。本实施例中的上下游引物分别为：
[0071] 化CHS1-F:ATCTAGAAACCCTAGTAATCGTCCATC；
[0072] NtC服 1-R:TGAGCTCCCACTAAGTAGCAACACTGTG;如沈Q ID N0.7、8所示。
[0073] 其中，限制性内酶切位点为引物中下划线标注序列，分别为Xba I酶切位点： TCTAGA; SacI 酶切位点：GAGCTC。
[0074] ^上述引物进行扩增，得到约11706口的口〇?产物，为569 10^.2所示序列中的第 16~195位和第1185~2176位外显子序列。
[0075] 本实施例采用基因克隆方法从烟草中获得序列正确的烟草查尔酬合成酶基因 化C服1，为通过过表达策略提高烟草中绿原酸和芸香巧含量提供了一个重要关键酶基因。
[0076] 实施例4烟草化CHS1基因干扰片段的扩增
[0077] 在化CHS1基因编码区的非保守区进行干扰片段设计选择，选择编码区123~415间 长293bp的序列作为干扰片段，根据干扰片段序列设计带有特异性结合位点attB部分序列 的引物，如SEQ ID NO.4所示。
[0078] 利用实施例3中反转录获得的cDNA为模板，经两步PCR(用特异性引物组合Fi-chs/ Ri-chs和attBl/attB2)扩增获得两端含有特异性结合位点的干扰片段attB-PCR产物。引物 序列如表1所示。
[0079] 表 1
[0080]
[0081 ] 实施例5含化CHS1基因的植物表达载体的构建
[0082] 将实施例3扩增获得的化CHS1基因序列产物用Xbal和SacI酶切，得到的酶切产物 与经过同样酶切的PC3301-ZDS载体连接，得到连接产物。将连接产物转化大肠杆菌感受态， 获得转化子。提取转化子的质粒，送测序公司测序，结果显示，该质粒为将化CHS1基因插入 PC3301-ZDS载体中Xbal和SacI酶切位点间得到的植物表达载体，命名为PC3301-ZDS- 化C服1。
[0083] 本实施例将烟草化CHSl基因可操作性的连接于表达调控序列，形成含化CHSl基因 的植物表达载体，该载体可用于通过基因工程策略来提高烟草中绿原酸和芸香巧的含量。
[0084] 实施例6NtC服1基因沉默载体的构建
[00化]本实施例中RNAi干扰载体的构建采用Gateway重组克隆技术构建。Gateway重组载 体的构建需要经历两步反应，分别是经（1)BP反应构建入口克隆和经(2化R反应构建RNAi干 扰载体。
[0086] (1)BP反应构建入口克隆：将实施例4中扩增并纯化的attB-PCR产物在BP ClonaseTM n enz;yme miX催化作用下重组到入口克隆pD0NRTM201上经BP反应构建入口克 隆；反应体系为：TE buffer 6ul，入口克隆PD0NRTM201 lul，attB-PCR产物lul，BP clonaseTME化zyme Mix化1。具体步骤如下：attB-PCR产物和PD0NRTM201混合反应物在25 °C条件下反应2-化，然后加入化L的蛋白酶K，37°C溫育lOmin终止BP反应，取化1反应物转化 大肠杆菌感受态细胞D册a，在加有Kana( 50mg/L)的LB固体培养基上进行单菌落的筛选，挑 取单克隆提取质粒，质粒PCR鉴定正确后送华大公司测序。
[0087] (2 )LR反应构建RNAi干扰载体:将经测序鉴定的入口载体质粒与PH7GWIWG2 (I)重 组整合，经LR反应构建RNAi干扰载体。反应体系：TE buffer 6ul，表达载体抑7GWIWG2(I) lul，入口载体质粒lul，LR clonaseTMEEnzyme Mix化1(反应条件同BP反应）。取化1重组 后的反应物转化大肠杆菌D册a感受态细胞，在加有壮观霉素(50mg/L)的LB固体培养基上筛 选，挑取阳性克隆提取质粒，质粒PCR和酶切鉴定正确后送华大公司测序。
[0088] 实施例7根瘤农杆菌介导化C服1基因遗传转化烟草获得转基因烟草植株
[0089] (一)含化CHS 1基因植株表达载体根瘤农杆菌工程株的获得
[0090] 将实施例5中的含化C服1基因的植株表达载体转入根瘤农杆菌化BA4404)中，获得 的单克隆重组菌产物进行PCR验证，提取质粒并测序。结果表明，该质粒为PC3301-ZDS- NtCHSl，含化CHS1基因的植物表达载体已成功构建到根瘤农杆菌菌株。将含有该质粒的重 组菌命名为 LBA4404/pC3301 -ZDS-NtC服 1。
[0091] 将实施例6中的干扰载体转入根瘤农杆菌化BA4404)中，获得的单克隆重组菌产物 进行PCR验证，提取质粒并测序。结果表明，该质粒为抑7GWIWG2(I)-RNAi-NtCHSl，干扰载体 已成功构建到根瘤农杆菌菌株。将含有该质粒的重组菌命名为LBA4404/pH7GWIWG2(I)- RNAi-化 C服 1。
[0092] (二)根瘤农杆菌介导化CHS1基因转化烟草
[0093] (1)转化C服1烟草的获得、沉默化C服1烟草的获得
[0094] 将上述LBA4404/PC3301-ZDS-化CHS1侵染烟草品种红花大金元的叶片，农杆菌侵 染了约100个1cm2的方形叶盘。分化出的芽经过50mg/L的卡那霉素抗生素抗性筛选，最后移 栽成活得到45株TO代转化C服1烟草。
[00巧]将上述LBA4404/pH7GWIWG2(I)-RNAi-NtCHSl侵染烟草品种红花大金元的叶片，农 杆菌侵染了约100个1cm2的方形叶盘。分化出的芽经过50mg/L的卡那霉素抗生素抗性筛选， 最后移栽成活得到45株TO代转化CHS1烟草。
[0096]所述转化烟草受体后，通过PCR检测判断是否转化成功，PCR检测包括两个方面，一 方面是指DNA水平的检测，即检测目的基因 NtCHSl是否成功地构建并转化到烟草受体中：设 计化C服1基因的DM检测引物，进行DM扩增，紫外线下观察到目的条带的记为转基因阳性； 另一方面是指RNA水平的检测，即检测目的基因化CHS1是否成功地在转基因烟草植株中表 达:设计化CHS1基因的特异扩增引物，利用巧光染料法进行相对巧光定量PCR扩增，观察转 基因阳性植株的过量表达情况。
[0097] (2)转化C服1烟草DNA水平的鉴定
[0098] 提取TO代转化C服1烟草的DNA，根据CaMV35S的序列设计正向引物：
[0099] 355寸:1'口'〇：4口'64〔614466641';如沈9 10備.17所示。
[0100] 根据化CHS1基因的序列设计反向引物：
[0101] 油3-':4〔46〔661641'(：1'口'644〔44;如沈9 10備.18所示。
[0102] 对目的基因进行检测。结果显示，利用上述引物扩增出693bp的特异DNA片段（如 SEQ ID NO.5所示）。而W非转化烟草基因组DNA为模板时，没有扩增出任何条带(见图1)。
[0103] (3)转化C服1烟草RNA水平的鉴定
[0104] 提取TO代转化C服1烟草DNA检测为阳性苗的总RNA，cDNA反转录。
[0105] 根据所述烟草化CHS1基因的编码序列（如SEQ ID NO. 2所示），选取与其它同源基 因特异的序列区段进行特异扩增引物的设计。本实施例中的上下游特异引物为：
[0106] CHS-qF:GAGTCCTTGTTGTTTGTTCAG；
[0107] (：服-91?:46144616644161446〔〇：;如沈9 10備.19、20所示。
[0108] 扩增出序列长度为25化P的产物(如SEQ ID NO.6所示）。
[0109] 利用巧光染料法进行相对巧光定量PCR反应，W烟草管家基因（NTU60495)为内参， 上下游引物为：
[0110] actin-qF:CAAGGAAATCACCGCTTTGG；
[0111] 曰。1111-91?:44666416〔646641664，如沈9 10備.21、22所示。
[0112] 采用SYBR's'Premix Ex Taq?(Perfect Real TimeKl'akaRa公司）的试剂盒W及操 作说明书进行，每个样品设S次重复。通过ABI 7500化3* Real-Time PCR System的 SDSShell.exe分析系统分析化CHS1基因的相对表达量(见图2、图3)。由图2可知，非转化烟 草的化C服1基因的表达水平低，而TO代转化CHS1烟草中，〇1-0、(：-2-0、(：-3-0、(：-5-0均过量 表达，尤其是C-3-0;由图3可知，与非转化烟草的化CHS1基因的表达水平相比，TO代化CHS1 沉默烟草中，C-1-R、C-2-R、C-5-R、C-6-R表达量均降低。
[0113] 本实施例将所述的植物表达载体转化根瘤农杆菌，获得用于转化烟草的含化CHS1 基因植物表达载体或抑制沉默掉化C服1基因的干扰载体的根瘤农杆菌菌株。利用所构建的 根瘤农杆菌菌株转化烟草，获得经PCR检测的转基因烟草植株。
[0114] 实施例8NtC服1基因在调节花色、株高方面的应用。
[0115] 将实施例7中得到的T1代化CHS1基因过表达株系和T1代化CHS1基因干扰株系播种 在溫室大棚中，W未转化目的基因的野生型烟草作为对照。待花完全开放时，观察统计花的 颜色。调查结果显示，与野生型对照的花色相比（如图4、图5)，过表达株系C-1-0、C-2-0、C- 3-0的花色均变为深红，而C-5-0花色变浅，几乎变为白色，其间有零星红色，运可能是 化CHS1基因过表达引起的反抑制现象引起的。干扰株系0-1-1?、(：-2-1?、(：-5-1?、(：-6-如勺花色 变为浅粉或是白色。与野生型对照的株高相比（如图6)，干扰株系的株高显著降低。
[0116] 实施例9NtC服1基因在调节烟草中绿原酸、芸香巧等类黄酬化合物含量的应用。
[0117] 对获得的转基因烟草中绿原酸和芸香巧含量进行高效液相色谱（High Performance Liquid化romatogra地y，HPLC)测定，筛选获得绿原酸和芸香巧显著提高或 降低的转基因烟草植株。
[0118] 所述通过高效液相色谱化PLC)测定烟草中绿原酸和芸香巧含量的方法，为常规方 法：首先参照【烟草绿原酸、芸香巧、烟碱和茄尼醇的提取技术研究[J].中国烟草科学， 2015-02,36(1) :1-4.李晓芹，杜咏梅，张怀宝等】中的提取技术将烟草中的绿原酸和芸香巧 提取出来，回收率达到90% ;然后利用高效液相色谱化学发光抑制检测法测定烟草中绿原 酸和芸香巧的含量【高效液相色谱化学发光抑制检测法测定烟草中的绿原酸和芸香巧[J]. 分析化学，1999，27(9): 1110-1110.贺彩霞，崔华，孙玉刚等】。
[0119] 结果如图7~图10所示。由图7、图9可知，过表达转基因烟草植株中，绿原酸和芸香 巧的含量均得到了不同程度的提高，其中，绿原酸的含量最高可达7.42mg/g，是非转基因烟 草(4.73mg/g)的1.55倍;芸香巧的含量最高可达5.42mg/g，是非转基因烟草(3.48mg/g)的 1.56倍。由图8、图10可知，干扰转基因烟草植株中，绿原酸和芸香巧的含量均得到了不同程 度的降低，其中，绿原酸的含量最低为1.19mg/g，是非转基因烟草(5.64mg/g)的21%;芸香 巧的含量最低为1.76mg/g，是非转基因烟草(4.76mg/g)的37%。
[0120] 上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围W内。
【主权项】
1. 烟草查尔酮合成酶NtCHSl基因，其特征在于:其启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.l 所示，其编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 权利要求1所述的烟草查尔酮合成酶NtCHSl基因在调控①烟草花色或/和②烟草株 高或/和③绿原酸和芸香苷的含量中的应用。3. -种含有NtCHSl基因的重组表达载体，其特征在于：其上装载有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的NtCHSl基因/NtCHSl基因的外显子，所用载体为用于根瘤农杆菌转化植株的 双元载体。4. 根据权利要求3所述的含有NtCHSl基因的重组表达载体，其特征在于:所述双元载体 选自pBI系列载体、pCHF系列载体、Gateway?系列载体或其他衍生植物表达载体。5. 权利要求3或4所述的含有NtCHSl基因的重组表达载体的构建方法，其特征在于:从 烟草中提取总RNA，进行cDNA反转录，然后利用特异性引物进行PCR扩增，得扩增产物;将扩 增产物与载体连接，即得到含有NtCHSl基因的重组表达载体； 所述特异性引物为： NtCHSl-F:ATCTAGAAACCCTAGTAATCGTCCATC； NtCHSl-R:TGAGCTCCCACTAAGTAGCAACACTGTG;如SEQ ID Ν0·7、8所示。6. 权利要求3或4所述的含有NtCHSl基因的重组表达载体在①调节烟草花色中的应用 或/和②在调节烟草植株中绿原酸、芸香苷的含量中的应用或/和③在制备绿原酸和芸香苷 中的应用。7. -种NtCHSl基因沉默载体，其特征在于:其上装载有序列如SEQ ID NO.4所示的干扰 片段，所用载体为用于根瘤农杆菌转化植株的干扰载体。8. 根据权利要求7所述的NtCHSl基因沉默载体，其特征在于:所述干扰载体选自pTCK系 列载体，Gateway TW系列载体或其他衍生植物表达载体。9. 根据权利要求7或8所述的NtCHSl基因沉默载体，其特征在于:所述干扰片段是通过 以下方法制备得到的：从烟草中提取总RNA，进行cDNA反转录，经两步PCR扩增，即获得干扰 片段;所述两步PCR时所用的特异性引物为Fi-chs/Ri-chs和attBl/attB2，其核苷酸序列如 下所示： Fi-chs：AAAAAGCAGGCTTCGTATCACTAATAGCGAGCAT； Ri-chs：AGAAAGCTGGGTCGGGCATGTCTACACCAC； attBl：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT； attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT;如SEQ ID Ν0·9、10、11、12所示。10. 权利要求7或8或9所述的NtCHSl基因沉默载体在①调节烟草花色中的应用或/和② 在调节烟草株高中的应用或/和③在调节烟草植株中绿原酸、芸香苷的含量中的应用。
【文档编号】C12N9/10GK106047905SQ201610236929
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年4月15日
【发明人】杨爱国, 陈帅, 冯全福, 李依婷, 潘旭浩, 张银超, 王元英
【申请人】中国农业科学院烟草研究所