一种显著增加水稻生殖期耐旱基因QDTY2.9^IR66897B及其分子标记方法

一种显著增加水稻生殖期耐旱基因QDTY 2.9^IR66897B及其分子标记方法
【专利摘要】一种显著增加水稻生殖期耐旱基因QDTY 2.9IR66897B及其分子标记方法，属于水稻高产抗逆育种和分子遗传学领域。利用吉粳88与3个供体衍生的育种选择群体，采用适用于育种选择群体的新型偏分离定位方法定位与耐旱相关的QTL；进而通过随机选择群体验证抗旱QTL的真实性以及与其紧密连锁标记的可靠性。将本发明应用于水稻耐旱的辅助选择育种和聚合育种，能够有效的弥补以往自然变异基因的不足，不但可以显著降低利用初定位结果开展辅助育种带来的负面影响，而且可以在苗期对低世代的育种群体进行基因型选择，获得耐旱个体，便于及时的杂交转育，省去成株期耐旱抗性鉴定的过程，提高育种效率，加快育种进程。
【专利说明】
-种显著増加水稻生殖期耐旱基因 QDTY 2.9iM6897B及其分子 标巧方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种显著增加水稻生殖期耐旱基因孤TY 2.9iK66897B及其分子标记方 法，该基因显著降低水稻在干旱胁迫下的产量损失，属于水稻高产抗逆育种和分子遗传学 领域，适用于在水稻高产抗逆育种中引入在生殖期耐旱基因 QDTY 2.9?6897b，并利用分子标 记对该基因进行辅助选择育种。
【背景技术】
[0002] 干旱是造成水稻产量损失，限制水稻种植分布的最重要非生物胁迫因素之一。当 前，干旱频繁发生，每年对世界稻米产量造成巨大损失。然而世界范围人口却在快速增长， 粮食需求缺口巨大，因此通过挖掘现有种质资源中的有利抗旱等位基因，通过分子辅助选 择手段培育耐旱新品种是非常迫切的重大科学问题。分子遗传学研究表明，水稻对干旱的 抗性是受多基因控制的数量性状。迄今已有大量干旱耐性相关的9化被定位，一些与干旱相 关的基因也被成功克隆。
[0003] 客观上，抗性相关基因的挖掘有助于我们了解水稻对干旱抗性的遗传基础，然而 绝大多数基因真正在育种实践中成功应用的事例仍十分有限。一个重要的限制因素是基础 科学研究和育种实践研究存在空隙，衔接不紧密。为了克服运一问题，我们发展了一套新的 定位策略，即采用选择育种群体进行耐旱数量基因挖掘。与传统遗传群体相比，选择育种群 体具有两个显著的优势；（1)群体中个体数量相对较小，表型和基因型鉴定可W节省大量成 本和资源；（2)经过人工选择，部分株系主要农艺表现已经与轮回亲本相似，但在产量上更 具优势，因此运些携带大量有利等位基因的株系可W直接被用作聚合育种的亲本，甚至可 直接选育成新品系。
[0004] 选择育种群体由3个家系构成，每个家系共用一个轮回亲本吉梗88。3个家系(P1到 P4)的父本分别是IR66897B，MR77和MR167。运3个父本是来自东南亚的地方品种，均具有一 定的耐旱性。利用适合于选择育种群体的偏分离定位方法，我们成功实现了耐旱WL的定位 研究。结果表明，位于第2染色体末端192.2cm的位置存在一个与耐旱相关的一个基因位点 QDTY2.9。该9化在P1和P3群体中均被定位到。进一步，我们采用传统的随机群体开展了上述 Q化的验证工作。该验证群体是从3个家系中每个随机选择60个株系，共计180个株系组成。 验证结果表明，QDTY 2.9?6897b是真实存在的抗旱基因，其与分子标记RM266紧密连锁，且耐 旱有利等位基因来自耐旱亲本IR66897B和MR167。通过与已报道的抗旱WL和基因物理位置 相比较，发现QDTY 2.9iK66897B与已克隆的耐旱相关基因〇sPIPl-3(RWC3)相邻，推测QDTY 2. giKssswB可能是OsPiPi-3或其等位基因。但OsPIPl-3是利用反向遗传学手段克隆的，尚没 有开发出可直接用于耐旱分子辅助选择育种的分子标记。本发明中孤TY 2.giKssswB的抗性 等位基因来自东南亚品种IR66897B和MR167,可为耐旱育种提供了新的可利用种质，有利于 扩大我国品种或种质的遗传多样性。

【发明内容】

[0005] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一个水稻生殖期耐旱基因孤TY 2.glKSSSWB及其分子标记方法。本发明利用适合于选择育种群体的偏分离定位方法，在水稻 第2染色体末端192.2cm的位置定位到一个与耐旱相关的一个基因位点孤TY2.9。其耐旱有 利等位基因来自耐旱亲本IR66897B，与分子标记RM266紧密连锁。基于PCR的实用经济型标 记RM266,利用其可有效地开展水稻生殖期耐旱分子辅助选择育种研究。
[0006] 本发明的技术方案如下：水稻生殖期耐旱基因孤TY 2.giKssswB，在水稻基因组第2 染色体末端192.2cm的位置存在一个与耐旱相关的一个基因位点QDTY2.9,来自东南亚的两 个耐旱种质IR66897B和MR167在该位点上的等位基因能够显著增加水稻在生殖期的耐旱 性。
[0007] QDTY 2. giKssswB的分子标记方法，其特征在于：用一对特异的PCR引物对RM266，其 中正向引物序列为：TAGTTTAACCAAGACTCTC，反向引物序列为:GGTTGAACCCAAATCTGCA，共同 扩增带有品种IR66897B血缘的育种材料基因组DNA，如果引物RM266能够通过PCR扩增出与 IR66897B类似的117bp左右大小的片段，那么推测该育种材料很可能含有孤TY 2. giKssswB的 耐旱等位基因。
[000引通过本发明鉴定到第2染色体上的生殖期耐旱基因 （QDTY 2.9?6897b)W及可对其 进行利用的分子方法。本发明与现有技术相比具有W下优点及效果：
[0009] 1.基于反向遗传学手段，位于孤TY 2.9?6897b上游邻近位置有一个耐旱相关基因 OsPIPl-3被克隆，推测QDTY S.giKssswB可能是OsPIPl-3或其等位基因。利用正向遗传学手 段，本发明获得了与孤TY 2. giKssswB紧密连锁的常规分子标记RM266，通过紧密连锁分子标 记的筛选，能够便于获得生殖期耐旱性增强的育种材料。
[0010] 2.QDTY 2.9?6897b的耐旱有利等位基因来自国际水稻所的优质耐旱种质IR66897B 和马来西亚地方品种MR167,与OsPIPl-3的供体品种不同，为耐旱育种提供了新的可利用种 质，有利于扩大我国品种或种质的遗传多样性。
[0011] 3.本发明的分子标记可用于苗期育种群体的基因型选择，有效地鉴别带有该基因 的耐旱型个体，便于及时的杂交转育，加快育种进程。
【附图说明】
[0012] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W 根据运些附图获得其他的附图。
[OOK]图1是P1群体亲本和随机单株在RM266位点的电泳图。（M、Pi和P2分另懐示marker， 吉梗88,和IR66897B; 1-10表示从P1群体随机选择的10个单株）。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明进行进一步说明。
[001引实施例1
[0016]( - )耐旱〇化的定位
[0017] 1.供试材料
[0018] 首先W筛选自种质资源库的3个东南亚地方品种IR66897B(P1群体父本），MR77(P2 群体父本)和MR167(P3群体父本)分别与中国高产优质不耐旱梗稻吉梗88构建3个高代回交 导入系群体。经过两轮生殖期干旱胁迫选择后，筛选出3个家系中的72个耐旱株系构成选择 育种群体(表1)。
[0019] 表1.3个选择育种群体构成信息 [00201
[0021] 化是未经干旱胁迫的原始BC2F2群体大小;化是经过第一轮干旱胁迫处理后选择出 的耐旱株系数;化是经过2轮干旱胁迫处理后筛选出的耐旱株系数；.
[0022] 2.基因型鉴定
[0023] 参考Temny化等(2000年）的DNA提取方法，对各单株分别提取基因组DNA。^供体亲 本和轮回亲本吉梗88间有多态的SSR引物分别对不同家系衍生的后代的基因型进行鉴定。3 个家系的多态性引物数分别为181、201和197个。
[0024] 3.耐旱评估
[0025] 耐旱鉴定试验在中国农业科学院北京昌平实验基地和宁夏农林科学院实验基地 完成。每个试验地点均包括对照组和处理组两个部分。对照组在整个生育期均采取正常灌 水管理，处理组则在幼穗萌发阶段则开始采取干旱处理直到种子完全成熟。对照和处理均 采用3重复的完全随机区组试验。W单株产量作为评估指标。
[0026] 4.偏分离分析(Q化定位）
[0027] 由于72个株系由不同3个不同家系组成，不同家系间多态性标记存在差异，因此我 们首先按照化i等(2015)的方法发展了一个一致性的遗传连锁图谱。进而采用Cui等(2015) 提供的偏分离定位方法开展耐旱WL的定位。WWald值为16.97作为判断WL存在与否的标 准。
[0028] 生殖期耐旱WL鉴定。3个家系共计定位到7个耐旱性QTL。其中位于第2染色体2染 色体末端192.2cM的位置上的QDTY2.9被P1和P2两个群体均定位到，来自东南亚的两个耐旱 种质IR66897B和MR167在该位点上的等位基因能够显著增加水稻在生殖期的耐旱性。
[0029] 表2耐旱9化901￥2.9的定位
[0030]
[0031] 当Wald值= 20.35时P值= 0.01;当Wald值= 16.97时P值= 0.05;
[0032] (二）9〇1￥2.9的验证
[0033] 1.供试材料
[0034] 从原始未经过胁迫处理和人工选择的3个高代回交群体(每个群体800个株系）中 分别随机选择60个单株组3个随机验证群体。
[0035] 2.基因型鉴定
[0036] 使用常规的CTAB法提取水稻单株的基因组DNA。^供体亲本和轮回亲本吉梗88间 有多态的SSR引物分别对不同家系衍生的后代的基因型进行鉴定。采用20山体系的常规PCR 操作流程扩增不同单株的模板DNA，W聚丙締凝胶电泳进行PCR产物的分离。
[0037] 3.耐旱表型评估
[0038] 耐旱鉴定试验在中国农业科学院北京昌平试验基地和宁夏农科院实验基地进行。 每个试验地点试验均包括对照组和处理组两部分。对照组整个生育期均采取正常田间管 理，而处理组在幼穗萌发阶段即开始干旱处理直到种子完全成熟。对照和处理均采用3重复 的完全随机区组试验。W单株产量作为评价指标。
[0039] 3.单标记分析
[0040] 根据不同株系的RM266标记扩增条带所表示的基因型，将每个家系的60个株系分 成两组，一组是带有吉梗88纯合基因型的个体;另一组是带有供体纯合基因型的个体。单标 记分析结果表明，QDTY 2.9在P1和P3群体中再次被定位到，干旱胁迫下两地点的平均单株 增产量达到23.5%，是一个主效的抗旱QTL，且抗性有利等位基因均来自供体亲本。运表明 QDTY 2. giKssswB是一个真实存在的耐旱QTL，同时也表明RM226确实和QDTY 2.9紧密连锁，可 直接应用于抗旱分子辅助选择育种。
[0041 ] 表3. QDTY 2. giKssswB及其连锁标记RM266的验证
[0042]
[0043] 皿Y，纯合供体基因型植株的平均单株产量;HRY，纯合受体基因型植株的平均单株 产量;RPY，轮回亲本吉梗88的平均单株产量;A，加性效应。
[0044] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在 不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够W其他的具体形式实现本发明。因此，无论 从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。本发明的范围由所附权 利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所设及的权利要求。
【主权项】
1. 一种显著增加水稻生殖期耐旱基因 QDTY2.9IR66897B，其特征在于:在水稻基因组第2染 色体末端192.2cM的位置存在一个与耐旱相关的一个基因位点QDTY2.9,来自东南亚的两个 耐旱种质IR66897B和MR77在该位点上的等位基因能够显著增加水稻在生殖期的耐旱性。2. 如权利要求1所述的耐旱基因 QDTY2.9__的分子标记方法，其特征在于：用一对特 异的PCR引物对RM266，其中正向引物序列为：TAGTTTAACCAAGACTCTC，反向引物序列为： GGTTGAACCCAAATCTGCA，共同扩增带有品种IR66897B和MR167血缘的育种材料基因组DNA，如 果引物RM266能够通过PCR扩增出与IR66897B和MR167类似的117bp左右大小的片段，那么推 测该育种材料很可能含有QDTY2.9 IR66897B的耐旱等位基因。3. 根据权利要求1、2所述的耐旱基因在水稻育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106047891SQ201610482535
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】徐建龙, 黎志康, 朱亚军, 陈凯, 孟丽君, 崔彦茹
【申请人】中国农业科学院深圳农业基因组研究所, 中国农业科学院深圳生物育种创新研究院