一种用于抑制靶基因mRNA表达的寡核酸分子及其成套组合物的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种用于抑制靶基因mRNA表达的寡核酸分子及其成套组合物。本发明提供了siRNA，由19?27个核苷酸组成的正义链和与其反向互补的反义链组成；所述正义链中从5’末端起5?9个连续核苷酸和从3’末端起5?9个连续核苷酸均为2＇－核糖修饰核苷酸。本发明中siRNA分子混合物可以影响至少50％、55％、60％、65％、70％,75％、80％、85％、90％的细胞中靶基因的表达，抑制率至少为45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。
【专利说明】
-种用于抑制卽基因 mRNA表达的真核酸分子及其成套组合物
技术领域
[0001] 本发明设及分子生物学领域，尤其设及一种用于抑制祀基因 mRNA表达的寡核酸分 子及其成套组合物。
【背景技术】
[0002] 自An化ew Fire和Craig Mello等人 1998年在线虫（Caenorhabditis elegans)中 首次发现RNAi现象，Tuschl和化il Sha巧等人2001年证实在哺乳动物中也存在RNAi之后， 关于RNAi的机制原理、基因功能和临床应用等研究取得了一系列的进展。RNAi不仅在防御 病毒感染，防转座子跳跃等多种机体保护机制中发挥关键作用化untvagner et al，2001; l\ischl，2001;Waterhouse et al,2001;Zamore 2001)，其相关产品也是十分有前景的候选 药物。
[0003] E化ashir等人在2001年发现siRNA抑制哺乳动物细胞中特异基因的沉默，研究表 明siRNA可特异的同序列互补的祀mRNA结合，并使其降解。长片段的双链RNA被Dicer酶切割 成21-23个碱基长度短片段RNA，其中两条链中同祀mRNA结合的链称为反义链或引导链，另 一条链称为正义链或过客链。研究发现体外化学合成的SiRNA进入细胞后也同样发挥RNAi 作用，而且有效降低了长链RNA引起的免疫反应。
[0004] 但由于SiRNA的有效性受序列特异性，祀细胞特异性、祀点等多种因素影响，基于 现有设计原则获得的SiRNA并不是每个都能达到有效的沉默效果；一般设计的SiRNA约有 50% W上具有沉默祀mRNA的效果，仅25%的SiRNA具有75% W上的沉默效果，因此后续对设 计合成的SiRNA还需要实验验证、筛选或优化，费时耗力；基于此，一种通用、高效、快速的 RNAi技术与产品亟待开发。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种抑制或降低祀基因表达的SiRNA。
[0006] 本发明提供的SiRNA,由正义链和与其反向互补(完全反向互补）的反义链组成；
[0007] 所述正义链由19-27个核巧酸组成，且所述正义链从5 '末端起5-9个连续核巧酸和 从3 '末端起5-9个连续核巧酸均进行2 > -0-核糖修饰。
[000引所述反义链与所述祀基因上的区段反向互补。
[0009] siRNA通过其反义链与祀基因上的祀序列反向互补结合；
[0010] 在发明的一些实施例中，SiRNA分子中至少包括一个非天然的核巧酸，如经化学修 饰的核巧酸，优选在正义链或正义区的化学修饰。在一些实施例中，核糖的2^-0-核糖修饰 具体为2 > -0-甲基修饰，2 > -0-氣代修饰，2 > -M0E修饰。本发明的正义链修饰可起到：（1)增强 SiRNA分子稳定性；（2)减少SiRNA分子脱祀性；（3)提高SiRNA分子特异性；（4)减少免疫激活 反应等作用。
[0011] 上述SiRNA中，所述正义链由24、25或26个核巧酸组成；
[0012] 或，所述正义链从5 '末端起6或7或8个连续核巧酸和从3 '末端起6或7或8个连续核 巧酸均进行2 f-0-核糖修饰。
[001引上述siRNA中，所述2'-0-核糖修饰为2'-0-甲基（2'-0-Me)修饰、2'-0-氣代修饰、 或2^M0E修饰。
[0014]本发明另一个目的是提供一种抑制或降低祀基因表达的成套siRNA。
[001引本发明提供的成套S iRNA，包括至少5个上述的S iRNA。
[0016] 每个siRNA对应同一祀基因的不同祀序列。
[0017] 上述成套siRNA中，所述成套siRNA由5、6、7、8、9或10个siRNA组成。
[001引上述成套siRNA中，所述成套siRNA中单个siRNA分子的的物质的量可W是随机的， 任2个SiRNA的物质的量比为1:1-1:5;优选单个SiRNA分子的的物质的量相等1:1。
[0019] 本发明另一个目的是提供另一种如下1)或2)物质。
[0020] 本发明提供的1)或2)物质：
[0021] 1)抑制或降低祀基因表达的试剂，其为如下A或B:
[0022] A包括权利要求1-3任一所述的SiRNA和转染试剂；
[0023] B包括权利要求4或5所述的成套SiRNA和转染试剂；
[0024] 2)抑制或降低祀基因表达的试剂盒，其包括上述SiRNA或上述的成套SiRNA或所述 试剂。
[0025] 上述物质中，所述成套SiRNA中所有SiRNA分子在所述试剂中的总浓度为2-lOOnM; 每个SiRNA分子在所述试剂中的浓度均为10-20nM;
[00%] 上述SiRNA或上述的成套SiRNA或上述的物质在抑制或降低祀基因表达中的应用 也是本发明保护的范围；
[0027] 或上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在抑制或降低细胞中祀基因表达 中的应用也是本发明保护的范围；
[00%]或上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在制备抑制或降低祀基因表达产 品中的应用也是本发明保护的范围；
[0029] 或上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在制备抑制或降低细胞中祀基因 表达中产品的应用也是本发明保护的范围；
[0030] 或上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质在制备预防或缓解或治疗由革己基 因表达引起的疾病中的产品中的应用也是本发明保护的范围。
[0031] 本发明提供的方法，包括如下步骤:将抑制或降低祀基因表达的SiRNA的正义链从 5 '末端起5-9个连续核巧酸和从3 '末端起5-9个连续核巧酸均进行2 > -0-核糖修饰；
[0032] 所述SiRNA由正义链和与其反向互补的反义链组成；
[0033] 所述正义链由19-27个核巧酸组成；
[0034] 所述反义链与所述祀基因上的区段反向互补。
[00巧]或所述2 > -0-核糖修饰具体为2 > -0-甲基修饰、2 > -0-氣代修饰、或2 > -M0E修饰。
[0036] 本发明第四个目的是提供一种产品。
[0037] 本发明提供的产品，包括上述siRNA或上述的成套siRNA或上述的物质；
[0038] 和/或，所述产品具有如下1)-3)中至少一种功能：
[0039] 1)抑制或降低祀基因表达；
[0040] 2)抑制或降低细胞中祀基因表达；
[0041] 3)预防或缓解或治疗由祀基因表达引起的疾病。
[0042] 上述中，所述祀基因为肿瘤、癌症、屯、血管疾病、炎症、传染病或罕见病相关基因；
[0043] 或，所述肿瘤、癌症、屯、血管疾病、炎症、传染病或罕见病相关基因具体为P65、 S0D1、TP53、HIF1A、BIRC5、CTNNB1、PLK1、ERBB3、C0PS5、WEE1、EIF4E、STAT3、CDH16、VEGFA、 KRAS、MYC和/或CTGF;
[0044] 所述细胞具体为脊椎动物细胞、哺乳类动物细胞、灵长类动物细胞、人类细胞；
[0045] 或，祀基因异常表达的（表达水平高于正常受试者)或有基因缺陷的（如染色体异 常或基因突变)的癌细胞、肿瘤细胞、炎性细胞、血液细胞、白细胞、脑细胞、肝细胞、肺细胞、 肾细胞、乳腺细胞、宫颈细胞、内皮细胞、神经细胞、神经胶质细胞；
[0046] 或，所述细胞具体为化La、293T、A549或HUVEC细胞；
[0047] 或，所述产品具体为药物。
[004引上述祀基因可W是肿瘤或癌症相关基因，优选RELA、S0D1、TP53、HIF1A、BIRC5、 押順81、口0(1、邸883、0)口55、肥61、61尸46、51413、(：畑16、邸45、]\^：、押6尸等基因。
[0049] 上述祀基因对应的siRNA如下：
[0050] 祀基因为P65,其对应的成套siRNA为1?8斗65-01、1^斗65-02、1^斗65-03、1^斗65- 04、1?8斗65-05、1^斗65-06、1^斗65-07中至少6个；
[0051 ]祀基因为 SOD 1，其对应的成套 S i RNA 为38-500-01、1^-500-02、1^-500-013、尺8- S0D-D4、RB-S0D-D5、RB-S0D-D6、RB-S0D-D7、RB-S0D-D8、RB-S0D-D9、RB-S0D-D10 中至少5个； [0052]祀基因为 TP53,其对应的成套 siRNA 为1?8-1?5-01、1^-1?5-02、1^-1?5-03、1^-1口5- D4、RB-TP5-D5、RB-TP5-D6、RB-TP5-D7 中至少6个；
[0053] 祀基因为HIF1A，其对应的成套siRNA为1?8寸^-01、1^寸^-02、1?8寸^-03、尺8- 阳尸-04、1?8寸1尸-05、1^寸1尸-06、1^寸1尸-07中至少6个；
[0054]祀基因为 BIRC5,其对应的成套 siRNA 为1?8-811?-01、1^-811?-02、1?8-811?-03、尺8- 61尺-04、1^-811?-05、1^-811?-06、1^-811?-07中至少6个；
[0055]祀基因为 CTONB1，其对应的成套 siRNA 为RB-CTN-D1、RB-CTN-D2、RB-CTN-D3、RB- CTN-D4、RB-CTN-D5、RB-CTN-D6、RB-CTN-D7 中至少6个；
[0056]祀基因为 ERBB3,其对应的成套 siRNA 为1?8-61^-01、1^-61?8-02、1?8-61^-03、尺8- ￡尺8-04、1?8-61^-05、1^-61^-06、1^-61^-07中至少6个；
[0057]祀基因为C0PS5，其对应的成套S iRNA为1?8-(：0?-01、1^-(：0?-02、1?8-(：0?-03、尺8- C0P-D4、RB-C0P-D5、RB-C0P-D6、RB-C0P-D7 中至少6个；
[005引 祀基因为肥E1，其对应的成套S iRNA为RB-肥E-D1、RB-肥E-D2、RB-肥E-D3、RB-TOE- D4、RB-WEE-D5、RB-WEE-D6、RB-WEE-D7 中至少6个；
[0059]祀基因为 EIF4E，其对应的成套 siRNA 为1?8-6^-01、1^-6^-02、1?8-6^-03、尺8- ￡1尸-04、1?8-61尸-05、1^-61尸-06、1^-61尸-07中至少6个；
[0060]祀基因为 STAT3,其对应的成套 siRNA 为1?8-514-01、1^-514-02、1?8-514-03、尺8- STA-D4、RB-STA-D5、RB-STA-D6、RB-STA-D7 中至少6个；
[0061 ] 祀基因为CDH16，其对应的成套S iRNA为1?8-〔0护01、1^-〔0护02、1?8-〔0护03、尺8- CDH-D4、RB-CDH-D5、RB-CDH-D6、RB-CDH-D7 中至少6个；
[0062]祀基因为 VEGFA，其对应的成套 S i RNA 为 RB-VEG-D1、RB-VEG-D2、RB-VEG-D3、RB- VEG-D4、RB-VEG-D5、RB-VEG-D6、RB-VEG-D7 中至少6个；
[0063] 祀基因为KRAS，其对应的成套S iRNA为1?8-邸4-01、1^-邸4-02、1^-邸4-03、1^-邸八- D4、RB-KRA-D5、RB-KRA-D6、RB-KRA-D7 中至少6个；
[0064] 祀基因为 MYC，其对应的成套 siRNA 为1?8-]\1￥(：-01、1^-]\1￥(：-02、1^-]\1￥(：-03、1^-]\1￥(：- D4、RB-MYC-D5、RB-MYC-D6、RB-MYC-D7、RB-MYC-D8、RB-MYC-D9、RB-MYC-D10 中至少5个；
[00化]祀基因为CTGF，其对应的成套S i RNA为1?8-押6-01、1^-押6-02、1^-別6-03、1^-押6- D4、RB-CTG-D5、RB-CTG-D6、RB-CTG-D7 中至少6个。
[0066] 本发明还包括一种降低细胞中祀基因表达的方法，所述方法包括使用上述的混合 物，方法包括a)获得siRNA分子或其混合物，所述siRNA分子混合物至少包括5，6，7，8，9，10 个S iRNA; b)将S iRNA分子混合物递送进细胞。
[0067] SiRNA分子混合物（成套SiRNA)中本发明是通过向细胞引入SiRNA分子或其混合 物，抑制祀基因的表达；引入可W为直接引入或间接引入，除使用转染试剂外，其他已知的 各种将SiRNA分子递送如细胞的方式都可采用，如注射、载体转染(载体可W是质粒或病 毒）、电穿孔，脂质体转染等。
[006引"互补"是指核碱基之间配对的能力。
[0069] 本发明中也可用碱基或碱基长度来表示核巧酸或RNA分子链的长度。
[0070] 本发明的SiRNA分子的耐受错配为至少1-5个核巧酸，其优选耐受位置在单链或双 链末端，耐受的碱基个数受互补区长度的影响。"错配"是指核碱基不能配对。
[0071] SiRNA分子混合物优选固相合成法获得，也可通过转录法或其他方法合成。
[0072] 本发明的试剂盒除SiRNA分子和/或SiRNA分子混合物外，还可包括缓冲液、标记物 (标记物可W是染料、放射性标记物质或巧光标记物质，标记的位置可W在反义链或正义链 末端），转染试剂，容器，试管，退火试剂，对照SiRNA(包括NC对照，N对照）等；试剂盒中的 SiRNA分子混合物可W按单个分装也可组合后放放置在一个容器中；试剂盒成分可W是冻 干粉或溶液。
[0073] 本发明的实验证明，单个的SiRNA分子稳定性好，一方面提升了体外或体内抑制试 验中对核酸酶的抗性;另一方面有利于储存和运输；同时降低了SiRNA分子的脱祀效应。成 套SiRNA更是一种通用、有效、快速的RNAi工具，其优势在于：（1)能确保60% W上的抑制率， 75% W上的SiRNA分子混合物能达到75% W上的抑制率，50% W上的SiRNA分子混合物能达 到85% W上的抑制率，相对于单个SiRNA分子，整体提高了沉默的机率与沉默的效率;在现 有技术中，一般设计的SiRNA仅有50%的概率能抑制祀基因表达，仅25%的SiRNA能达到 75% W上的抑制率。（2)不需特殊设计，后续不需对SiRNA进行筛选、优化，或对其效果进行 实验验证，省时省力。（3)解决了在不同细胞系中、不同转染试剂处理时，SiRNA作用不一致 的问题，可在多个细胞系中有效沉默祀基因，且不受转染试剂的影响。（4)增强了单个SiRNA 分子的基因沉默效果，起到了协同增效的作用。（5)降低了 SiRNA分子的脱祀效应。
[0074] 本发明中siRNA分子混合物可W影响至少50% ,55% ,60%，65%70% ,75% ,80%， 85%，90%的细胞中祀基因的表达，抑制率至少为45% ,55% ,60% ,65% ,70% ,75% ,80%， 85 %，90 %，95 %。本发明的SiRNA分子混合物在不同细胞系中、不同转染试剂处理时可W确 保至少60%的祀基因抑制效果。本发明的"抑制"或类似表达可指RNA或蛋白水平或相关生 化指标的表达、活性或指标相对阴性对照的降低。
【附图说明】
[0075] 图1为siRNA体外稳定性测定结果。
【具体实施方式】
[0076] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0077] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[007引实施例1、siRNA的制备
[0079] 设计的所有单个siRNA均能祀向祀基因的所有转录本,设计方法参照E化ashir et al.2002;Paddison et al.2002;Reynoldset al.2004;Ui-Tei et al.2004等人的方法 (Elbashir,S.M.,Harborth,J.,Weber,K.,and Tuschl,T.2002.Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs.Methods 26: 199"213;Paddison,P.J.,Caudy,A.A.,Bernstein,E.,Hannon,G.J.,and Conklin , D.S.2002. Short hairpin RNAs(shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells.Genes&Dev.16:948-958;Reynolds,A.,Leake,D.,Boese,Q.,Scaringe, S., Marshal 1,W.S. , and Khvorova, A .2004. Rational siRNA design for RNA interference .Nat. Biotechno1.22:326-330；Ui-Tei,K.,Naito,Y.,Takahashi,F., Haraguchi,T.,0hki-Hamazaki,H.,Juni,A.,Ueda,R.,and Saigo,K.2004.Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA inteWerence .Nucleic Acids Res . 32 : 936-948);为保证siRNA的特异性，使用化AST (Basic Local Alignment Search Too，http ://www.ncbi .nlm. gov))分析序列同一性 (identity)，选择与其他序列同一'性最小的序列。
[0080] SiRNA由25个核巧酸组成的SS正义链和与其反向互补的反义链AS组成，且为平末 端；
[0081 ]每个S iRNA通过其反义链与所述祀基因上的祀序列反向互补结合；
[0082] AS链和SS链完全反向互补，AS链与祀基因上的祀序列完全反向互补，SS的从5 '末 端起7个连续核巧酸和从3 '末端起7个连续核巧酸均经过2 > -0-Me修饰。
[0083] 祀基因如表1所示，祀基因对应的SiRNA具体序列如表2所示。
[0084] 表1为祀基因
[0091]
[0092] 上述表中，mA、恤、mC和mG分别为2'-0-Me修饰后A、2'-0-Me修饰后U、2'-0-Me修饰 后C和2'-0-Me修饰后G。
[0093] 实施例2、siRNA细胞水平抑制试验
[0094] 将实施例1制备的表2所示的1?53、81亂5、別順81、0)?55、51413、￥66。4、邸45祀基 因对应的siRNA分别单独转染化La细胞(来源于ATCC)，具体如下：
[00巧]ULF2K转染
[0096] 1〇〇化 LF2K转染体系：化山L LF2K(Invitrogen，11668019)，扣L siRNA(终浓度为 lOOnM)和9化L Opti-MEM细胞培养基（Thermo Fisher Scientific,31985070)。
[0097] 上述 siRNA 分别为实施例 1 制备的 TP53、BIRC5、CTNNB1、C0PS5、STAT3、VEGFA、KRAS 祀基因对应的siRNA。
[0098] 在细胞培养板上培养化La细胞，再向每个孔中加入上述1(K)化转染体系，转染4她， 得到转染不同祀基因对应SiRNA的细胞。
[0099] 2、RT-PCR检测抑制率
[0100] 转染4她后，收集转染不同祀基因对应SiRNA的细胞，Trizol法提取RNA，Reverse 化anscription mix反转录试剂盒用于反转录(广州市锐博生物科技有限公司，C10170)，得 到转染不同祀基因对应S i RNA的细胞的cDNA。W cDNA为模板，用表3所示的S i RNA对应的祀基 因的引物对进行RT-PCR扩增，W人的看家基因 actin作为内参基因（尸〇1'*曰'(1:5- TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3; Reverse: 5-ACATCTGC TGGAAGGTGGACA-3)，利用Real-time PCR试剂盒SYBR Premix(2X ) (BIO-RAD 750000131)进行实时巧光定量PCR反应。一个样品 的9个重复(每个单独的样品在转染时有3个重复，在qPC則寸每个重复做3个复孔)的Ct误差 在±0.5，然后用CFX 2.1进行相对定量分析。SPSS19.0数据统计软件数据分析，表中数据为 其平均值，P值均<0.05。
[0101 ] NC阴性对照组:转染的siRNA为无关非特异siRNA，
[0102] 5'UUCUCCGAACGUGUCACGU dTdT 3'
[0103] 5，ACGUGACACGUUCGGAGAA dTdT 3,；
[0104] N空白对照组:正常细胞，无 s iRNA转染。
[010日]Real-Time PCR抑制率计算方式：
[0106]
[0107] NC阴性对照组mRNA的相对表达水平为1。
[010引表3为引物序列 「ninon
L0110J 结果如表4所示，可W看出，针对7个禪基因，设计的SiRNA均起到了抑制禪基因表 达的作用。
[0111] 表4为化La细胞中单个SiRNA的抑制率比较
[0112]
[0113] 上述表中的D1-D7分别为针对每个祀基因的7个siRNA。
[0114] 实施例3、成套siRNA的制备 [011引1、设计原则
[0116] 成套siRNA由5-10个siRNA分子组成；
[0117] 每个SiRNA由25个核巧酸组成的SS正义链和与其反向互补的反义链AS组成，且为 平末端;每个SiRNA通过其反义链与祀基因上的祀序列互补结合；
[0118] AS链和SS链完全反向互补，AS链与祀基因上的祀序列完全反向互补，SS的从5'末 端起7个连续核巧酸和从3 '末端起7个连续核巧酸均经过2 > -0-Me修饰。
[0119] 祀基因如表1所示，祀基因对应的SiRNA如表2所示。
[0120] 祀基因的成套SiRNA可W包括5、6、7或10个SiRNA,分组情况如表5所示。
[0121] 表5祀基因的成套SiRNA组成
[0122]
[0125]
[0126] 分别将上述成套siRNA组RM-2(7个siRNA混合）、RM-3(6个siRNA混合）、RM-1(5个 siRNA混合）、RM-6(10个siRNA混合）中的每个siRNA按照表5所示的分组要求混合，且各个 SiRNA为等摩尔比混合。
[0127] 实施例4、成套SiRNA抑制祀基因表达的研究
[012引下面的实施例用表5中的成套SiRNA组RM-2(7个SiRNA混合)为例进行实验：
[0129] 一、成套SiRNA组RM-2与单个SiRNA分子对化La细胞中祀基因抑制率比较
[0130] 将实施例3中表5所示的1口53、81亂5、巧'順61、0^55、化1]、51413、￥66。4、邸48运7个 祀基因对应的成套S iRNA组RM-2分别转染化La细胞，方法与实施例2相同，其中，RM-2混合物 中所有S iRNA分子的总浓度为1 OOnM，且每个S iRNA分子为等的物质的量混合。
[0131] W转染单个SiRNA分子为对照，其中，单个SiRNA分子的浓度为lOOnM。
[0132] 成套SiRNA组RM-2抑制率和单个SiRNA抑制率结果如表6所示，可W看出，针对7个 祀基因，成套SiRNA组RM-2抑制效果均大于90% ;且成套SiRNA组RM-2与其相同浓度的7个单 个SiRNA分子相比，起到了协同增效的作用。
[0133] 表6 HeLa细胞中RM-2与单个siRNA的比较 r〇134l
[0135] 上述表中的D1-D7分别为每个祀基因对应的7个siRNA，RM-2为每个祀基因对应的7 个siRNA的混合样品。
[0136] 二、不同细胞系中成套SiRNA RM-2的抑制效果比较
[0137] 将实施例 3 中表 5 所示的 P65、S0D1、TP53、HIF1A、BIRC5、C?NB1、ERBB3、C0PS5、 肥61、6^46、51413、〔0化6、￥66。4、邸45、]\^：、押6。运16个祀基因对应的成套311?酷组觀-2分 别转染4种不同的细胞系（人胚肾细胞293T，宫颈癌细胞化La,非小细胞肺癌细胞A549与人 厮静脉内皮细胞HUVEC(均来源于ATCC)接种培养24h后观察细胞，状态良好开始转染。
[013引 1、转染
[0139] (1)50化riboFECT转染体系，5化riboFECT? CP Reagent(广州市锐博生物科技 有限公司，C10511-05)，5化实施例3制备的成套SiRNA组RM-2(所有SiRNA的总浓度为lOOnM) 和40化ribo阳CT? CP Buffer(广州市锐博生物科技有限公司，C10511-05)。
[0140] (2)100化 LF2K转染体系：1化 LF2K(Invitrogen，11668019)，5化实施例3制备的 成套siRNA组RM-2(所有siRNA的总终浓度为lOOnM)和94化Opti-MEM细胞培养基（Thermo Fisher Scientific,31985070)。
[0141] 将4种不同的细胞系培养板的每个孔中分别加入上述50化riboFECT转染体系或 100化LF2K转染体系，转染4她后收集细胞，Trizol法提取RNA，Reverse Transcription mix反转录试剂盒用于反转录(广州市锐博生物科技有限公司，C10170)得到cDNA。
[0142] 2、RT-PCR检测抑制率
[0143] 方法与实施例2相同。
[0144] 结果如表7所示，相对NC对照，针对不同的祀基因，在不同的细胞系中，使用不同的 转染试剂，RM-2混合物均能达到60% W上的抑制效果。
[0145] 表7不同细胞系中RM-2的抑制率比较（％ )
[0146]
[0147]
[0148] S、化La细胞中RM-2混合物与通常结构的siRNA分子的混合物抑制结果比较
[0149] 选取S0DUEIF4E两个祀基因，比较其对应的RM-2混合物与通常结构的siRNA分子 的混合物在化La细胞中抑制效果。
[0150] 上述各基因的通常结构siRNA的核巧酸序列与实施例3制备的各基因对应的RM-2 不同的是通常结构siRNA中每个核巧酸均没有y-0-Me修饰，长度为19bp(分别去掉正义链 5 '端的6个核巧酸和反义链3 '端的6个核巧酸），末端有2个dTdT悬垂，其余均相同。
[0151] 方法与上述一相同，不同的是将实施例3制备的S0DUEIF4E对应的成套siRNA组 RM-2转染HeLa细胞(M)。
[0152] W转染S0DUEIF4E对应的通常结构的siRNA分子的混合物为对照(S)。转染试剂为 LF2K。
[0153] 上述转染中，siRNA的总浓度为lOOnM。
[0154] 结果如表8所示，针2个祀基因，RM-2结构的混合物的抑制效果优于通常结构的 siRNA分子的混合物。
[01巧]表8化La细胞中RM-2修饰结果比较
[0156]
[0157] 四、不同组的成套SiRNA转染化La细胞的抑制效果比较
[015引选取SODUMYC运2个祀基因，比较不同成套siRNA组在化La细胞中抑制效果。
[0159] 方法与上述一相同，不同的是将实施例3制备的S0DUMYC对应的成套siRNA组RM- 2、RM-3和RM-6分别转染HeLa细胞。转染试剂为LF2K。
[0160] 结果如表9所示，
[0161 ] 表9不同siRNA条数混合而成的siRNAs混合物
[0162]
[0163] 结果表明，混合物RM-1，觀-3，觀-2，觀-6均能起到高效抑制多种基因的作用。
[0164] 实施例5、体外稳定性测定
[01化]将各siRNA RB-KRA-D1、RB-TP5-D6、RB-EIF-D3经无 RNA酶水稀释至扣M后加入等体 积的新鲜大鼠血清(为上海远慕生物科技有限公司产品），然后在37°C解育6小时后取样进 行电泳观察不同S iRNA的完整性。
[0166] 结果如图1所示，看出，SiRNA在血清中稳定，预计其在体内具有更好的效力。
[0167] 其它SiRNA的稳定性测定实验结果相同，具体图省略。
【主权项】
1. 一种抑制或降低靶基因表达的siRNA，由正义链和与其反向互补的反义链组成； 所述正义链由19-27个核苷酸组成，且所述正义链从5 '末端起5-9个连续核苷酸和从3 ' 末端起5-9个连续核苷酸均进行2' -0-核糖修饰； 所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补。2. 根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于： 所述正义链由24、25或26个核苷酸组成； 或，所述正义链从5 '末端起6或7或8个连续核苷酸和从3 '末端起6或7或8个连续核苷酸 均进行W-0-核糖修饰。3. 根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于： 所述2' -0-核糖修饰为2' -0-甲基修饰、2' -0-氟代修饰、或2' -Μ0Ε修饰。4. 一种抑制或降低靶基因表达的成套siRNA，包括至少5个权利要求1-3中任一所述的 siRNA〇5. 根据权利要求4所述的成套siRNA，其特征在于:所述成套siRNA由5、6、7、8、9或10个 siRNA组成； 或，所述成套siRNA中任2个siRNA物质的量比为1:1-1:5; 或，所述成套siRNA中各siRNA为等物质的量混合。6. 如下1)或2)物质： 1) 抑制或降低靶基因表达的试剂，其为如下A或B: A包括权利要求1 -3任一所述的s i RNA和转染试剂； B包括权利要求4或5所述的成套siRNA和转染试剂； 2) 抑制或降低靶基因表达的试剂盒，其包括权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求 4或5所述的成套si RNA或所述试剂。7. 根据权利要求6所述的物质，其特征在于:所述成套siRNA中所有siRNA分子在所述试 剂中的总浓度为2-100nM。8. 权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或权利要求6或7所 述的物质在抑制或降低靶基因表达中的应用； 或权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或权利要求6或7所 述的物质在抑制或降低细胞中靶基因表达中的应用； 或权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或权利要求6或7所 述的物质在制备抑制或降低靶基因表达产品中的应用； 或权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或权利要求6或7所 述的物质在制备抑制或降低细胞中靶基因表达中产品的应用； 或权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或权利要求6或7所 述的物质在制备预防或缓解或治疗由靶基因表达引起的疾病中的产品中的应用。9. 一种抑制或降低靶基因表达的方法，包括如下步骤：将抑制或降低靶基因表达的 siRNA的正义链从5 '末端起5-9个连续核苷酸和从3 '末端起5-9个连续核苷酸均进行2'-0-核糖修饰； 所述siRNA由正义链和与其反向互补的反义链组成； 所述正义链由19-27个核苷酸组成； 所述反义链与所述靶基因上的区段反向互补； 或所述2'-0-核糖修饰具体为2'-0-甲基修饰、2'-0-氟代修饰、或2'-MOE修饰； 或，一种产品，包括权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或 权利要求6或7所述的物质； 和/或，所述产品具有如下1 )_3)中至少一种功能： 1) 抑制或降低靶基因表达； 2) 抑制或降低细胞中靶基因表达； 3) 预防或缓解或治疗由靶基因表达引起的疾病。10.根据权利要求1-3任一所述的siRNA或权利要求4或5所述的成套siRNA或权利要求6 或7所述的物质或权利要求8所述的应用或权利要求9所述方法或产品，其特征在于： 所述靶基因为肿瘤、癌症、心血管疾病、炎症、传染病或罕见病相关基因； 或，所述肿瘤、癌症、心血管疾病、炎症、传染病或罕见病相关基因具体为P65、S0D1、 TP53、HIF1A、BIRC5、CTNNB1、PLK1、ERBB3J0PS5、WEE1、EIF4E、STAT3、CDH16、VEGFA、KRAS、 MYC和/或 CTGF; 所述细胞具体为细胞为脊椎动物细胞、哺乳类动物细胞、灵长类动物细胞、人类细胞； 或，靶基因异常表达或有基因缺陷的癌细胞、肿瘤细胞、炎性细胞、血液细胞、白细胞、 脑细胞、肝细胞、肺细胞、肾细胞、乳腺细胞、宫颈细胞、内皮细胞、神经细胞或神经胶质细 胞； 或，所述细胞具体为HeLa、293T、A549或HUVEC细胞； 或，所述产品具体为药物。
【文档编号】A61P29/00GK106047879SQ201610687850
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月18日
【发明人】张必良, 杨秀群, 丹米其·萨玛斯基, 克雷格·梅洛
【申请人】广州市锐博生物科技有限公司