一种基于反向遗传技术将ibv h120株重组表达ndv hn基因的二联疫苗株的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了以构建的禽传染性支气管炎病毒H120反向遗传系统为基础，将禽新城疫病毒HN基因替换H120毒株5a基因（图1），获得R?H120?Lasota（HN）二联疫苗拯救毒株，该重组疫苗株能同时对IBV 标准攻毒毒株和新城疫标准攻毒毒株具有良好的保护作用，可用于预防禽传染性支气管炎病毒和禽新城疫病毒。
【专利说明】
一种基于反向遗传技术将IBV H120株重组表达NDV HN基因的二联疫苗株
技术领域
[0001 ]本发明涉及动物医药生物工程领域，是一种禽传染性支气管炎病毒H120重组表达禽新城疫病毒Lasota毒株HN基因疫苗。
【背景技术】
[0002]禽传染性支气管炎病毒(IBV)引起的禽传染性支气管炎(IB)，是危害养禽业的重大传染病之一，以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋下降30-50%、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征。在我国该病发病率100%，死亡率10-30%，国内每年造成的经济损失超过十亿元。毒载体是利用重组DNA技术将外源基因插入经过改造的病毒基因组内部，而后感染细胞，使外源基因在细胞内有效表达。病毒载体作为一种常用于分子生物学的工具多用于疫苗研究等方向。反向遗传技术的成熟，催生出了许多RNA病毒载体，Zhao H等分别在NDV强毒株、弱毒株的4个不同基因间插入外源基因，发现病毒的复制效率和滴度并没有受到明显的影响，证实NDV作为疫苗载体是完全可行的。2001通过反向遗传在新城疫病毒中重组表达禽流感血凝蛋白，发现所构建的重组的拯救病毒可以诱导对禽流感病毒强烈的体液抗体免疫反应对小鼠致死剂量禽流感病毒具有完全保护作用。Huang Z H等先后用重组NDVLasota株表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白，对NDV强毒株和传染性法氏囊病毒超强毒株的攻击均能起到相当良好的保护。2007年Joshua M和PANS利用新城疫病毒做为载体表达SARS病毒S基因所构建的疫苗在对实验动物进行双倍剂量的SARS病毒接种，发现在病毒在肺部复制顶峰时期的含量要远远低于对照。2008年Man-Seong Park应用ND病毒载体表达禽流感H5、H9血凝素基因构建为疫苗，发现不仅对新城疫具有致死性剂量的保护作用，同时对禽流感病毒同时具有良好的保护作用。2007哈兽研Ge等通过反向遗传手段将AIV H5N1 HA基因插入到NDV Lasota中，形成二联苗能够对同源或者异源的新城疫病毒、高致病性禽流感具有完全的免疫保护作用。
【发明内容】
[0003]本发明根据本实验室成功构建的禽传染性支气管炎病毒H120反向遗传系统为基础，将禽新城疫病毒HN基因替换H120毒株5a基因，获得R-H120-Lasota(HN)拯救毒株。
【附图说明】
[0004]图1:H120重组表达NDV HN基因构建策略图。
【具体实施方式】
[0005]1、本发明所用禽传染性支气管炎病毒H120毒株反向遗传系统为四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室构建。使用的传代细胞BHK21为四川大学动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室保存。PCR高保真酶，限制性内切酶BsaI，BsmB I,Neil, T4连接酶为购自NEB公司，PCR高保真酶，pMD-lOT购自大连宝生物有限公司胶回收试剂盒购自TIANGEN有限责任公司，引物设计和序列测定为英潍捷基公司完成。
[0006]2、设计引物:设计引物扩增所改造的禽新城疫病毒HN基因，用以替换禽传染性支气管炎病毒Hl20毒株反向遗传系统中5a基因，构建策略见图1。
[0007]3,RNA提取:使用Trizol法提取其Lasota毒株全基因组RNA，其过程为:取200 yL禽传染性支气管炎病毒液加750 yL TRIzol ? Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA);混匀，15-30°C放置5 min，加200 yL氯仿，剧烈振荡15 S，室温放置3 min，4°C 12000 rpm离心10 min，取上层水相，转入新的离心管中，缓慢加入I倍体积70%异丙醇，混匀，放置10-20min,40C 12000 rpm离心30 S，弃废液;4°C 12000 rpm离心2 min，去除残余液体。加入30yLRNase-free水，室温放置2 min,4°C 12000 rpm离心2 min，收集离心后上清液，取5 yL于1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳。其它于-70 °C保存备用。cDNA的合成，使用宝生物反转录试剂盒primeScripts，按照试剂盒说明进行，其反应体系Buffer 2 yL，oligdT 0.5 yL,radome 0.5 yL，RNA模板，37摄氏度15 min,85°C 5 S。禽新城疫病毒HN基因PCR获取，以cDNA为模板，加入KOD plus polymerase (Toyobo, Japan)。聚合酶、上下游引物、dNTP进行扩增反应。PCR的反应体系为:10Xbuffer 5yL，4XdNTP mix(2.5 mmol/L)4 yL，上、下游引物(20 μπιοΙ/L)各2 yL,Mgcl2 3 yL，cDNA 2 yL，ddH20 31.75 yL，0.25 yL。反应参数为:94°C 5 min，25个循环，94°C 30 s，60°C，30 s，72°C 2 min 最后 72°C 10 miruPCR产物在1.0%琼脂糖凝胶电泳观察，扩增条带大小与预期的结果一致。
[0008]PCR产物纯化，琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，通过使用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得纯化的禽新城疫病毒HN基因PCR片段。
[0009]PCR片段的克隆，将纯化的禽新城疫病毒HN PCR片段与pMD-19T连接反应如下，PCR产物4.5 yL，pMD-19T载体0.5yL solut1n〗5 yL，混匀，16°C过夜，将连接产物转化DH5a感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养16 h后，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑取单个菌落，接种5 mL液体培养基中，37 °C，进行培养，然后挑阳性菌液2_3个送上海生工进行测序，若比对分析结果序列与GenBank中一致，表明克隆成功。碱裂解法抽提质粒DNA，将所鉴定阳性克隆子大量培养，碱裂解法提取质粒。
[0010]目的CDNA片段的酶切回收:对载有HN片段的质粒进行BsmB頂每切
酶切体系为BsmB I:NEB buffer 3 5 yL,BSA(10mg/Ml)0.5 yL，BsmB I 2 yL，质粒20yL，ddH20 22.5 yL，总体系为50μΙ^55Γ温育8 h。
[0011]4、全长cDNA的体外构建
使用已建立的禽传染性支气管炎病毒H120毒株反向遗传系统，重新连接改造后的全长cDNA。
[0012]5、细胞适应性H120毒株cDNA的体外转录及恢复病毒的获得
体外转录试剂盒进行转录:取约200 ng经纯化连接产物作为模板，使用mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra Kit进行体外转录，反应体系如下:
(1)全长00嫩体外转录体系:10父丁7React1n Buffer 2 yL，T7 2XNTP/ARCA 10 yL,GTP 3 yL，Template DNA5 yL，T7 Enzyme Mix 2 yL，20 yL
(2)N-3’cDNA体外转录体系:10XT7React1n Buffer 2 yL, T7 2XNTP/ARCA 10 μL，GTP 3 yL，Template DNA 5yL，T7 Enzyme Mix 2 yL37°C温育2 h后，加入I yL TURBO DNase，温育 15 1^11。-70°(:保存。
[0013]6、电击转染
(I)将BHK细胞培养至单层时，用0.25%胰酶消化，加入8 mL DMEM完全培养基，悬浮细胞。4°C 400 g离心3 min。弃上清，加入10 mL不含FBS、青链霉素的DMEM重悬细胞，离心。
[0014](2)重悬细胞于不含FBS、青链霉素的DMEM，使细胞浓度约为I X 107/mL。
[0015](3)将细胞置冰浴中10 11^11，取0.8 1^转入0.4 mL电击杯中，将I yg转录体与细胞小心混匀。
[0016](4)进行电穿孔，使用Gene Pulser Xcell系统，电击参数为:电压400 V、脉冲时长25 ms、脉冲次数3、脉冲间隔0.5 S。
[0017](5)电击结束后，将电击杯置冰浴中5 min，将细胞稀释后转入培养瓶中，补加培养液稀释20倍，37 °C培养并观察。
[0018](6)将细胞培养物传鸡胚收获其鸡胚尿囊液。并将鸡胚尿囊液储存于_70°C冰箱。
[0019]7、反向遗传拯救株R-Hl 20-Lasota (HN)的鉴定
(1)沉默突变鉴定
分别对转染后48 h的细胞液、和将细胞液接入鸡胚中获得的鸡胚尿囊液RT-PCR鉴定，引物扩增区域覆盖引入的沉默突变位点，目标片段长度为584 bp，引物序列为:
IBV-H-R-F:5'- AATATAAGACAGAGCACAAG -3，
IBV-H-R-R:5'- CTGTCATACAAAGCAGCACTACA -3’
(2)HN基因鉴定 5-ATGGACCGCGCCGTTAGCCA-3
5-〇61'(^(:0^60^640^66(:1'1'(:1'0^-3，目标长度1800 bp
(3)IFA鉴定
将BHK21细胞培养于96孔细胞培养板，置37°C、5% C02恒温箱中培养12-24 h，待细胞长至80%-90%的单层后，弃去培养液，以DMEM原液洗2次。将已经稀释好10TCID5q的IBV加入细胞培养板的相应板孔中，每孔50 yL，同时设不接种病毒的正常细胞为空白对照。让病毒吸附I h，其间每隔20 min摇匀I次，然后将所有板孔补加细胞维持液至200 yL，置于37°C、5%CO2培养箱中培养6 h。弃去细胞培养板中的细胞维持液，每孔加入一20°C预冷的70%丙酮100 L，4°C固定15 min，弃去固定液，晾干，此细胞培养板可以立即使用或置一20°C冰箱中保存，备用。封闭:用PBS将固定了的细胞培养板洗涤3次，每孔加入1% BSA 100此，室温放置30 min，再用I3BS洗涤3次。加入50 yL已稀释好的一抗于培养板孔内，细胞培养箱孵育适当时间，PBS振洗3次，每次5 min，然后加入50此已稀释好的二抗于培养板孔内，在培养箱内避光孵育适当时间，PBS振洗3次，每次5 min。镜检:感染的细胞浆中显示特异性的黄绿色免疫荧光可判定为阳性，没有显示特异性的黄绿色免疫荧光则判定为阴性。
[0020]8、反向遗传拯救株R-Hl 20-Lasota (HN)遗传生物学特性
(1)将拯救毒株1?-11120-1^8(^3(!^)在鸡胚中生长曲线与亲本毒株!1120无显著性差异。
[0021 ] (2)连续提取10代拯救毒株RNA，RT-PCR顺利扩增拯救毒株R-H120_Lasota(HN)和亲本毒株N基因，顺利扩增出490 bp左右大小的特异性目的片段。并顺利扩增出R-H120-NDV-HN/(5a)毒株HN基因，表明拯救毒株R-H120-Lasota(HN)能够稳定遗传。
[0022](3)拯救毒株R-Hl2O-Lasota(HN) HA测定拯救毒株R-H120-Lasota(HN)与阳性对照H120毒株经过魏氏梭菌处理后能够凝集鸡红细胞，滴度为211，而未经处理的R-H120_Lasota(HN)与阳性对照Lasota能凝集鸡红细胞，血凝价为211。
[0023](4)拯救毒株EID50测定
R-H120-Lasota(HN)拯救毒株接种SPF鸡胚表现出感染IBV的典型症状，发育迟缓、矮小、蜷缩。按Reed-Muench法计算，H120毒株的EID50为EID50=10—7/0.2mL，R-H120-Lasota(HN)毒株EID50为10—6'8EID50/0.2mL。拯救毒株EID50与亲本毒株无显差异。
[0024](5)拯救毒株在传代细胞CK细胞中病理变化(CPE)
R-H120-Lasota(HN)毒株接种CK细胞后，能够使CK细胞产生明显的细胞病变(CPE)，脱落、死亡。
【主权项】
1.一种禽传染性支气管炎病毒H120重组表达禽新城疫病毒Lasota毒株HN基因疫苗株构建技术，其特征在于:使用反向遗传技术，将禽传染性支气管炎病毒Hl 20毒株对禽新城疫病毒Lasota毒株HN进行表达，构建以禽传染性支气管炎病毒H120为载体的二联苗株R-H120-Lasota(HN)o2.根据权利要求1所述的R-H120-Lasota(HN)疫苗株，其特征在于:按照Nosee’M策略设计引物，在扩增HN基因的上下游引物引入BsmBI限制性内切酶，并在HN基因起始 密码子 ATG 前面引入 GeneEnd，Genestar，korzea “AGAAAAAATACGGGTAGAACACTAGTCCGCCACCA”， 用所扩增的HN基因替换H120毒株的5a阅读框、并通过反向遗传技术获得拯救毒株R-H120-Lasota(HN)o3.根据权利要求1所述，拯救获得的R-H120-Lasota(HN)疫苗株，其生物学特征在于:所获得的R-H120-Lasota(HN)能够在鸡胚中稳定传代;能够稳定表达禽新城疫HN蛋白；IFA能够检测到免疫荧光;拯救毒株R-H120-Lasota(HN)与经过魏氏梭菌处理后能够凝集鸡红细胞，滴度为211;EID50测定为 10-6.8EID50/0.2 mL;R-H120-Lasota(HN)毒株接种CK细胞后，能够使CK细胞产生明显的细胞病变(CPE);对IBV标准攻毒毒株和新城疫标准攻毒毒株具有良好的保护作用，可用于预防禽传染性支气管炎病毒和禽新城疫病毒。
【文档编号】C12N7/01GK106047823SQ201610502356
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月1日
【发明人】王红宁, 杨鑫, 周泷, 周英顺, 门帅
【申请人】四川大学