杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用

杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，涉及杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用。所述突变株NB2011ΔExoU，保藏号为CGMCC No.12430，其制备方法为：利用同源重组基因敲除技术将杀香鱼假单胞菌野生株NB2011的ExoU基因进行基因敲除，经PCR技术筛选鉴定确定所获得的菌株为基因敲除突变株。用本发明所述的突变株进行动物实验研究其致病性，其结果是对实验动物的毒力显著降低，可应用于杀香鱼假单胞菌弱毒性疫苗。CGMCC No.1243020160512
【专利说明】
杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，设及杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株及其应用。
【背景技术】
[0002] 大黄鱼是我国东部沿海网箱养殖的重要经济鱼类品种，近年来受到内脏白点病的 危害，造成很高的死亡率和严重的经济损失。杀香鱼假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida)是该病病原菌。致病株NB2011基因组测序和注释结果表明，该菌编码典 型的S型分泌系统（type虹secretion system,T3SS)，该系统存在于很多革兰氏阴性致 病菌中，形态表现为跨越细菌外膜直接插入真核宿主细胞膜的一针形复合体，菌体通过此 复合体将多种效应蛋白输送到宿主细胞中，发挥破坏宿主细胞骨架结构、改变信号传递和 免疫反应类型，控制宿主细胞的应答等功能，从而建立感染、实现传播。NB2011的T3SS与人 类条件性病原菌铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的相应系统最为接近。在铜绿假单胞菌中， exoU作为该菌T3SS分泌的4种效应蛋白之一，通过T3SS直接输送到宿主细胞中，与真核细胞 膜结合，发挥憐脂酶A活性，裂解细胞，造成细胞和组织坏死，是重要的毒力因子;该基因的 存在是铜绿假单胞菌强毒株的重要标志，基因缺失的突变株毒力显著减弱。本实验室已经 验证了杀香鱼假单胞菌NB2011通过T3SS分泌一效应蛋白，其氨基酸序列与铜绿假单胞菌细 胞毒素 exoU存在45%的同源性，同样具有憐脂酶A活性，可能是该菌的重要毒力因子。
[0003] 大黄鱼内脏白点病流行和爆发于水溫较低的冬春季节，鱼类不摄食，基本无法通 过投喂药物的方式控制病情，目前尚无有效的防治方法。利用疫苗接种的方法预防鱼类感 染性疾病的发生，已经有半个多世纪的历史，目前世界范围内成功使用的鱼类疫苗包括冷 水性弧菌疫苗、娃科鱼类红嘴病和肠炎病二联疫苗、鱼类传染性膜腺坏死病疫苗等，国内有 草鱼病毒性出血病疫苗、淡水鱼类细菌性败血症疫苗、副溶血弧菌和溶藻弧菌二联疫苗等， 获得了较好的防病效果。开发特异性良好的高效疫苗，也是预防大黄鱼内脏白点病的重要 方法。针对杀香鱼假单胞菌致病株NB2011，前期研究结果表明，常规灭活疫苗和主要表面抗 原免疫能够刺激显著水平的抗体应答，但不能提供有效保护;超微病理观察到了该菌在巨 隧细胞内存活和增殖现象，提示了该菌可能是一种兼性胞内病原菌。迟缓爱德华氏菌 化dwardsiella tarda)是一种典型的胞内寄生菌，可感染多种水产养殖动物，采用基因敲 除技术联合缺失多种T3SS效应蛋白基因的突变株毒力大为减弱，作为弱毒苗能够提供有效 保护。针对杀香鱼假单胞菌，我们也需要探索研制活的弱毒疫苗、DNA疫苗等新型疫苗，模仿 自然感染途径，有效激活细胞免疫，才能对宿主提供足够保护。
[0004] 本发明首次构建了杀香鱼假单胞菌NB2011S型毒力因子ExoU基因敲除突变株，显 著降低了对大黄鱼的毒力，接种鱼体后可有效激发细胞免疫和体液免疫，预防侵袭和疾病 的发生;避免了常规灭活疫苗或亚单位疫苗激发产生的体液抗体不能到达宿主细胞内，无 法有效清除胞内病原的不足。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一株杀香鱼假单胞 菌ExoU基因敲除突变株。
[0006] 本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供该突变株的应用。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:该杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除 突变株NB2011 AExoU，其特征在于，NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基 因被卡那霉素抗性基因盒KanR所代替，该突变菌株的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中屯、，保藏号为：CGMCC No. 12430，保藏日期为2016年5月12日；所述的 NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因序列如SEQ ID N0.1所示;所述的 卡那霉素抗性基因盒KanR序列如SEQ ID NO.2所示。
[000引本发明还提供一种杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特征在于 包含W下步骤：
[0009] (1)根据如SEQ ID N0.3所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基 因的上游0臟序列，设计?〇?特异引物虹〇11-5。和虹〇1]-51?;根据如560 10^.4所示的杀香鱼 假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的下游DNA序列，设计PCR特异引物EX0U-3F和 EX0U-3R; W地D4质粒为模板，设计一对特异引物Kan-F和Kan-R;其中引物EX0U-5F序列如 沈Q ID NO.5所示，引物Ex加-5R序列如沈Q ID NO.6所示，引物Ex加-3F序列如沈Q ID NO.7 所示，引物虹〇1]-31?序列如沈0 10^.8所示，引物肪11斗序列如沈0 10^.9所示，引物1(曰11- R序列如沈Q ID NO. 10所示；
[0010] (2) WNB2011基因组DNA为模板，分别 WExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R 为引 物，扩增得到5'端含Sma I酶切位点的目的基因 ExoU上游DNA序列片段FA和3'端含Sma I酶 切位点的目的基因 ExoU下游DNA序列片段RA; W地D4质粒为模板，WKan-F/Kan-R为特异引 物扩增得到两端含ExoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒KanR; WExoU-5F/ExoU-3R 为引物，W纯化的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因序列为模板，进行融合PCR，获得打祀 片段即上游片段-卡那霉素抗性基因盒-下游片段FA-KanR-RA;
[0011] (3)打祀载体9〇0):6^1]的构建:将所述的。4-1(曰诚-1?4插入9〇0)442载体的5111曰1酶 切位点间得打祀载体pCVD: exoU;
[0012] (4)打祀载体pCVD: ex加电转化转入大肠杆菌E.coli 02155,获得供体菌(62155/ pCVD442:exoU；
[0013] (5)的155/pCVD442:exoU供体菌与受体菌杀香鱼假单胞菌NB2011进行接合实验， 在卡那霉素平板上筛选获得卡那霉素抗性的杀香鱼假单胞菌克隆，其基因组已整合打祀序 列，称为NB2011/pCVD442: AExoU。
[0014] (6)在含10%薦糖的LB平板上划线接种NB2011/pCVD442: AExoU，培养至单克隆形 成，通过PCR技术筛选鉴定获得ExoU基因被Kan抗性基因取代的克隆，命名为NB2011 A exoU: Kan,即得到保藏号为CGMCC No. 12430的杀香鱼假单胞菌型exoU基因敲除突变株，简称 NB2011 AexoU。
[0015] 进一步的上述杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特征在于所述 的基因敲除载体pCVD: :exoU的构建包含如下步骤：
[0016] (a)卡那霉素抗性基因盒KanR的克隆：WKan-F/Kan-R为特异引物，W提取的地D4 质粒DNA为模板扩增得到两端分别含ExoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒KanR;
[0017] (b)ExoU 上、下游同源片段的扩增：分别 WExoU-5F/ExoU-5R 和 ExoU-3F/ExoU-3R 为 引物，扩增得到5'端含Sma I酶切位点的目的基因 ExoU上游DNA序列片段FA和3'端含Sma I 酶切位点的目的基因 ExoU下游DM序列片段RA;
[0018] (C)基因打祀片段的融合:ExoU基因上、下游同源重组臂和卡那霉素抗性基因表达 框扩增产物经电泳、割胶纯化，WExoU-5F/ExoU-3R为引物，进行融合PCR反应，获得融合打 祀片段 FA-KanR-RA;
[0019] (d)打祀载体pCVD442:exoU的构建:酪/氯仿法提取PCVD442质粒，溶于200山TE缓 冲液中，该TE缓冲液包含lOmM化is和抑为8.0的0.1 mM抓TA;融合PCR产物经酪/氯仿处理 后，异丙醇沉淀，并溶解于40iU去离子水;PCVD442质粒和融合PCR产物经Smal酶切，酶切产 物电泳，割胶纯化后建立连接反应，连接产物经异丙醇沉淀后，70%乙醇洗涂，溶解于扣1去 离子水;通过电转化方法将其转入大肠杆菌D册aApir，在含25μg/ml卡那霉素的LB平板上于 37°C培养，至单克隆形成，挑选生长良好的克隆，接种入5ml含50iig/ml氨节青霉素和25iig/ ml卡那霉素的LB培养基，37°C培养过夜；次日离屯、柱法提取质粒，此质粒即为打祀载体 pCVD442:exoU。
[0020] 本发明还提供一种杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011 A exou在制备杀 香鱼假单胞菌减毒疫苗中的应用。
[0021] 所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株通过如下方法获得：
[0022] (a)在LB平板上划线接种受体菌杀香鱼假单胞菌NB2011，3(TC培养至单克隆形成， 挑单克隆入5ml LB;挑的155/pCVD442: AExoU单克隆入5ml含25iig/ml Amp的LB培养液，30 °C，220巧m培养过夜。
[0023] (b)取50化1供体菌02155/pCVD442: A ExoU菌液与lOOOiil受体菌的菌液按照体积 比为1: 2混合，该受体菌为杀香鱼假单胞菌NB2011，轻轻吹打混合后，600化pm离屯、5min，收 集菌体，W无抗性LB培养液洗涂1次，该无抗性LB培养液含0.5mM二氨基庚二酸DAP，菌体重 悬于1ml含0.5mM DAP的LB培养液中，取100山铺到0.22皿无菌滤膜上，30°C培养过夜。次日， 滤膜上菌体在5ml生理盐水中吹打洗脱，取40iil菌液涂布于含有25iig/ml Kan的LB平板，30 °C培养过夜;在Kan抗性平板上，随机挑选16个克隆，分别挑入LB培养基，取0.扣1菌液 采用外侧引物ExoU-outF/ExoU-outR进行PCR检测，ExoU-outF/ExoU-outR的序列如沈Q ID NO. 11，12所示;选择扩增产物为弱或无扩增的克隆，此类克隆为ExoU基因打祀质粒一次重 组克隆，需在薦糖平板上继续进行二次重组克隆的筛选。
[0024] (C)取NB2011/PCVD442: A exoU菌液划线接种LB薦糖平板，该LB薦糖平板含10%的 薦糖且无氯化钢，30°C培养至单克隆形成;随机挑选16个克隆，分别挑入20iU LB培养基，取 〇.5iU菌液用外侧引物进行PCR检测;选择出现明亮的特异条带扩增的克隆，此克隆应发生 了二次重组；再利用ExoU内部引物ExoU-inF/ExoU-inR进行PCR检测，ExoU-inF/Ex加-inR序 列如SEQ ID NO. 13，14所示;PCR验证的结果为阴性，因此可W判断此克隆为ExoU基因被卡 那霉素抗性基因取代的克隆，命名为NB2011/AexoU: :Kan，简写NB2011 AexoU。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：（1)本发明运用同源重组的原理，构建中 间为卡那霉素抗性基因，两侧为ExoU基因上下游同源序列的基因敲除载体pCVD::exoU，将 构建的pCVD: :exoU基因敲除质粒电转化入大肠杆菌感受态细胞，与杀香鱼假单胞菌致病株 NB2011接合后，通过体内同源重组，经基因水平、DNA测序和蛋白水平鉴定，成功获得突变 株，命名为NB2011 A exoU; (2)本发明对exoU基因敲除突变株的相关生物学特性和致病性进 行了分析，明确了 ExoU基因与NB2011致病性的关系，NB2011 A exoU较野生株相比，到达对数 生长期时间和生长速率没有明显差异；突变株不分泌ExoU蛋白；大黄鱼毒力试验结果表明 突变株NB2011AexoU的毒力下降，表明ExoU参与了致病过程，是一种重要的毒力相关因子， 该突变菌株为弱毒疫苗的制备提供了重要基础，可应用于P.plecoglossicida减毒疫苗的 开发；（3)本发明构建的NB2011 A exoU，为进一步研究杀香鱼假单胞菌的致病机制奠定了基 础，为更有效的防控大黄鱼内脏白点病提供了技术支持；（4)本发明成功构建的 P.plecoglossicida NB2011的Ex加基因敲除突变株NB2011 A exoU，突变株不合成和分泌 ExoU蛋白；在腹腔注射大黄鱼毒力实验中，突变株AexoU毒力显著下降，说明ExoU是杀香鱼 假单胞菌的一个重要毒力因子；W-定剂量的突变菌作为弱毒疫苗免疫大黄鱼，获得了有 效保护，表明突变株能够有效激发机体的保护性应答，为该菌疫苗的研制奠定了部分基础。 [002引保藏说明
[0027] 1、杀香鱼假单胞菌NB2011 A ex加，分类命名：Pseudomonas plecoglossicida，保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2016年5月12日，保藏号为CGMCC No.12430。
【附图说明】
[0028] 图1为基因敲除载体PCR鉴定结果图（M:DNA分子量标准。泳道lWexoU-5F/exoU-3R 为引物对，W打祀载体pCVD446-exoU质粒DM为模板的PCR产物，目的片段为打祀片段FA- 1(曰诚-1?4，长度31956口）；
[0029] 图2为突变菌的PCR初筛结果(M，DNA分子量标准；泳道l-16WexoU外侧引物ExoU- outF/ExoU-outR扩增的PCR结果）；
[0030] 图3-A为突变菌的复筛PCR结果（M，DNA分子量标准；泳道l-16WexoU外侧引物 ExoU-outF/ExoU-outR 扩增的 PCR 结果；
[0031] 图3-B为图3-A中泳道15筛选PCR结果(M，DNA分子量标准;泳道+为杀香鱼假单胞菌 NB2011原始菌株，而泳道1和2WExoU内侧引物ExoU-inF/ExoU-inR扩增的PCR结果，验证的 结果为阴性）；
[0032] 图4为突变株的组合PCR鉴定结果图(M，DNA分子量标准;泳道1和2为WNB2011基因 组DNA为模板，内部引物PCR扩增鉴定结果，目的片段为ExoU基因内部引物ExoU-inF/ExoU- inR，长度51化P，平行管；泳道3和4为WNB2011 A exoU基因组DNA为模板，内部引物PCR鉴定 结果，平行管;5、6为WNB2011基因组DNA为模板，外部引物PCR鉴定结果，目的片段为exoU外 部序列片段，野生株中长度为4707bp，平行管，泳道7和8为NB2011 A exoU外部引物鉴定结 果，突变株中长度为4164bp，平行管）；
[0033] 图5突变株分泌蛋白的SDS-PAGE电泳图及Western-blotting鉴定图（A，野生株与 突变株分泌蛋白的SDS-PAGE; M，蛋白分子量标准；1，野生株NB2011的分泌蛋白；2，突变株 NB2011 A exoU的分泌蛋白；B，W兔抗ExoU血清进行免疫印迹识别分泌蛋白；M，预染蛋白分 子量标准；1，野生株NB2011分泌蛋白的印迹结果；2，突变株NB2011 A exoU分泌蛋白的印 迹）。从图5A中的结果可W看出，野生株NB2011和突变株NB2011 A exoU均能分泌蛋白，然后 利用抗体进行检测，从图5B中的结果可W看出，图5的结果表明了野生株向培养液分泌ExoU 蛋白，而ExoU基因缺失突变的NB2011 A exoU菌株不分泌ExoU蛋白。
[0034] 图6为野生株和突变株的24h生长曲线。
【具体实施方式】
[0035] W下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
[0036] 实施例1基因敲除载体的构建
[0037] (1)根据P.plecoglossicida野生株NB2011基因组ExoU编码基因的上下游DNA序 列，设计PCR特异引物，碱基序列如下：
[003引 EXOU-5F:5'-atacccgggCTGGCATTGCGGATTCCCAAG-3'（沈Q ID NO.5,下划线处为引 入的Smal酶切位点）
[0039] ExoU-5R:5，-ACCCTCTCCAACATCACAATTAACTATTG-3'(沈Q ID N0.6)
[0040] ExoU-3F:5 '-TGGTTTCTTCTGATTGGCCAAGG-3^ 沈Q ID NO.7)
[0041 ] ExoU-3R:5'-atacccggGCTGATCGAAATGCTCTTGATCAGTC-3/ (沈Q ID NO.8,下划线处 为Smal酶切位点）。WNB2011基因组DM为模板，PCR扩增目的片段，PCR反应体系为NB2011基 因组DNA 0.扣LaOXpfu缓冲液扣L，25mM dNTP 0.4化，ExoU-5F/ExoU-5R，ExoU-3F/ExoU- 3R各0.扣L，pfu 0.扣L，双蒸水43化，总共50化;PCR反应条件:95°C预变性5min，95°C30s，60 °C45s，72°C90s，35个循环，最后72°C延伸7min，W双蒸水为阴性对照。利用Ex加-5F/Ex加- 5R和ExoU-3F/ExoU-3R两对引物扩增所得PCR产物经1 %琼脂糖电泳检测分别获得目的片段 大小为832bp和878bp。
[0042] (2)根据地D4质粒序列，设计一对特异引物Kan-F/Kan-R，W地D4质粒为模板扩增 整个的kan表达盒，引物序列为：
[0043] Kan-F:5'-caatagttaattgtgatgttggagagggtCATATGAATATCCTCCTTAGTTCCTATTC- 3'（SEQ ID NO.9,小写字母代表与上游同源臂3'端同源序列）
[0044] Kan-R:5'-ccttggccaatcagaagaaaccaGAGCTGCTTCGAAGTTCCTA-3'(沈Q ID N0.10， 小写字母代表与下游同源臂5'端同源序列）
[0045] PCR反应体系为：p邸4质粒DNA0.扣L，10Xpfu缓冲液扣L，25mMdNTP0.4化，Kan- F/Kan-R，各0. !5化，pfU 0. !5化，双蒸水43化，总共50化。
[0046] PCR 反应条件为：95°C 预变性 5111111，951：3〇3,551：453,721：7〇3,35个循环，最后72 °C延伸7min，W双蒸水为阴性对照。
[0047] (3似ExoU-5F/ExoU-3R为引物，W纯化的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因序 列为模板，进行融合PCR，获得打祀片段上游片段-卡那霉素抗性基因盒-下游片段FA-KanR- RA。
[OO4引 PCR反应体系为：上下游同源臂（lOng/化)各化L，10Xpfu缓冲液10yL，25mM dNTP 0.祉L，ExoU-5F/ExoU-3R(SOpm/yL)各化L，pfu 化L，双蒸水85化，总共 100化。
[0049] PCR 反应条件为:95°C 预变性 5min，95 °C30s，60 °C45s，72 °C4min，35 个循环，最后 72 。(:延伸7min，W双蒸水为阴性对照。利用ExoU-5F/ExoU-3R为引物扩增所得PCR产物经1 %琼 脂糖电泳检测分别获得目的片段大小为3195bp，结果如图1所示。
[0050] (4)打祀片段的克隆：将Smal酶切后的FA-KanR-RA片段与用同样内切酶处理过的 质粒PCVD442进行连接，16 °C过夜后将连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，经卡那霉素 和氨节青霉素双重筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37°C振荡过夜，次 日提取质粒DNA，即为重组质粒PCVD442- A ExoU。
[0051] (5)基因敲除载体pCVD442-AExoU的鉴定：将得到的阳性重组基因敲除载体 pCVD442-AExoU进行测序(上海生工生物工程有限公司），测序结果表明在KanR基因两侧具 有同源序列的ExoU目的基因，基因敲除载体PCVD442-AExoU的构建完全正确。
[0052] 实施例2突变株的筛选与鉴定
[0053] (1)接合试验
[0054] ①供体菌的构建:将打祀载体pCVD442-AExoU电转化进入大肠杆菌的155菌株，铺 LB平板(含Amp 50iig/ml，0.5mM DAP)，37°C培养至单克隆形成。此克隆即为用于接合实验的 供体菌株的 155/pCVD442- A ExoU。
[0055] ②接合试验：
[0056] (1)在LB平板上划线接种受体菌杀香鱼假单胞菌NB2011，28°C培养至单克隆形成。
[0057] (2)挑NB2011 单克隆入3ml LB;挑的 155/pCVD442-AEx加单克隆入3ml LB(含Amp 25iig/ml)，37 °C，220巧m培养过夜。
[005引 （3)取50化1供体菌的155/pCVD442-AExoU菌液与1000i^l受体菌（杀香鱼假单胞 菌)菌液混合(体积比1:2)，轻轻吹打混合后，600化pm离屯、5min，收集菌体，W无抗性LB培养 液(含0.5mM二氨基庚二酸(DAP))洗涂1次，菌体重悬于1ml LB培养液(含0.5mM DAP)中，取 lOOiU铺到0.22WI1无菌滤膜上，30°C培养过夜。次日，滤膜上菌体在5ml生理盐水中吹打洗 脱，取40iil菌液涂布于含有25iig/ml Kan的LB平板，30°C培养过夜。
[0059] ③突变菌的初筛：在Kan抗性平板上，随机挑选16个克隆，分别挑入LB培养 基，取0.扣1菌液行外侧引物PCR检测(结果如图2)。结果显示:第7、8和16号克隆的扩增产物 为弱或无（原始菌株扩增长度：4707bp;ExoU被卡那霉素抗性基因替代菌株扩增长度： 4164bp;通过单次交换于基因组上一侧手臂处插入整个打祀质粒的一次重组克隆为弱或无 扩增）。如果ExoU基因被敲除，PCR扩增将会得到阴性结果，如果仍能扩增出预期大小 (4707bp)的产物，说明ExoU基因未被敲除；其中，第7、8和16号扩增出的扩增产物大小为 (4164bp)的ExoU，此S个克隆应该是ExoU基因打祀质粒一次重组克隆，需在薦糖平板上继 续进行二次重组克隆的筛选，通过运种方法W初步筛选获得基因敲除突变株;并选择第8号 克隆命名为NB2011/pCVD442-AexoU，继续进行后续的实验。
[0060] (2)突变株的复筛：取NB2011/pCVD442-AexoU菌液划线接种LB薦糖平板(含10% 薦糖，无化C1)，30°C培养至单克隆形成。随机挑选16个克隆，分别挑入LB培养基，取 〇.5iU菌液用外侧引物进行PCR检测（图3A)。结果显示:仅第15号克隆出现明亮的特异条带 扩增，长度为4164bp，此克隆应发生了二次重组(通过一侧同源重组手臂插入基因组的载体 序列经另一侧的手臂重组被剔除出基因组，局部序列可能回复到原始菌株的排列，也可能 重组产生目标基因敲除的菌株）dExoU内侧引物PCR验证的结果为阴性（图3B)，因此可W判 断此克隆为ExoU基因被卡那霉素抗性基因取代的克隆，命名为NB2011/AexoU: :Kan。
[0061] (3)突变株的鉴定：
[0062] 组合PCR鉴定:在ExoU敲除目的基因上下游同源序列的FA和RA的外侧和内侧分别 再设 id-对引物ExoU-〇utF/ExoU-〇utR，ExoU-inF/ExoU-inR,其引物序列为：
[0063] ExoU-outF:5 '一邑aact邑tc邑aa邑ac邑ctttca邑aaata-3 '
[0064] ExoU-outR:5 ' 一ttctt邑a邑cacat邑aaa邑ctattctcc-3 '
[0065] ExoU-InF:5 ' 一ata邑acat邑t邑cc邑邑aaatcaa-3 '
[0066] ExoU-InR:5 ' 一aaattcac邑邑tacct邑tea邑ca-3 '
[0067] 基因敲除载体pCVD442-AexoU与细菌染色体可发生巧巾方式的重组:a.双交换同 源重组事件(double cross-over)，即等位基因置换，此时KanR基因取代ExoU基因；b.3/端 单交换重组事件(3^ single cross-over)，此时整个载体DNA序列随着y端同源序列而整合 到细菌的染色体上;c.5^端单交换重组事件(5^ single cross-over)，此时载体序列随着5^ 端同源序列而整合到细菌染色体上。若发生等位基因置换，通过一侧同源重组手臂插入基 因组的载体序列经另一侧的手臂重组被剔除出基因组，局部序列可能回复到原始菌株的排 列，也可能重组产生目标基因敲除的菌株的克隆。W突变株基因组为模板，分别用ExoU内 外侧引物进行PCR扩增，结果如图4所示。用引物ExoU-outF/ExoU-ou证能扩增出的4164bp的 目的片段，结果各PCR产物的大小与理论值相符；WExoU-inF/ExoU-inR为引物时则无产物， 表明ExoU基因已被替换;经DNA测序验证(上海生工测序），在基因水平证实NB2011 A exoU突 变株构建成功。
[006引蛋白水平鉴定：为了进一步对NB2011 A exoU突变株进行蛋白水平验证，将野生株 与突变株分别在T3SS诱导培养基化化5mM EGTA)中培养化后，收集培养液上清，经S氯乙酸 (TCA)法浓缩20倍，进行聚丙締酷胺凝胶电泳(SDS-PAGE);同时准备两块平行胶，一块经考 马氏亮蓝染色，另一块经半干法转移到硝酸纤维素膜上后WExoU多克隆抗体(兔抗)进行免 疫印迹，结果如图5所示，野生株培养上清液中检测到预期分子量的反应蛋白，突变株中无， 表明突变株未分泌ExoU蛋白。
[0069] 实施例3生长特性检测实验
[0070] 在相同培养条件下，分别挑取NB2011 A exoU(CGMCC No.)和野生株NB2011单菌落 分别接种于5mL含LB培养基中，28°C振荡培养过夜。次日取出过夜培养的细菌，测定600nm处 吸光度值，用LB培养基将两者稀释至约1 X 108cells/mL浓度。然后各取50化L突变株和野生 株分别接种于LB培养基5mL中，于28 °C，200r/min振荡培养，24h内每隔化分别取样测定 〇D600，W培养时间为横坐标，孤600值为纵坐标，绘制突变株和野生株生长曲线（图6)，结果发 现突变株NB2011 A exolKCGMCC No.)的生长速率与野生株没有显著性差异，提示了ExoU与 菌株的生长性能关联不大。
[0071 ] 实施例4动物致病性实验
[0072]平均体重75±15g的健康大黄鱼幼鱼，随机分成5组，每组10尾，充气暂养于直径Im 的圆型水族箱中，试验开始前适应7天。1-4组每尾鱼在胸罐基部注射0.2mL浓度分别为1.0 Xl〇5cells/mL、1.0 Xl〇6cells/ml、1.0 Xl〇7cells/m巧口1.0 Xl〇8cells/mL的NB2011A exoU 活菌液，组 5-8 则注射相同剂量的 1 .OX l〇5cells/mL、l .OX l〇6cells/mL、l .OX 107cells/mL和1.0X108cells/ml NB2011活菌液，对照组9注射0.2血无菌生理盐水。记录10 天内的发病和死亡情况，并进行病原的再分离确定死亡原因。经SPSS17.0的机率单位加权 回归法(Bliss)计算96h的LDso。从刚死病鱼内脏中重新分离出与NB2011形态和理化特性相 同的细菌，表明死亡是由人工感染引起。突变菌株和野生株感染9化内的LD50分别为5.47 X l〇6cells/mL、1.40Xl〇5cells/mL，表明突变株的毒力显著下降。
[0073] 实施例5突变株对大黄鱼的人工免疫作用
[0074] 暂养试验鱼7dW便适应养殖环境后进行免疫试验。在体积为30化左右的水泥池中 进行免疫试验，试验期间水溫为25±2°C，试验期为3周。选取规格均匀的健康大黄鱼，体重 为lOOg左右，按照每组15尾鱼随机分为3组。1组、2组注射突变菌体（1.0X104cells/mL，每 尾0.2mL)，对照组注射相同剂量的灭菌生理盐水。
[0075] 在免疫后21天进行了人工攻击实验，观察了 7天内的死亡情况，并统计了免疫保护 率。突变菌免疫组在第6天出现2尾死亡，未免疫的攻击组100%死亡，注射生理盐水的空白 对照组在试验期间出现了 1尾死亡。NB2011AEXOU菌体组的免疫保护率达75%。虽然死亡鱼 未出现明显的内脏白点症状，但自病鱼内脏中重新分离到了杀香鱼假单胞菌，证明试验中 的死亡由人工感染的菌体引起。
【主权项】
1. 杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011 ΔΕχου，其特征在于，NB2011株中的 ExoU基因从第1位至2010位之间的编码基因被卡那霉素抗性基因盒Kan所代替，该突变菌株 的菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No . 12430,保藏日期为2016年5月12日；所述的NB2011株中的ExoU基因从第1位至2010位之 间的编码基因序列如SEQ ID NO. 1所示；所述的卡那霉素抗性基因盒Kan序列如SEQ ID NO. 2所示。2. -种根据权利要求1所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特 征在于包含以下步骤： (1) 根据如SEQ ID NO.3所示的杀香鱼假单胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的 上游DNA序列，设计PCR特异引物ExoU-5F和ExoU-5R;根据如SEQ ID NO. 4所示的杀香鱼假单 胞菌野生株NB2011基因组ExoU编码基因的下游DNA序列，设计PCR特异引物ExoU-3F和ExoU-3R;以pKD4质粒为模板，设计一对特异引物Kan-F和Kan-R;其中引物ExoU-5F序列如SEQ ID N0·5所示，引物ExoU-5R序列如SEQIDN0·6所示，引物ExoU-3F序列如SEQIDN0·7所示，弓丨 物ExoU-3R序列如SEQ ID NO.8所示，引物Kan-F序列如SEQ ID NO.9所示，引物Kan-R序列如 SEQ ID NO .10所示； (2) NB2011 基因组DNA为模板，分别以 ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R为引物，扩 增得到5'端含Sma I酶切位点的目的基因 ExoU上游DNA序列片段FA和3'端含Sma I酶切位点 的目的基因 ExoU下游DNA序列片段RA;以pKD4质粒为模板，以Kan-F/Kan-R为特异引物扩增 得到两端含exoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒KanR;以Ex 〇U-5F/Ex〇U-3R为引物， 以纯化的上、下游同源臂和卡那霉素抗性基因序列为模板，进行融合PCR，获得打靶片段即 上游片段-卡那霉素抗性基因盒-下游片段FA-KanR-RA; (3) 打靶载体?00):61〇1]的构建:将所述的?4-1(&111?-1^插入?00)442载体的3111 &1酶切位 点间得打靶载体pCVD:ex〇U; (4) 打靶载体pCVD:exoU电转化转入大肠杆菌E.coliβ2155，获得供体菌β2155/ pCVD442:exoU； (5) i32155/pCVD442: exoU供体菌与杀香鱼假单胞菌受体菌进行接合实验，在卡那霉素 平板上筛选获得卡那霉素抗性的杀香鱼假单胞菌克隆，其基因组已整合打靶序列，称为 NB2011/pCVD442: AExoU。 (6) 在含10%蔗糖的LB平板上划线接种NB2011/pCVD442: AExoU，培养至单克隆形成， 通过PCR技术筛选鉴定获得ExoU基因被Kan抗性基因取代的克隆，命名为ΝΒ2011 Δ ex〇U: Kan，即得到保藏号为CGMCC No.的杀香鱼假单胞菌型ExoU基因敲除突变株，简称NB2011 Δ exoU〇3. 根据权利要求2所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株的构建方法，其特征在 于所述的基因敲除载体pCVD: :exoU的构建包含如下步骤： (a) 卡那霉素抗性基因盒KanR的克隆：以Kan-F/Kan-R为特异引物，以提取的pKD4质粒 DNA为模板扩增得到两端分别含ExoU上下游同源序列的卡那霉素抗性基因盒KanR; (b) ExoU上、下游同源片段的扩增：分别以ExoU-5F/ExoU-5R和ExoU-3F/ExoU-3R为引 物，扩增得到5'端含Sma頂每切位点的目的基因 ExoU上游DNA序列片段FA和3'端含Sma I酶 切位点的目的基因 ExoU下游DNA序列片段RA; (C)基因打靶片段的融合:Εχ〇υ基因上、下游同源重组臂和卡那霉素抗性基因表达框扩 增产物经电泳、割胶纯化，以ExoU-5F/ExoU-3R为引物，进行融合PCR反应，获得融合打靶片 段FA-KanR-RA。 (d)打靶载体pCVD442:ex〇U的构建:酚/氯仿法提取pCVD442质粒，溶于200μ1 TE缓冲液 中，该ΤΕ缓冲液包含10mM Tris和pH为8.0的0.1 mM EDTA;融合PCR产物经酚/氯仿处理后，异 丙醇沉淀，并溶解于40μ1去离子水;pCVD442质粒和融合PCR产物经Sam I酶切，酶切产物电 泳，割胶纯化后建立连接反应，连接产物经异丙醇沉淀后，70 %乙醇洗涤，溶解于5μ1去离子 水;通过电转化方法将其转入大肠杆菌DH5aApir，在含25μg/ml Kan的LB平板上于37°C培养 至单克隆形成，挑选生长良好的克隆，接种入5ml含Amp 50μg/ml和Kan 25μg/ml的LB培养 基，37°C培养过夜。次日离心柱法提取质粒，此质粒即为打靶载体pCVD442: exoU。4. 根据权利要求1所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因敲除突变株NB2011 Δ ex〇U在制备杀 香鱼假单胞菌减毒疫苗中的应用。5. 根据权利要求4中所述的杀香鱼假单胞菌ExoU基因突变株NB2011 △ exoU在制备减毒 疫苗中的应用，其中所述的杀香鱼假单胞菌exoU基因敲除突变株通过如下方法获得： (a) 在LB平板上划线接种受体菌杀香鱼假单胞菌NB2011，3(TC培养至单克隆形成，挑单 克隆入5ml LB;挑02155/pCVD442:AExoU单克隆入5ml LB含Amp 25μg/ml，30°C，220rpm培 养过夜。 (b) 取500μ1供体菌P2155/pCVD442: Δ ExoU菌液与ΙΟΟΟμΙ受体菌的菌液按照体积比为 1:2混合，该受体菌为杀香鱼假单胞菌ΝΒ2011，轻轻吹打混合后，6000rpm离心5min，收集菌 体，以无抗性LB培养液洗涤1次，该无抗性LB培养液含0.5mM二氨基庚二酸(DAP)，菌体重悬 于lml含0.5mM DAP的LB培养液中，取100μΙ铺到0.22μπι无菌滤膜上，30°C培养过夜。次日，滤 膜上菌体在5ml生理盐水中吹打洗脱，取40μ1菌液涂布于含有25μg/ml Kan的LB平板，30°C 培养过夜;在Kan抗性平板上，随机挑选16个克隆，分别挑入20μ1 LB培养基，取0.5μ1菌液用 外侧引物ExoU-outF/ExoU-outR进行PCR检测，ExoU-outF/ExoU-outR的序列如SEQ ID NO. 11，12所示;选择扩增产物为弱或无扩增的克隆，此类克隆为ExoU基因打靶质粒一次重 组克隆，需在蔗糖平板上继续进行二次重组克隆的筛选。 (c) 取NB2011/pCVD442: Aex〇U菌液划线接种LB蔗糖平板，该LB蔗糖平板含10%的蔗糖 且无氯化钠，30°C培养至单克隆形成;随机挑选16个克隆，分别挑入20μ1 LB培养基，取0.5μ 1菌液用外侧引物进行PCR检测;选择出现明亮的特异条带扩增的克隆，此克隆应为发生二 次重组;再利用ExoU内部引物ExoU-inF/ExoU-inR进行PCR检测，ExoU-inF/ExoU-inR序列如 SEQ ID NO. 13，14所示;PCR验证的结果为阴性，因此可以判断此克隆为ExoU基因被卡那霉 素抗性基因取代的克隆，命名为NB2011 / Δ ex〇U: : Kan，简写NB2011 Δ ex〇U。
【文档编号】C12N15/78GK106047783SQ201610355003
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月25日
【发明人】毛芝娟, 王越峰, 高丽婷, 陈吉刚
【申请人】浙江万里学院