一种用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株mhgc424及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株MHGC424，该菌株的保藏名称为：假单胞菌MHGC424(Pseudomonas sp.MHGC424)，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2009年8月28日，保藏编号为：CCTCC NO：M209188。该菌株具有高效有机物降解能力，能快速有效的去除受有机物污染海水中的有机物，并且对海水养殖生物没有毒害致病作用。本发明对去除海水养殖环境中高浓度有机物污染具有安全、环保、高效的特点。CCTCC NO：M20918820090828
【专利说明】
-种用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株MHGC424及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体设及一种用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株 MHGC424及其在处理有机物污染海水中的应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，在海水网箱养殖产业飞速发展的同时，养殖"自身污染"问题日益凸现出 来，其中养殖过程产生的有机物污染物常常会引发海水网箱养殖的水体发臭、沉积环境恶 化，导致水中溶解氧降低，养殖鱼类死亡，水体生态平衡破坏。
[0003] 海水网箱养殖系统作为一种高密度、高投巧的人工养殖生态系统，影响养殖环境 最根本的原因在于养殖过程中产生的大量残巧、粪便及死亡动植物残骸等有机物的沉积。 目前的物理和化学去除有机污染物方法都存有一定的局限性。其中物理方法存在效率低 下，成本高的缺点;化学方法虽然见效快，但常引起二次污染。为达到对有机污染物快速、高 效去除，本发明拟从海水养殖环境沉积物中富集分离纯化获得一株微生物，并将其用于对 有机物污染的治理中。
【发明内容】
[0004] 本发明的第一个目的在于提供一种用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株 MHGC424，该菌株具有高效的有机物降解能力，能快速有效地去除海水环境中的有机物。
[0005] 本发明的第二个目的在于提供上述用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株MHGC424 在处理海水中有机污染物中的应用。
[0006] 经试验证实，本发明所述的假单胞菌菌株MHGC424对海水养殖生物没有毒害致病 作用。
[0007] 本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种用于海洋有机物降解的 假单胞菌菌株MHGC424,该菌株的保藏名称为：假单胞菌MHGC424( Pseudomonas sp .MHGC424)，保臧单位为：中国典型抬养物保臧中屯、，保臧地址为：中国武汉武汉大学，保 藏日期为:2009年8月28日，保藏编号为:CCTCC N0:M209188。
[000引本发明中的用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株MHGC424的筛选分离鉴定过程 为:取海水网箱养殖场区的沉积物，在实验室利用选择培养基培养后，分离纯化菌株，根据 菌株对巧料有机物降解能力的强弱，最终筛选出一株对巧料有机物有较强降解能力的菌 株，编号为MHGC424,然后根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征，及其 leSrDNA基因序列经与Genbank中已登陆的基因序列进行对比分析发现，菌株MHGC424经鉴 定为假单胞菌属，命名为假单胞菌MHGC424(Pseudomonas SP.MHGC424)。
[0009] 本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述用于海洋有机物降解的 假单胞菌菌株MHGC424在处理海水中有机污染物中的应用。
[0010] 在处理有机物污染海水中的具体过程为：取经上述分离纯化的假单胞菌 (Pseudomonas SP. )MHGC424单菌落，于活化扩大培养基中培养40-4化，按海水与菌液体积 比为40-60:1，将假单胞菌MHGC424(Pseudomonas SP.MHGC424)接种于含巧料有机物的海水 中，25-28 °C恒溫振荡培养3-5d。
[0011] 上述活化扩大培养基的组成优选为：蛋白腺5 . Og，酵母膏1. Og，憐酸高铁0.1 g，陈 海水lOOOmL，抑 7.6-8.2，121°(：灭菌2〇111111。
[0012] 本发明与现有技术相比具有W下优点:本发明从海水网箱养殖区沉积物中筛选得 到的新菌株，对有机污染物尤其是巧料有机物有较强的降解能力，在l-5d内对巧料有机物 的COD去除率达23.6~40.9%。
【附图说明】
[0013]图1是实施例帥菌株MHGC424的PCR产物琼脂糖电泳图；
[0014] 图2是实施例3中菌株M服C424的电镜图片；
[0015] 图3是实施例5中投加菌株MHGC424的高浓度巧料有机物海水中的生化耗氧量 (B0D)变化图；
[0016] 图4是实施例5中投加菌株MHGC424的高浓度巧料有机物海水中的化学耗氧量 (COD)变化图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不W任何形式限制本发明。
[001引实施例1
[0019] 用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株MHGC424的筛选
[0020] 一、材料准备
[0021] 1、菌源和实验废水
[0022] (1)菌源有20多年养殖历史的深圳市大鹏澳海水鱼类网箱养殖场区的沉积物。
[0023] (2)实验废水（含高浓度巧料有机物海水）：杂鱼糜5g，陈海水1000mL，pH7.6~ 8.2，121°(：灭菌2〇111111。
[0024] 2、培养基
[0025] (1)选择培养基:杂鱼糜20g，陈海水lOOOmUpH 7.6~8.2，121°(：灭菌2〇111111。
[0026] (2)分离及斜面培养基：蛋白腺5g，酵母膏Ig，憐酸高铁O.lg，琼脂粉20g，陈海水 lOOOmL，地 7.6~8.2。
[0027] (3)活化扩大培养基：蛋白腺5g，酵母膏Ig，憐酸高铁0.1 g，陈海水lOOOmL，pH 7.6 ~8.2，12rC 灭菌 20min。
[00巧]3、实验仪器和设备
[00巧]美国HACH B0D Trak测定仪；
[0030] 广东海利电磁式空气压缩机AC0-00犯；
[0031] 苏州安泰超净工作台SW-CJ-1脚；
[0032] 上海精宏生化培养箱甜P-150;
[0033] 苏州欧倍振荡培养箱0BS-2F;
[0034] 德国 HYDR0-BI0S-KIEL 采泥器；
[0035] 日本HIRAYAMA高压灭菌器HVN-85;
[0036] 日立H-7650透射电子显微镜；
[0037] PC818 型 PCR 仪；
[0038] 电泳仪及电泳槽；
[0039] 加热板及滴定仪；
[0040] 凝胶紫外观测仪等。
[0041] 二、菌株的分离与筛选
[0042] 1、菌株的富集
[0043] 取大鹏澳海水鱼类网箱养殖场沉积物表层W下5cm处的沉积物放入采样袋，再放 入0°C冰盒中带回实验室。取250g沉积物加到化的富集瓶中，加入750mL灭选择培养基，并加 入适量的纤维棉，在室溫条件下连续曝气富集培养2个月，中间据情况不定期添加灭菌海水 和选择培养基。
[0044] 2、有机物降解细菌的分离纯化
[0045] 挑选并直接冲洗细菌附着量较大的纤维棉，得到富集菌液，适当稀释，均匀涂布于 分离培养基平板上，28°C培养3d，待菌落长出后，挑取形态各异的单菌落，在分离培养基平 板上进行划线分离，直至得到纯的单菌落。将分离纯化的细菌接种至斜面培养基中并于冰 箱4°C保存。
[0046] 3、有机物降解细菌的筛选
[0047] 通过用B0D及COD值来衡量菌株对巧料有机物的利用能力，W有机物的可生化降解 性(BODs/CODo)来表示5加寸间里细菌利用巧料有机物的降解能力。
[004引取分离纯化得到的菌株于活化扩大培养基中25-28°C培养40-4化，按海水与菌液 体积比40-60:1，接种到含高浓度(5%，质量百分含量)巧料有机物的海水中，取不接种菌液 的巧料有机物海水作为空白对照，25-28 °C溫度振荡培养，反应时间l-5d，监测巧料有机物 海水的B0D及COD。
[0049] 经过筛选获得一株编号为MHGC424的菌株，即海洋有机物降解菌株MHGC424。
[00加]实施例2
[0051 ] 海洋有机物降解菌株MHGC424的鉴定
[0化2] 1、对海洋有机物降解菌株MHGC424的鉴定
[0化3] 对海洋有机物降解菌株MHGC424进行了生理生化的鉴定W及16S rDNA分子的鉴 定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。
[0化4] 16S rDNA序列分析主要按照W下步骤：
[0055] (1)细菌核DNA的提取：
[0056] 1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜，取1.5mL菌液于 Eppendorf管内，8000巧m室溫离屯、5min，彻底除去上清。
[0057] 2)加 STE(Sodium-Tris-EDTA)缓冲液1.5mL洗涂一次，离屯、弃上清，再加入0.6血TE (化is-EDTA)缓溶液，重悬细菌。
[0化引 3)加30化lOmg/mL的溶菌酶，37°C水浴45min。
[0059] 4)加6扣L 10 %的SDS(十二烷基横酸钢），20mg/mL的蛋白酶K3化，50r水浴化，至 溶液变清。
[0060] 5)加入等体积酪氯仿抽提=次，直至看不到蛋白质为止。
[0061 ] 6)在上清液中加入1 /10体积的3M的NaAc (p册.2)。
[0062] 7)加入等体积的异丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒缠绕挑出DNA细丝，再用体积百分含量 为70%的乙醇洗涂一次，自然惊干，并将DNA溶于10化L TE溶液中。
[0063] 8)加入终浓度为50yg/mL的化ase(RNA酶），37°C，30min，去除RNA，-20°C保存备用。
[0064] (2)168 rDNA基因的PCR扩增
[00化]P1(上游引物）：27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')
[0066] P2(下游引物）：1492R(5'-AAG TCG TAA CAA GGT AAC C-3')
[0067] 在50化的反应体积中，加入化L模板DNA(0. lug)，0.5化P巧日P2(终浓度为0.5咖），1 化dNTP(每种NTP0.2mM)，0.扣LTaq聚合酶(2U)和扣L10 XPCR缓冲液。PCR扩增条件为:94°C 预变性5min，在94°C变性30s，61-65°C退火30s，72°C延伸Imin，循环30次;最后72°C终延伸 10min〇
[0068] (3)PCR产物的回收
[0069] 将PCR产物W1%琼脂糖凝胶(质量百分比)进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收 片段的凝胶，放入1.5mL离屯、管中力日2倍体积TE，65°C水浴lOmin后加等体积水饱和酪抽提一 次离屯、后取上层水相再用酪-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的lOmol/L乙酸 锭和2倍体积无水乙醇沉淀，离屯、，用体积百分含量为70%的乙醇洗沉淀一次，风干后溶于 适量灭菌双蒸水。
[0070] (4)168 rDNA的部分序列测定和分析
[0071] P-f：CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；
[00。] P-r:GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
[0073] 加入化L模板DNA(<0.化g)，PCR扩增30个循环（94°Clmin，55°C30s，72°C2min)。采 用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在Applied Biosystem373A DNA测 序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子 水平上确定该菌的种属。
[0074] 2、16S rDNA序列测定
[0075] 本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。W细 菌的核DNA为模板，W16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度 为1498bp的扩增带用1%琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序 列。
[0076] 0077 * 0079 0080 0081 12345
2
[007引实施例3 3 海洋有机物降解菌株MHGC424菌落形态、生理和生化特征 4 海洋有机物降解菌株MHGC424菌落形态、生理和生化特征见表1;细胞形态见图2。 5 表1海洋有机物降解菌株MHGC424的菌落形态特征W及主要的生理生化特征
[0090] 海洋有机物降解菌株MHGC424的应用
[0091] 应用实例一：
[0092] 取实施例1中经分离纯化的假单胞菌属(Pseudomonas sp. )MHGC424单菌落，于活 化扩大培养基中培养40-48h，按海水与菌液体积比为40-60:1，接种到含巧料有机物的海水 中，设空白对照，揽拌子揽拌培养，培养溫度25-28°C，连续监测巧料有机物海水的B0D(生化 耗氧量），反应2-7d。
[0093] 从图3可W看出，接种假单胞菌属(Pseudomonas sp.)MHGC424菌株的巧料有机物 海水中的B0D随时间逐渐增大，4-7d维持稳定。假单胞菌属(Pseudomonas sp.)MHGC424菌株 在4-7d对有机物有较强的降解能力。
[0094] 应用实例二：
[00巧]取实施例1中经分离纯化的假单胞菌属(Pseudomonas sp. )MHGC424单菌落，于活 化扩大培养基中培养40-48h，按海水与菌液体积比为40-60:1，接种到含巧料有机物的海水 中，设空白对照，揽拌子揽拌培养，培养溫度25-28°C，连续监测巧料有机物海水中的COD(化 学耗氧量），反应l-5d。
[0096] 从图4可W看出，接种假单胞菌属(Pseudomonas sp. )MHGC424菌株的巧料有机物 海水中的COD随时间逐渐减少，直至第4d降为最低，海水中的COD去除率为40.9%。假单胞菌 属(Pseudomonas sp. )MHGC424菌株能迅速有效地降低巧料有机物海水中的COD。
[0097] 应用实例
[009引取实施例1中经分离纯化的假单胞菌(Pseudomonas sp. )MHGC424单菌落，于活化 扩大培养基中培养40-4化，按海水与菌液体积比为40-60:1，接种到装有化过滤海水的玻璃 圆缸中，并W不加菌液的过滤海水为对照，分别放养有40尾体长约1cm的班节对邮(Penaeus monodon)邮苗和20尾体长约3cm的黑觸（Sparus macrocephalus)仔鱼，各分3个平行实验 组，水溫25-28 °C，9化后，经统计分析邮苗存活率在75 %~85.5 %，仔鱼存活率在在75 %~ 85.5%，存活率在实验组与对照组的之间无显著差异。可见，假单胞菌(Pseudomonas sp.) MHGC424对海水养殖生物没有毒害致病作用。
[0099]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株MHGC424,其特征是：该菌株的保藏名称 为:假单胞菌MHGC424(Pseudomonas sp.MHGC424)，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏日期为：2009年8月28日，保藏编号为：CCTCC NO: M209188。2. 权利要求1所述的用于海洋有机物降解的假单胞菌菌株MHGC424在处理海水中有机 污染物中的应用。
【文档编号】C02F3/34GK106047765SQ201610596713
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月26日 公开号201610596713.8, CN 106047765 A, CN 106047765A, CN 201610596713, CN-A-106047765, CN106047765 A, CN106047765A, CN201610596713, CN201610596713.8
【发明人】古小莉, 黄洪辉, 孟霞
【申请人】中国水产科学研究院南海水产研究所