食品发酵用的酵母菌菌株、发酵剂及其应用
【专利摘要】本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及一株食品发酵用的酵母菌菌株、发酵剂及其应用。季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)，保藏编号为CCTCC NO：M 2015809，保藏于中国典型培养物保藏中心。一种发酵剂，包含所述的季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)、乳酸菌，所述发酵剂应用于米乳饮料、米发糕、米酒和米粉的制作。本发明该菌株可以作为优质专用发酵剂，可使产品中起主要发酵作用的微生物成为优势菌种，实现强化发酵，发酵时间短，发酵特性好，产品质量稳定，风味优良。CCTCC NO:M 201580520151230CCTCC NO：M 201580920151230
【专利说明】
食品发酵用的酵母菌菌株、发酵剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及食品技术领域，具体设及食品发酵用的酵母菌菌株、发酵剂及其应用。
【背景技术】
[0002] 发酵是发酵米制品生产的重要工序，发酵过程中起主要作用的微生物是乳酸菌， 其次是酵母菌。酵母菌可W赋予米乳饮料醇香、使口感细腻爽滑。乳酸菌作为安全的食品菌 株，可抑制其他有害菌的滋生，降解蛋白质，使产品酸甜适口，无异味，无分层和无沉淀等现 象。
[0003] 微生物发酵剂是用于生产发酵制品的特定微生物培养物，微生物发酵剂在发酵制 品生产中的应用能够改变传统发酵制品的生产工艺，开发专用微生物发酵剂是解决传统发 酵食品的工业化生产的重要方法。微生物发酵剂的使用特点主要有发酵活力强、发酵时间 短、节省原材料、降低成本、有效地防止杂菌的污染、提高发酵产品稳定性、精确控制发酵过 程等。多菌种发酵是微生物发酵的技术手段。多菌种混合发酵可弥补单菌种发酵的单调性， 使产品风味物质更加丰富。在发酵米制品中，酵母菌对产品的形态，色泽，风味起决定作用， 而乳酸困对广品的储存稳定性起决定作用。
[0004] 作为一种谷物饮料制品，米乳饮料充分地保留了大米中的蛋白质、维生素、膳食纤 维W及矿物质等对人体健康有益的营养成分，并且W饮料的形式呈现，食用更为方便，营养 成分更易吸收。但是目前发酵型米乳饮料还存在多种问题，如菌种单一、风味差、营养素损 失多等问题。酵母菌可W显著提高米乳的色泽和风味，目前还没有关于适用于米乳饮料专 用微生物发酵剂的酵母菌菌株。
【发明内容】
[0005] 本发明提供食品发酵用的酵母菌菌株、发酵剂及其应用，能克服现有技术的缺陷， 一是从米粉米浆的发酵液中分离出发酵性能良好的纯种菌株作为微生物发酵剂应用的菌 株;二是制备作为发酵米制品特别是发酵米乳饮料用的包含本发明的季也蒙毕赤酵母Y10 (Pichiaguilliermondii)和筛选的乳酸菌的复合发酵剂(菌剂）；S是含有本发明制备的微 生物菌株的复合发酵剂下简称菌剂)在发酵米制品特别是在米乳饮料生产中的应用，W 达到米乳饮料等发酵米制品生产简便、高效、优质、稳定生产的目的。
[0006] 本发明技术方案如下：
[0007] -株食品发酵用的酵母菌菌株，其特征在于，所述菌株为季也蒙毕赤酵母Y10 (Pichia guilliermondi Y10)，保藏编号为CCTCC N0:M 2015809,2015年 12月30 日保藏于 中国典型培养物保藏中屯、。
[000引其18S rDNA的核巧酸序列如沈Q ID N0:1所示。
[0009] 中国典型培养物保藏中屯、地址为：中国.武汉.武汉大学。
[0010] -种发酵剂，包含季也蒙毕赤酵母，所述季也蒙毕赤酵母为所述的季也蒙毕赤酵 母Y10(Pichia guilliermondi Y10)。
[0011]所述发酵剂还包括乳酸菌，所述乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种M7 (Lactobacillus de化rueckiisubsp.bulgaricus M7) ,2015年12月30日保藏于中国典型培 养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCC NO: M 2015805。
[0012] 中国典型培养物保藏中屯、地址为：中国.武汉.武汉大学。 所述发酵剂中季也蒙毕赤酵母Yl〇(Pichia guilliermondi Y10)菌液浓度为106~ lO^cfu/mL，戶片述德氏乳杆菌保加矛。亚亚种M7(Lactobacillus de化rueckiisubsp .bulgaricus M7)菌液浓度为107~108cfu/mL，所述季也蒙毕赤酵母Y10 (Pichia guilliermondi Y10)与德氏乳杆菌保加利亚亚种M7化actobacillus de化rueckiisubsp.bulgaricus M7)的菌悬液体积比为1:9~14。
[0013] 所酵母菌菌株或所述发酵剂在发酵米制品制作中的应用。
[0014] 所述发酵米制品为米乳饮料。
[0015] 所述酵母菌菌株或所述发酵剂在米乳饮料制作中的应用包括W下步骤：
[0016] 1)混合:称取米粉，加水调浆，将脱脂乳粉配制成10%的脱脂乳加入米浆中，并添 加白砂糖，揽拌均匀，得到混合米浆；
[0017] 2)均质:混合米浆采用一次均质；
[0018] 3)糊化:置于沸水浴中糊化，不断揽拌，防止糊化不均匀；
[0019] 4)冷却:将糊化后的混合米浆迅速冷却至40°C W下；
[0020] 5)接种、发酵：向冷却后的混合米浆中接种发酵菌种，置于恒溫培养箱中发酵；
[0021] 6)发酵结束后得到成品，于4°C条件下储藏。
[0022] 所述步骤2)均质压力在10-40MPa，所述步骤3)糊化时间30min。
[0023] 所述步骤5)发酵菌株添加量为混合米浆的4%~5%，发酵溫度为35~37°C，发酵 时间10~12h。
[0024] 本发明的季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)是本
【申请人】从传统米 浆发酵液中分离得到12个候选菌，经分离、纯化，进行酵母菌产气试验，将初筛的菌株活化 后接入PDA的液体培养基中，30°C培养，定时取样，测定发酵液的pH值和0D值，筛选出产气最 快的菌株。
【申请人】将其编号为Y10。经鉴定该菌株为季也蒙毕赤酵母（Pi chia guilliermondi)。2015年12月30日保藏于中国典型培养物保藏，其保藏编号为CCTCC N0:M 2015809。
[0025] 本发明的季也蒙毕赤酵母YIO菌株的菌学特征：季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)单菌落浅黄色，大而圆，粘稠，突起，出芽生殖。
[00%] 本发明有益效果如下：
[0027] 1.该菌株可W作为优质专用发酵剂:本发明作为高活菌数的菌种培养物接入到发 酵米制品中，可使发酵米制品中起主要发酵作用的微生物成为优势菌种，实现强化发酵，发 酵时间短，发酵特性好，产品质量稳定，风味优良的目的。
[0028] 2.本发明的发酵剂使用方便:本发明的发酵剂可直接添加到米浆中，不需添加其 他添加剂，使用方便，使用剂量小。
[0029] 3.本发明的复合发酵剂实现了混合菌种（季也蒙毕赤酵母Y10( Pi chia guilliermondi YIO)和德氏乳杆菌保加利亚种M7 (Lactobacillus de化rueckiisubsp.bulgaricus M7)的复合发酵，该微生物复合发酵剂具有良好的发酵性 能。
[0030] 4.本发明制作的米乳饮料具有醇香浓郁、口感润滑、酸甜适口和稳定性高等特点。
[0031] 5.本发明菌株还可用于米酒、米发糕和米粉的制作中，应用范围广，得到的产品酸 甜适宜、口味丰富。
[0032] 6.本发明制作的米发糕不同于W往蓬松度高的特点，具有质地松软柔初，孔桐细 密、口感松软、黏弹适宜的质地特征。
【附图说明】
[0033] 图1:菌株季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)的显微镜照片。
[0034] 图2:菌株季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)的PCR扩增电泳图。 [OO%] 图3:基于ISSrDNA序列构建的季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10) 的系统进化树。
[0036] 图4:是本发明的季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)的18S rRNA全 长序列与数据库中Pichia guilliermondKEU784644.1)序列对比图。
[0037] 图5:本发明季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)的生长曲线和pH 值。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例来进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施 例表述的范围。
[0039] 实施例1优势菌株的分离鉴定及特性研究
[0040] 1.菌株的分离纯化
[0041 ]采用梯度稀释平板法分离酵母菌疑似菌落，平板纯化四代，镜检后转斜面胆藏，得 到单菌落。
[0042] 2.菌株的分子生物学鉴定
[0043] (1)真菌总DNA的提取
[0044] 1)利用真菌基因组DNA抽提试剂盒提取酵母菌DNA
[0045] 2)PCR扩增:采用扩增真菌ISSrDNA通用引物
[0046] P1 (5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3' )，P2(5' -CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3' W酵母菌的 DNA基因组为模板，PCR扩增酵母菌ISSrDNA的部分基因序列。PCR扩增条件：94°C预变性 5min;94°C 变性 30s，53°C 退火 30s，72°C 延伸 2min，30 次循环；72°C 延伸 7min。取 2ul 的 PCR 产 物于0.8 %琼脂糖凝胶电泳中进行电泳检测。
[0047] 3)将经0.8 %琼脂糖凝胶电泳检验后的PCR扩增产物进行ISSrDNA序列分析。将测 序结果在NCBI数据库中采用Blast软件进行在线比对分析，并通过MEGA6软件构建进化。
[004引（2)菌株生长曲线和pH的测定
[0049]将保藏在4°C冰箱中的菌株转接到已灭菌的lOmL液体培养基中，培养2地，连续进 行3次活化，得到活化的菌液。取2mL培养24h的菌液，接种于150mL液体培养基中，在恒溫摇 床培养箱中28°C，150rpm培养。培养期间每隔一定时间取样一次，W不接种的液体培养基作 空白，用分光光度计测定培养液的光密度0D值，测定波长为600nm，用0D600nm值表示总菌 数。用抑计测定上述不同培养时间取样的培养液的抑值，菌株的产酸量用抑值表示。
[00加]Y10菌株的部分序列ISSrDNA分别与Pichia guilliermonilSSrDNA核巧酸序列 化U784644.1)相比相似性达到99%。结果见图5,确定本发明的菌株Y10为季也蒙毕赤酵母 (Pichia guilliermondi)。
[0051]实施例2本发明发酵剂在米乳饮料的制作中的应用 [0化2] 米乳饮料的工艺为：
[0053] 1)混合:称取米粉，加水调浆，将脱脂乳粉配制成10%的脱脂乳加入米浆中，并添 加白砂糖，揽拌均匀，得到混合米浆。
[0054] 2)均质：采用一次均质，均质压力在10-40MPa。
[0055] 3)糊化:将混合米浆置于沸水浴中糊化30min，不断揽拌，防止糊化不均匀。
[0056] 4)冷却:将糊化后的混合米浆迅速冷却至40°C W下。
[0057] 5)接种、发酵：向冷却后的混合米浆中接种发酵菌种，置于恒溫培养箱中发酵。
[0058] 6)发酵结束后得到成品，于4°C条件下储藏。
[0059] 所述发酵剂中季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)菌液浓度为 l〇6cfu/mL，戶片述M7德氏乳杆菌保加矛U亚亚种（Lactobacillus de化rueckiisubsp .bulgaricus)菌液浓度为108c化/mL，所述季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia guilliermondi Y10)与德氏乳杆菌保加利亚亚种M7 (Lactobacillus (16化1'116。1^13山339.13111旨日1'；[(3118 17)的菌悬液体积比为1:12，发酵剂接种量为混合米浆中 的5 %。
[0060]表1不同发酵时间下米乳饮料的感官品质评价(发酵溫度37°C)
[0062] 由表1可知，随着发酵时间的延长，在化-1化范围内米乳的色泽、气味、口感、滋味 和组织状态等感官指标较高，而且随着发酵时间的增加各项指标逐渐增加。当发酵时间超 过12h后，各项感官指标呈下降趋势，说明在此发酵剂作用下，米乳饮料的发酵时间W不超 过1化为宜。
[0063] 表2发酵溫度对不酶解米乳感官品质的影响(发酵时间12h)
[0064]
[0065] 表2所示为发酵溫度对米乳感官品质的影响。由表2可知，发酵溫度对米乳的色泽 和组织状态没有影响，对气味和口感有显著影响，随发酵溫度的升高，米乳的气味和口感评 分呈下降趋势，在发酵溫度为35°C、37°C和39°C时，米乳的气味没有差别，评分最高，在发酵 溫度为37 °C时，米乳的口感评分最高，且综合评分也最大。
[0066] 实施例3本发明发酵剂与单一菌种发酵剂的对比实验
[0067] 1.试验材料
[0068] 在本实施例中，所述的本发明复合发酵剂按实施例2的方法发酵剂相同，所述的单 一发酵剂按实施例2的方法制作。
[0069] 2.复合发酵剂与固态单一菌种发酵剂发酵制作的米乳饮料的比较
[0070] 按实施例2中米乳饮料的利记博彩app制作产品并进行感官品质评价。固态复合发酵 剂与单一菌种发酵剂的添加量相同。本发明复合发酵剂中季也蒙毕赤酵母Y10(Pichia gui 11 i ermondi Y10 )菌液浓度为1 06cf u/mL，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种M7 (Xactobacillus de化rueckiisubsp .bulgaricus M7)菌液浓度为 108c化/血，所述季也蒙 毕赤酵母Yl〇(Pichia guilliermondi Y10)与德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillus de化rueckiisubsp .bulga;ricus)M7的菌悬液体积比为1:12。单一菌种发酵剂季也蒙毕赤酵 母Y10(Pichia guilliermondi Y10)，菌液浓度为106cfu/mL，单一菌种发酵剂德氏乳杆菌 保加利亚亚种M7 化 actobacillus del bruecki i sub sp . bul gar icus M7)菌液浓度为 108c化/mL。发酵剂接种量为混合米浆中的5 %。
[0071] 表3本发明复合发酵剂与单一菌种发酵剂制作的米乳饮料的感官品质评价
[0072]
0073 0074 * 0076 0077 * 0079 0080 * * * 1234567891011 由表3可知，与两种单一菌种发酵剂所生产的米乳饮料相比，本发明的复合发酵剂 (菌剂)在实验条件范围内具有较强的发酵作用，使米乳饮料在色泽、香气、口感和滋味等感 官品质指标上有较大的提局。 2 实施例4本发明发酵剂在米发糕的制作中的应用 3
[00巧]米发糕的制作工艺为： 4 1)混合:将米粉、糖粉、发酵剂、变性淀粉、水混合均匀，得到物料1; 5 2)发酵:物料1发酵得到物料2; 6
[007引3)调配:物料2中加入糖，泡打粉，得到物料3; 7 4)蒸制:物料3隔沸水浴蒸制。 8 在本实施例中，
【申请人】比较了本发明制备的复合发酵剂（制作同实施例3方法，不 9 同的是所述季也蒙毕赤酵母Yl0(Pichia guilliermondi Y10)与德氏乳杆菌保加利亚亚种 10 (Lactobacillus de化rueckiisubsp.bulgaricus M7)M7的菌悬液体积比为10:2)。在不同 11 添加量，发酵时间及发酵溫度下对米发糕的感官品质评价见表4所示。由表4可知，不同组合 条件下制作的米发糕感官品质存在较大差异，实验表明，添加质量比为5%，于35°C下发酵 12h制作的质地松软柔初，孔桐细密、口感松软、黏弹适宜的质地特征。
[0081 ]表4发酵条件对米发糕感官品质的影响
[0082]
[0083]
[0084] 实施例5本发明复合发酵剂制作的米发糕的质构特征
[0085] 在本实施例中，本发明复合发酵剂制作（同实施例4方法）、本发明单一酵母菌（同 实施例4方法）、市售酵母菌（同实施例4方法）、老浆来源于大米发酵72h的发酵液，制作时添 加量W质量比计为5%。比较米发糕的质构特征。
[0086] 本发明发酵剂制作的米发糕的质构特性见表5。W本发明复合发酵剂合菌种工艺 制作的米发糕硬度最低，单独采用市售酵母菌菌株制作的硬度和巧嚼性要显著高于其它工 艺制作的米发糕，本发明酵母菌为发酵剂制作的米发糕的黏着性的绝对值要高于市售酵母 菌、老浆和本发明复合发酵剂制作的米发糕。四种工艺制作的米发糕弹性没有差异，本发明 单一酵母菌为发酵剂制作的米发糕回弹性最低。
[0087] 表5米发糕的质构特性 「mRRl
0089 0090 0091 123 因此采用本发明复合发酵剂制作的米发糕可W增加米发糕的柔软性。发酵过程中 支链淀粉由于结构较直链淀粉松弛易于被微生物利用而含量下降，减弱了淀粉的重结晶能 力，从而改善了凝胶的储藏稳定性。同时，支链淀粉含量的减少，使蒸制后的米发糕质地松 软柔初，孔桐细密、口感松软、黏弹适宜，易于脱模。 2 实施例6本发明复合发酵剂制作的米发糕的滋味特征 3 在本实施例中，利记博彩app同实施例6。比较米发糕的游离氨基酸组成见表6。
[0092] 表6米发糕的游离氨基酸组成(mg/lOOg)
[0093]
0094 * 0096 0097 0098 0099 123456 由表6可知，W本发明复合发酵剂制作的米发糕游离氨基酸含量较高，接近传统的 老浆工艺，运是由通过分离的优势菌株酵母菌和乳酸菌，对米浆中营养物质降解更充分，产 生了大量的游离氨基酸。市售酵母菌为发酵剂的工艺制作的米发糕中的游离氨基酸总含量 最低。 2
[00M]实施例7本发明菌株用于米酒制作 3 米酒的制作工艺为： 4 1)清洗:用自来水洗米两次。 5 2)浸泡:2 9.3 °C的恒溫箱中，W米:水的比例用自来水浸泡15h，然后用自来水洗 米并渐干； 6 3)蒸饭:将渐干的米于常压下蒸煮40min，且在蒸饭过程中W米:水为1:0 8的比例 喷凉开水一次，并适当揽拌；
[0100] 4)冷淋:煮熟的米饭用凉开水冲淋，使饭粒分离并使溫度降至室溫；
[0101] 5)拌曲：将一定量的酒曲加入冷却的米饭中，拌匀，用保鲜膜封盖；
[0102] 6)发酵:将装杯的样品放入恒溫箱中，于一定溫度下发酵一定时间；
[0103] 7)所有用具均用沸水消毒。
[0104] 该米酒复合发酵剂包含米根霉、根霉W及本发明酵母菌按菌液体积比为2:3:3:2 比例(ml)混合，菌液浓度为107~108c化/邑。
[0105] 表7不同发酵剂制作的甜米酒的感官评分
[0106]
[0107] 由表7可知，本发明的固体复合发酵剂制作的甜米酒在色泽、滋味和感官总评分上 明显优于用纯根霉和传统酒曲制作的甜米酒。
[0108] 实施例8本发明发酵剂在米粉的制作中的应用
[0109] 米粉的制作工艺：
[0110] 1)原料:碎米化g，还可W用大米、玉米、慧米、绿豆、蚕豆、马铃馨等原材料，按照常 规方法清洗；
[0111] 2)浸泡:加水2000mL，于5-50°C，2-6倍水浸泡0.5-化；
[0112] 3)混合:加入发酵剂(2 %~4 % )，揽拌均匀；
[0113] 4)发酵:添加质量比为3%~5%，于30°C，发酵12h;
[0114] 5)清洗:用饮用水清洗1-3次；
[0115] 6)研磨:研磨至60-120目；
[0116] 7)成型：用双螺杆挤压机挤压成型，溫度90-180°C，压力1 -3Mpa，时间0.5-3min，；
[0117] 8)老化:于10-45度，畑(85%-98%)，悬挂静置2-lOh，得到粉丝。
[0118] 表8不同发酵剂制作米粉的感官评分
[0119]
[0120] 在本实施例中，采用本发明酵母菌为发酵剂制作的米粉色泽洁白、香气浓郁、口感 弹初、感官品质局。
[0121] 上述的实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对于本发明的限制，本申 请中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可W相互任意组合。本发明的保护范 围应W权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方 案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。
[0123]
【主权项】
1. 一株食品发酵用的酵母菌菌株，其特征在于，所述菌株为季也蒙毕赤酵母ΥΙΟ (Pi chi a gu i 11 i ermond i rj 6?」，保藏编号为 CCTCC N0:M 2015809 2015年 12 月 30 日保藏于中国典型培养物保藏中心。2. 根据权利要求1所述的菌株，其特征在于其18S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所3. -种发酵剂，其特征在于:包含季也蒙毕赤酵母，所述季也蒙毕赤酵母为权利要求1 或2所述的季也蒙毕赤酵母]广尸icAia1^0」。4. 根据权利要求3所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂还包括乳酸菌，所述乳酸菌 为德氏乳杆菌保加利亚亚种# ?7 Γ Z a c ? 〇 /? a c i t/ s delbrueckiisubsp. bulgaricus #7」，保藏编号为CCTCC N0:M 2015805。5. 根据权利要求4所述的发酵剂，其特征在于：所述发酵剂中季也蒙毕赤酵母 〔Pi cA ia gui ? i er?o/3 c/i」菌液浓度为106~107cfu/mL，所述德氏乳杆菌保加利亚亚 执 M7 (Lactobacillus delbrueckiisubsp .bulgaricus Μ 7 )麗H 度为~ 108cfu/mL，月斤述季也蒙毕赤酉孝母Γ 2 i? (Pichia guilliermondi)与德氏等\Jff (Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus M7)^] 菌悬液体积比为1: 9~146. 根据权利要求1或2所述酵母菌菌株或权利要求3或4或5所述发酵剂在发酵米制品中 的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述发酵米制品为米乳饮料。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述酵母菌菌株或所述发酵剂在米乳饮料 中的应用包括以下步骤： 1) 混合:称取米粉，加水调浆，将脱脂乳粉配制成10%的脱脂乳加入米浆中，并添加白砂 糖，搅拌均匀，得到混合米浆； 2) 均质:混合米浆采用一次均质； 3 )糊化:置于沸水浴中糊化，不断搅拌，防止糊化不均匀； 4)冷却:将糊化后的混合米浆迅速冷却至40 °C以下； 5 )接种、发酵:向冷却后的混合米浆中接种发酵菌种，置于恒温培养箱中发酵； 6)发酵结束后得到成品，于4°C条件下储藏。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤2)均质压力在10-40MPa，所述步 骤3)糊化时间30min。10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤5)发酵菌株添加量为混合米浆 的4%~5%，发酵温度为35~37 °C，发酵时间10~12h。
【文档编号】C12N1/20GK106047733SQ201610550316
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月13日
【发明人】牛猛, 赵思明, 李楠楠, 张宾佳, 熊善柏
【申请人】华中农业大学