去除血清白蛋白及其融合蛋白中杂质的方法
【专利摘要】本发明涉及去除血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的方法，该方法的特征在于将血清白蛋白或其融合蛋白吸附或结合于填料填料上，使用包含适量蛋白变性剂的去杂质洗液洗去血清白蛋白或其融合蛋白中包裹的杂质，然后使用不含变性剂的蛋白复性液重新使得血清白蛋白或其融合蛋白复性，最后使用合适的蛋白洗脱液将血清白蛋白或其融合蛋白从填料上洗脱下来。
【专利说明】
去除血清白蛋白及其融合蛋白中杂质的方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的去除方法。
【背景技术】
[0002]血清白蛋白是脊椎动物血楽中含量最丰富的蛋白质。人血清白蛋白(Humanserumalbumin，HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，相对分子质量约为66.5kD，占血浆总蛋白的60%左右。人血清白蛋白是血液系统的重要组分，具有结合、运输内源性与外源性物质，维持血浆PH和血液胶体渗透压，清除自由基及影响动脉血管的渗透性等多种生理功會HiPeters, T.(1995).All About Albumin: B1chemistry ,Genetics and MedicalApplicat1ns ,Academic Press, San Diego]人血清白蛋白在现代医学中是一种重要的临床生物制品，主要作为血浆容量扩充剂，可用于治疗出血性休克、脑缺血、烧伤、红细胞过多症、白蛋白过少症等多种疾病。
[0003]作为一种脂肪酸等物质的输运蛋白，白蛋白、尤其是从毕赤酵母中获得的重组白蛋白、常常包裹有一些色素，导致白蛋白呈现为黄色、甚至是深黄色，而不是普通蛋白的无色、或淡黄色(高浓度时)。人血清白蛋白临床使用量大，每针剂量通常达10g，而大多数蛋白质药物如细胞因子、激素的剂量仅为yg或ng级，因此相对其它蛋白质药物来说，人血清白蛋白的纯度要求更为严格。产品中即使有害杂质为0.001 %，每针剂仍会有0.1mg的杂质被注入体内，对病人可造成极大的危害。无论是从血浆中提取的人血清白蛋白(pHSA)，还是利用基因工程制备的重组人血清白蛋白(rHSA)，HSA的去除杂质的技术都是影响其产业化的一种关键技术。只有降低其去杂质技术成本，才能使HSA更广泛的应用于医疗，更好的服务于病人。因此，国内外已有许多科研机构致力于此方面的研究，但效果不甚理想。
[0004]通过世界各国科研者对重组白蛋白的努力研究，已经摸索出一些重组白蛋白的纯化方法。重组白蛋白的常见纯化步骤:对分离出来的rHSA进行阳离子交换层析、疏水层析、阴离子交换层析、盐析等初步的纯化步骤，然后经过螯合树脂、硼酸或硼酸盐处理或二次疏水层析等进一步的纯化过程，得到稳定的、较高纯度的rHSA。日本的Green Cross公司第一步运用STREAMLINE纯化方法，将68°C条件下加热灭活蛋白酶的发酵液通过阳离子扩张床进行纯化，目的rHSA吸附，酵母菌体及其它杂质流穿，再经过疏水及阴离子交换层析得到rHSA，从而缩短了纯化周期。英国的Delta公司申请的PCT专利W000/44772采用的纯化步骤是SP FF阳离子层析(洗脱含rHSA的结合组分)、DEAE_FF阴离子层析(洗脱含rHSA的结合组分)、DBA亲和层析(洗脱含rHSA的结合组分)、PBA亲和层析(收集流穿)、SP-FF阳离子层析(收集流穿)、DEAE-FF阴离子层析(收集流穿)，最后得到单体纯度大于99.9%的rHSA。目前虽然日本和美国对重组人血清白蛋白的纯化工艺处于世界领先地位，但是其生产工艺成本较高，步骤繁琐，严重制约着重组人血清白蛋白的大规模生产。
[0005]另外重组血清白蛋白融合蛋白也具有很好的药用价值。如干扰素-a(IFN-a)有着很好的抗病毒活性，对乙型肝炎和丙型肝炎有很好的疗效。但由于其体内半衰期非常短，不仅影响其疗效而且给患者带来不便。研究人员将干扰素a_2b基因与HSA基因融合，利用毕赤酵母作为宿主细胞表达融合蛋白，则会使其半衰期大大延长，而且干扰素a_2b的体内活性也会增强。
[0006]无论是血清白蛋白还是重组血清白蛋白融合蛋白的生产，都面临着清除杂质的难题。白蛋白中的杂质有两种，一种与白蛋白没有直接相互作用的其他蛋白或小分子，这些蛋白可以使用常规的沉淀、色谱分离等方法去除。另一种是包裹在白蛋白内部、或与白蛋白有很强相互作用的小分子，如色素等，这是由于白蛋白作为一种输运蛋白的特性导致的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种去除血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的方法。使用本发明方法，可以有效去除血清白蛋白或其融合蛋白中包裹的内源性杂质，如色素等。
[0008]本发明的技术方案为:一种去除血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的方法，其特征在于包括以下步骤:
[0009](I)使用去杂质洗液对结合或吸附在填料上的血清白蛋白或其融合蛋白进行去杂质操作；
[0010](2)然后使用蛋白复性液对可逆变性的血清白蛋白或其融合蛋白进行复性；
[0011](3)然后用蛋白洗脱液将血清白蛋白或其融合蛋白从填料上洗脱下来。
[0012]其中所述去杂质洗液是可以使血清白蛋白或其融合蛋白可逆地变性的溶液，所述蛋白复性液是不含有蛋白变性剂的溶液，所述蛋白洗脱液是能够将蛋白从填料上洗脱下来的溶液。
[0013]在优选的实施方案中，所述去杂质洗液包含蛋白变性剂、无机溶剂和有机溶剂。蛋白变性剂包括但不限于选自尿素、盐酸胍、低PH变性盐，丙酮或适宜浓度的碱液中的一种或几种。术语“低PH变性盐”的含义可由其字面意思来理解，S卩pH值较低的可以使蛋白质变性的盐。有机溶剂包括但不限于选自酒精、甘油、异丙醇或肉豆蔻酸的一种或几种。无机溶剂包括但不限于水和/或液氨。
[0014]本领域技术人员可以通过常规实验来确定蛋白质变性剂和有机溶剂的适宜浓度。在优选的实施方案中，蛋白变性剂尿素的浓度在4-8M的范围内，更优选为约6M。在优选的实施方案中，有机溶剂如酒精的浓度为3% —60%，更优选为10%-33%在更优选的实施方案中，所述去杂质洗液包含适宜浓度的尿素和酒精。更优选地，所述去杂质洗液包含30-33%的酒精，6M尿素。其中酒精浓度的百分比为体积/体积比。在一个特别优选的实施方案中，本发明的去杂质洗液含有6M尿素、30 %酒精、20mM Tris-HCl (pH 7.4)。在另一个特别优选的实施方案中，本发明的去杂质洗液含有33%酒精、6M尿素、20mM Tris-HCl(pH 7.4)。
[0015]本发明中，蛋白质复性液可以是本领域中常用于使蛋白质复性的溶液，其成分可由本领域技术人员容易地确定。蛋白质复性液可以是缓冲液，也可以不是缓冲液。在本发明的优选实施方案中，蛋白质复性液可以是所述填料(也可以是装填有该填料的层析柱或色谱柱)的平衡缓冲液。在一个特别优选的实施方案中，本发明的蛋白质复性液含有20mMTris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl。
[0016]本发明中，蛋白质洗脱液可以是本领域中常用于从填料(也可以是装填有该填料的层析柱或色谱柱)上洗脱蛋白质的洗脱液。在一些实施方案中，所述蛋白质洗脱液含有咪唑。在进一步优选的实施方案中，所述蛋白质洗脱液含有浓度150-750mM的咪唑，更优选含有浓度为约500mM的咪唑。在一个特别优选的实施方案中，本发明的蛋白质洗脱液含有20mMTris-HCl pH 7.4、500mM NaCl、500mM咪唑。
[0017]本发明中，术语“填料”指所有能够结合或吸附血清白蛋白或其融合蛋白的物质。填料包括但不限于:亲和层析填料如N1-NTA填料、抗白蛋白抗体填料;离子交换色谱填料、共价色谱填料。在一些实施方案中，所述填料被装填于层析柱或色谱柱中，待去除杂质的血清白蛋白或其融合蛋白结合或吸附于该层析柱或色谱柱中。术语“亲和层析”指层析填料是用具有特殊结构的亲和分子制成的固相吸附剂，当要被分离的物质通过层析填料时，与吸附剂具有亲和力的物质就会被吸附而滞留在层析填料中，没有亲和力的物质直接流出，从而与被分离的物质分开，然后用适当的洗脱液改变结合条件将结合的物质洗脱下来。术语“离子交换色谱”也可称为“离子交换层析”，指以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行的层析分离方法。术语“共价色谱”也可称为“共价层析”，指作为层析填料的固相载体与流经它的待分离物质发生化学反应并以共价键相连，洗去不与该固相载体反应的其它物质之后，再以另一化学反应使目的物从载体上释放洗脱下来。
[0018]本发明中所述“血清白蛋白”包括但不限于人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)等。
[0019]本发明所述的“融合蛋白”指包含血清白蛋白与其它蛋白的氨基酸序列的嵌合蛋白。制备融合蛋白的方法是本领域公知的，通常融合蛋白由本领域熟知的体外重组技术产生。
[0020]本发明中所使用的术语“包括”、“包含”、“含有”包括以下含义:包含所列举的成分、基本由所列举的成分组成或者由所列举的成分组成。
[0021]与现有技术相比，本发明具有如下优点:(I)去杂质洗液、复性液及其洗脱液成分成本低廉，且溶液配制方法简单；(2)无环境污染；(3)周期短，适用于工业化生产；(4)步骤简单，效果明显;能够应用于血清白蛋白及其融合蛋白的大规模生产。
【附图说明】
[0022]图1是对重组人血清白蛋白(左)及融合蛋白ATF-HSA(右)的杂质(如色素)的洗脱过程。
[0023]图2是经去杂质洗液和复性液处理的和未经去杂质洗液和复性液处理的重组人白蛋白的对比，左边为经去杂质洗液和复性液处理的白蛋白，右边为对照，即未经去杂质洗液和复性液处理的白蛋白。
[0024]图3是经过去杂质洗液和蛋白质复性液处理的和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的重组白蛋白样品的紫外-可见光谱对比图。
[0025]图4是经过去杂质洗液和蛋白质复性液处理(图中表示为“除过色素”)的和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理(图中表示为“未除色素”)的重组人血清白蛋白和ATF-HSA融合蛋白的SDS-PAGE的电泳图。
[0026]图5是经过去杂质洗液和蛋白质复性液处理的(图中表示为“经过本专利处理的”或“经过本专利除过色素的”)重组人血清白蛋白和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的(图中表示为“未经本专利处理的”或“未经本专利除过色素的”)重组人血清白蛋白的荧光发射光谱图。其中上图是在波长为370nm激发光激发下的荧光发射光谱图；下图是在不同浓度的ANS荧光探针的条件下，检测到的荧光最大发射值曲线图(激发波长为370nm，荧光强度检测波长为475nm，白蛋白浓度恒为10μΜ)ο
[0027]图6是经过去杂质洗液和蛋白质复性液处理的(图中表示为“经过本专利处理过的”)重组人血清白蛋白和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的(图中表示为“未用本专利处理过的”)重组人血清白蛋白经AKTA Pure处理后的色谱图。
[0028]图7是经过去杂质洗液和复性液处理的和未经去杂质洗液和复性液处理的重组ATF-HSA融合蛋白的对比，左边为经过去杂质洗液和复性液处理的重组ATF-HSA，右边为未经去杂质洗液和复性液处理的重组ATF-HSA。
[0029]图8是是经过去杂质洗液和蛋白质复性液处理的和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的重组白蛋白融合蛋白(ATF-HSA)样品的紫外-可见光谱对比图。
[0030]图9是经过去杂质洗液和蛋白质复性液处理的(图中表示为“经过本专利处理的”)和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的(图中表示为“未经本专利处理的”)重组人血清白蛋白融合蛋白(ATF-HSA)的荧光发射光谱图。其中上图是在波长为370nm激发光激发下的荧光发射光谱图；下图是在不同浓度的ANS荧光探针的条件下，检测到的荧光最大发射值曲线图(激发波长为370nm，荧光强度检测波长为475nm，白蛋白浓度恒为ΙΟμΜ)。
[0031 ] 图10是PAItrap-HSA活性检测原理示意图。
[0032]图11是实施例3中经过去杂质洗液和蛋白质复性液处理(图中表示为“除色素”)的和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理(图中表示为“未除色素”)的重组PAItrap-HSA活性检测结果。
【具体实施方式】
[0033]以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
[0034]实施例一去除重组人血清白蛋白(带有6个His标签)中的杂质(如色素等)
[0035]I)溶液配制
[0036]去杂质洗液:6M尿素、30%酒精、20mM Tris-HCl (pH 7.4)，用0.22μπι的滤膜进行抽滤处理，所得抽滤液即为去杂质洗液。
[0037]蛋白复性液:20mMTris-HCl(pH 7.4)、500mM NaCl。
[0038]蛋白洗脱液:20mMTris_HCl(pH7.4)、500mM NaCl、500mM咪唑。
[0039]2)使用质粒载体pPICZ在酵母中表达重组人血清白蛋白，取发酵得到的菌液2L离心30分钟(7500rpm，Hitachi Koki CR22N高速冷冻离心机，R9A2转头)去除沉淀，然后将上清液用孔径0.45μπι的滤膜进行抽滤，得抽滤液。将抽滤液流经已经平衡好的N1-NTA柱(GE公司，流速5ml/min,柱体积25ml)，此时抽滤液中带有6个Hi s标签的重组人血清白蛋白就会结合在N1-NTA柱上。
[0040]3)用两个柱体积的平衡液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl)冲洗N1-NTA柱。[0041 ] 4)用三个柱体积的去杂蛋白溶液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑)对N1-NTA柱继续冲洗，并用紫外检测仪进行检测，直至检测到的蛋白质吸收光谱消失，表明杂蛋白被洗脱干净。
[0042]5)用去杂质洗液(20mM Tris-HCl pH 7.4，30%的酒精，61尿素)对附_1^\柱进行10个柱体积的冲洗，可以看到有大量的色素被洗脱下来(图1)，并对洗脱下来的色素进行收集。
[0043]6)用蛋白复性液(20mM Tris-HCl pH TA, 500mM NaCl)对 N1-NTA 柱再进行 5-7 个柱体积的冲洗，以使蛋白复性。
[0044]7)用蛋白洗脱液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl，500mM咪唑)对蛋白进行洗脱，并用紫外检测仪进行检测，当有蛋白质流出时，对流出的蛋白进行收集，此即为重组人血清白蛋白。
[0045]8)对收集的蛋白用透析液(20mM Tris-HCl pH 8.0,50mM NaCl)进行透析两次，每次透析至少进行2个小时。也可以直接对水透析，之后抽冻成重组人血清白蛋白冻干粉。
[0046]9)对经上述步骤处理过的重组人血清白蛋白与未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理(即按上述步骤处理但不进行第5)和第6)步)的重组人血清白蛋白进行颜色对比(附图2)，结果显示未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清白蛋白(附图2右)包裹的色素等杂质很多，而经上述步骤处理过的重组人血清白蛋白(附图2左)所包裹的色素等杂质基本去除干净。其中进行比对的两个样品的蛋白浓度均为4mg/ml。
[0047]10)对经上述步骤处理过的重组人血清白蛋白与未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的重组人血清白蛋白进行紫外-可见光谱分析(图3)，结果比对显示:在相同的浓度下，经上述步骤处理过的重组人血清白蛋白所含的杂质吸收光谱(大约在360nm左右)明显下降。其中进行比对的两个样品的蛋白浓度均为lmg/ml。
[0048]11)将经上述步骤处理过的重组人血清白蛋白和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清白蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳(图4)，结果显示经上述步骤处理过的重组人血清白蛋白和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清白蛋白在SDS-PAGE凝胶电泳上的条带位置相同，其分子量均为66.5kDa，表明去杂质洗液和蛋白质复性液处理步骤不影响重组人血清白蛋白的分子量，经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清白蛋白分子链不会发生断裂。
[0049]12)应用ANS探针对经上述步骤处理过的重组人血清白蛋白和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清白蛋白进行活性检测(图5)，结果显示经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清白蛋白活性明显高于未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清白蛋白活性，且与注射用人血清白蛋白的活性基本相同。
[0050]13)应用AKTA Pure(注:柱子型号为SuperdexTM 200，10/300GL，牛血清白蛋白在此型号柱的出峰体积约为13.8ml)对注射用HSA、经上述步骤处理过的重组人血清HSA以及未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清HSA进行色谱分析(图6)，结果表明经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清HSA纯度远高于注射用HSA，也高于未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组人血清HSA。
[0051 ]实施例二去除融合蛋白ATF-HSA(带有6个His标签)的杂质(如色素等)
[0052]I)溶液配制
[0053]去杂质洗液、蛋白复性液和蛋白洗脱液的配制同实施例一。
[0054]2)使用质粒载体pPICZ在酵母中表达重组人血清白蛋白融合蛋白ATF-HSA(ATF是人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的N末端片段)，取发酵得到的菌液2L离心30分钟(7500rpm,Hitachi Koki CR22N高速冷冻离心机，R9A2转头)去除沉淀，然后将上清液用孔径0.45μπι的滤膜进行抽滤，得抽滤液。将抽滤液流经已经平衡好的N1-NTA柱(GE公司，流速5ml/min，柱体积25ml)，此时抽滤液中带有6个His标签的ATF-HSA就会结合在N1-NTA柱上。
[0055]3)用两个柱体积的平衡液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl)冲洗N1-NTA柱。
[0056]4)用三个柱体积的去杂蛋白溶液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl，5mM咪唑)对N1-NTA柱继续冲洗，并用紫外检测仪进行检测，直至检测到的蛋白质吸收光谱消失，表明杂蛋白被洗脱干净。
[0057]5)用去杂质洗液(20mM Tris-HCl pH 7.4，30%的酒精，61尿素)对附_1^\柱进行10个柱体积的冲洗，可以看到有大量的色素被洗脱下来(附图1)，并对洗脱下来的色素进行收集。
[0058]6)用蛋白复性液(20mM Tris-HCl pH TA, 500mM NaCl)对 N1-NTA 柱再进行 5-7 个柱体积的冲洗，以使蛋白复性。
[0059]7)用蛋白洗脱液(20mM Tris-HCl pH 7.4,500mM NaCl，500mM咪唑)对蛋白进行洗脱，并用紫外检测仪进行检测，当有蛋白质流出时，对流出的蛋白进行收集，此即为重组人血清白蛋白融合蛋白ATF-HSA。
[0060]8)对收集的蛋白用透析液(20mM Tris-HCl pH 8.0，50mM的NaCl)进行透析两次，每次透析至少进行2个小时，之后也可抽冻成重组人血清白蛋白融合蛋白(ATF-HSA)冻干粉。
[0061 ] 9)对经上述步骤处理过的重组ATF-HSA与未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理(即按上述步骤处理但不进行第5)和第6)步)的重组ATF-HSA进行颜色对比(图7)，结果显示未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组ATF-HSA(图7右)色素等杂质很多，而经上述步骤处理过的重组ATF-HSA(图7左)色素等杂质基本去除干净。其中进行比对的两个样品的蛋白浓度均为2.8mg/ml。
[0062]10)对经上述步骤处理过的重组ATF-HSA与未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组ATF-HSA进行紫外-可见光谱分析(图8)，结果比对显示:经上述步骤处理过的重组ATF-HSA所含的杂质吸收光谱(大约在360nm左右)明显下降。其中进行比对的两个样品的蛋白浓度均为lmg/ml。
[0063]11)将经上述步骤处理的和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的重组ATF-HSA进行SDS-PAGE凝胶电泳(图4)，结果显示经上述步骤处理的和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的重组ATF-HSA在SDS-PAGE凝胶电泳上的条带位置相同，其分子量均为84KDa，表明去杂质洗液和蛋白质复性液处理步骤不会影响重组白蛋白融合蛋白ATF-HSA的分子量，即去杂质洗液和蛋白质复性液处理步骤不会使重组白蛋白融合蛋白分子链断裂。
[0064]12)应用ANS探针对经上述步骤处理的重组ATF-HSA和未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的重组ATF-HSA进行活性检测(图9)，结果显示经上述步骤处理的重组ATF-HSA活性明显高于未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理的重组ATF-HSA活性。
[0065]实施例三去除重组血清白蛋白融合蛋白PAItrap-HSA(带有6个His标签)的杂质(如色素等)
[0066]PAItrap是基于尿激酶的蛋白酶结构域通过突变构建的人工PA1-1抑制剂，其与野生型尿激酶相比含有以下突变位点:3195六，637匕1?，1?2171^(:1224，附450.?41廿&?在体内会很快被内源性的PA1-1所灭活，导致其半衰期较短，将其与HSA融合大大延长了其在体内的半衰期(约7倍)。
[0067]I)溶液配制
[0068]去杂质洗液:33%的酒精，6M尿素。
[0069]蛋白复性液和蛋白洗脱液的配制同实施例一。
[0070]2)使用的质粒载体pPICZaA在毕赤酵母X33中表达重组血清白蛋白融合蛋白PAItrap-HSA，目的蛋白进行胞外分泌表达，每天加入1%甲醇诱导表达四天后，将发酵菌液离心40分钟(8000rpm，Hitachi Koki CR22N高速冷冻离心机，R9A2转头)去除沉淀，然后将上清液用孔径0.45μπι的过滤膜抽滤，得抽滤上清，后、将抽滤上清流经已经平衡好的N1-NTA柱(GE公司，流速15ml/min，柱体积20ml)，此时抽滤上清中带有6个His标签的重组人血清白蛋白融合蛋白就会结合在N1-NTA柱上。
[0071]3)用5个柱体积的平衡液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl)冲洗N1-NTA柱。
[0072]4)用去杂质洗液(33 %的酒精、6M尿素)对N1-NTA柱进行8个柱体积的冲洗，可以看到有大量的色素被洗脱下来，并对洗脱下来的色素进行收集。
[0073]5)用蛋白复性液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl)对N1-NTA柱再进行6个柱体积的冲洗，以使蛋白复性。
[0074]6)用蛋白洗脱液(20mM Tris-HCl pH 7.4，500mM NaCl，500mM咪唑)对蛋白进行洗脱，并用紫外检测仪进行检测，当有蛋白质流出时，对流出的蛋白进行收集，此即为重组人血清白蛋白融合蛋白PAItrap-HSA.
[0075]7)对收集的蛋白用透析液(20mM Tris-HCl pH 7.4，150mM的NaCl)进行透析两次，每次透析至少进行2个小时。
[0076]8)透析后离心20分钟(20000rpm，Hitachi Koki CR22N高速冷冻离心机，R20A2转头)去除沉淀。所得蛋白溶液用Millipore超滤管(1000Da)进行浓缩，然后分装，-80°C保存。
[0077]9)用已报道的显色法(chromogenic assay) [Gorlatova NV(2003).Mapping of aconformat1nal epitope on plasminogen activator inhibitor-1 by randommutagenesis.1mplicat1ns for serpin funct1n.J B1l Chem.]进行酉每活测定和对比分析。
[0078]其反应原理如图10所示，在10yL体积的反应体系中，加入不同浓度的PAItrap-HSA与PA1-1反应1min ,PAItrap-HSA会与PA1-1结合，然后加入uPA反应1min，未与PAItrap-HSA结合的PA1-1会共价结合到uPA的催化中心上导致其活性丧失。然后加入发光底物S2444，uPA能特异识别其中的酶切位点并将其发色基团-P-硝基苯胺(pNA)切下来，最后通过酶标仪检测405nm的吸光度值就可以测定uPA和PA1-1的酶活并进而间接计算出PA I trap -HSA 的活性。
[0079]具体测定过程:
[0080](a)材料
[0081]经上述步骤纯化的和与未经去杂质洗液和蛋白质复性液纯化(即按上述步骤纯化但不进行第4)和第5)步)的PAItrap-HSA ,PA1-1 14-1B，uPA，uPA底物S-2444。
[0082]Buffer:20mM Tris-HCl pH7.4,150mM NaCl，0.I%BSA.0.22ym孔径滤膜过滤。
[0083](b)步骤
[0084]用考马斯亮蓝法测定各蛋白质质量浓度，换算成摩尔浓度。
[0085]稀释蛋白:PAItrap-HSA从ΙΟμΜ四倍往下稀释六个梯度，PA1-1 14-1Β和uPA稀释至ΙΟΟηΜ，方便后面根据需要加入到ΙΟΟμΙ反应体系中配制成实验所需的终浓度。
[0086]确定uPA和PA1-1在测定体系中的终浓度:在某一浓度下uPA切割底物在1min内产生的信号较强、线性关系良好;PA1-1的浓度是经过摸索确定的能刚好完全抑制或者接近完全抑制(90%以上)uPA时的浓度。uPA 1nM,PA1-1 18nM。
[OO87 ] 对于经上述步骤纯化的和未经上述步骤纯化的PA 11 rap -H SA，均按照以下顺序加入样品:
[0088]①正对照80μ1buffer+?θμ? uPA+ΙΟμΙ 800μΜ S-2444
[0089]②负对照62μ1buffer+?θμ? uPA+18yl ΡΑΙ-1 室温孵育lOmin+ΙΟμΙ 800μΜ S-2444
[0090]③?⑨52μ1buffer+?θμ? PAItrap-HSA+18yl PA1-1 室温孵育lOmin+ΙΟμΙ uPA室温孵育lOmin+ΙΟμΙ 800μΜ S_2444(PAItrap_HSA浓度从低到高:2.44141E-10?1.0E-6M)
[0091]其中将PAItrap-HSA与PA1-1预先孵育lOmin，接着加入UPA(1nM)混匀在室温下反应1min，每一步加入溶液后要充分混匀且尽量避免产生气泡，最后加入发光底物S2444(Chromogenix)并立即放入B1Tek Synergy 4酶标仪中在405nm处，15s/read进行检测lOmin。每个测试至少重复3次。PAItrap-HSA的IC50使用GraphPad Prism 5软件中的非线性回归(nonlinear regress1n)进行拟合。
[0092]结果见图11，结果显示，经过去杂质洗液和蛋白质复性液处理处理过的重组PAItrap-HSA活性与未经去杂质洗液和蛋白质复性液处理过的重组PAItrap-HSA(没有第4、5两步，其余步骤相同)活性基本一致，说明使用去杂质洗液和蛋白质复性液对重组PAItrap-HSA进行除杂不会影响蛋白的酶活。
[0093]以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
【主权项】
1.去除血清白蛋白或其融合蛋白中杂质的方法，其特征在于包括以下步骤: (1)使用去杂质洗液对结合或吸附在填料上的血清白蛋白或其融合蛋白进行去杂质操作； (2)然后使用蛋白复性液对可逆变性的血清白蛋白或其融合蛋白进行复性； (3)然后用蛋白洗脱液将血清白蛋白或其融合蛋白从填料上洗脱下来。 其中所述去杂质洗液是可以使血清白蛋白或其融合蛋白可逆地变性的溶液，所述蛋白复性液是不含有蛋白变性剂的溶液，所述蛋白洗脱液是能够将蛋白从填料上洗脱下来的溶液。2.权利要求1的方法，其中所述去杂质洗液包含蛋白变性剂、有机溶剂和无机溶剂。3.权利要求2的方法，其中所述蛋白质变性剂是选自尿素、盐酸胍、低pH变性盐，丙酮或适宜浓度的碱液中的一种或几种;优选，所述蛋白质变性剂是尿素，浓度为4-8M;更优选，所述蛋白质变性剂是尿素，浓度为6M。4.权利要求2的方法，其中所述有机溶剂是选自酒精、甘油、异丙醇或肉豆蔻酸或其盐例如肉豆蔻酸钠中的一种或几种。5.权利要求4的方法，其中所述有机溶剂是酒精，浓度为3% —60 % ;优选，酒精的浓度为 30-33%。6.权利要求2的方法，其中所述无机溶剂是水和/或液氨。7.权利要求1的方法，其中所述蛋白洗脱液含有咪唑，浓度为150-750mM。8.权利要求7的方法，其中咪唑的浓度为500mM。9.权利要求1的方法，其中填料是亲和层析填料、离子交换色谱填料或共价色谱填料。10.权利要求9的方法，其中亲和层析填料是N1-NTA填料或抗白蛋白抗体填料。
【文档编号】C07K1/14GK106046149SQ201610486534
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】黄明东, 李世杰, 袁彩, 陈卓, 陈锦灿, 雪光浦, 郑科
【申请人】中国科学院福建物质结构研究所