一种苯胺绿人工抗原的制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种苯胺绿人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以N,N?二甲基苯胺、苯甲醛衍生物为原料，Amberlyst 15 树脂为催化剂，在一定条件下合成苯胺绿半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：采用活泼酯和重氮化法分别将获得的半抗原与牛γ球蛋白(BGG)偶联，制备苯胺绿的人工抗原即苯胺绿?牛γ球蛋白形成相应全抗原。所制备的苯胺绿人工抗原可进行动物免疫，取得相应的苯胺绿抗体，可用于各种苯胺绿免疫分析法的研究，为苯胺绿的检测提供更加方便快速准确的途径。
【专利说明】
一种苯胺绿人工抗原的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种苯胺绿人工抗原的制备方法。
【背景技术】
[0002] 苯胺绿在中文中又称孔雀石绿；中国绿;碱性孔雀石绿；品绿;盐基块绿；英文名 称:MalachiteGreen oxalate,苯胺绿是绿色有金属光泽的晶体，易溶于水，溶于乙醇、甲醇 和戊醇，水溶液呈蓝绿色，pHO.O以下呈黄色；最大吸收波长616.9nm.是有毒的三苯甲烷类 化学物，既是染料，也是杀菌剂，可致癌。其结构式为：
[0004] 苯胺绿中的化学功能团三苯甲烷可致癌，很多国家已经禁用，但仍有渔民在防治 鱼类感染真菌时使用。也有运输商用作消毒，以延长鱼类在长途贩运中的存活时间。
[0005] 目前，对苯胺绿的检测主要依靠高效液相色谱法(HPLC)，气相色谱(GC)，薄层色谱 (TLC)，质朴(MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能 达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一 种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方 法，该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的苯胺绿 人工抗原的制备方法，制备的苯胺绿人工抗原可用于免疫制备具有特异性的苯胺绿抗体， 进一步用于检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种苯胺绿人工抗原 的制备方法，所制备的苯胺绿人工抗原可进行动物免疫，取得相应的苯胺绿抗体，可用于各 种苯胺绿类免疫分析法的研究，为苯胺绿的检测提供更加方便快速准确的途径。
[0007] -种苯胺绿人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008] (1)制备人工半抗原：
[0009] (a)将N，N_二甲基苯胺和4-羧基苯甲醛以摩尔比为2:1的比例加入圆底烧瓶中， 100°C下搅拌反应6小时;反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶得到白色固体产物 I;
[00?0] (b)称取2g产物I，加入苯30ml以及5gAmberlyst 15树脂催化剂，放入圆底烧瓶中， 在氮气保护、130°C下回流搅拌过夜;反应结束后，将溶剂减压转干，用乙醚提取得产物Π ;
[0011] (c)将产物Π 经硅胶柱层析纯化，提取得到苯胺绿半抗原4-(双(4-二甲胺基）苯 基）甲基苯甲酸(4-MGC)白色固体；
[0012] (2)制备苯胺绿人工抗原：
[0013] (d)称取0 · 425g半抗原和N-羟基琥拍酰亚胺0 · 225g，溶于10 · OmlN，N-二甲基甲酰 胺中，再慢慢滴加溶解有〇. 255g N，N-二环己基碳二亚胺的10.0 mlN，N-二甲基甲酰胺，边滴 加边磁力搅拌，结束后20 °C磁力搅拌过夜，得到A液；
[0014] (e)将牛γ球蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
[0015] ⑴在常温磁力搅拌条件下，将A液逐滴加入到10ml的B液中，得到人工抗原混合液 4°C冰箱内磁力搅拌过夜；
[0016] (g)制备钠离子浓度为0. lmol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4;
[0017] (h)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，4 °C搅拌透析，每4小时换一次缓冲液， 透析2天，紫外扫描透析液无小分子吸收峰时，将产物离心取上清，在无菌条件下通0.2μπι的 滤膜，即得到苯胺绿人工抗原:苯胺绿-牛γ球蛋白。
[0018] 由于苯胺绿的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必 须将其与大分子载体比如牛γ球蛋白连接形成苯胺绿抗原后，才能刺激机体产生相应的苯 胺绿抗体。本发明在制备苯胺绿人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变 其结构，保留了抗原决定簇。在苯胺绿半抗原和牛γ球蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定 簇，所获得的苯胺绿人工抗原保持了苯胺绿的结构特异性，有利于相应苯胺绿抗体的产生。
[0019] 本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以Ν，Ν-二甲基苯胺、 苯甲醛衍生物为原料，Amberlyst 15树脂为催化剂，在一定条件下合成苯胺绿半抗原;第二 步为人工抗原的制备与检测：采用活泼酯和重氮化法分别将获得的半抗原与牛γ球蛋白 (BGG)偶联，制备苯胺绿的人工抗原即苯胺绿-牛γ球蛋白形成相应全抗原。
[0020] 本发明制备得到的苯胺绿人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
[0021] 偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率）的方法虽然很 多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量)的原理建立起来的。分 光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子 浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱 图迭加的性质。
[0022] 摩尔吸收系数ε :配制苯胺绿半抗原浓度为0，5，10，20，30，40ug/ml的roS溶液，通 过紫外扫面图可知苯胺绿半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度 做平行样。摩尔吸光系数计算为ε =吸光值/摩尔浓度。本发明计算得e = 5014.35L/mol
[0023] 偶联物蛋白浓度的测定:配制浓度为0，10，20，30，40,60，80，100，120ug/ml的牛γ 球蛋白PBS溶液lml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30°C水浴温热5分钟，每个浓度 做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比 例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。本发明计 算得苯胺绿抗原的蛋白浓度为3.183mg/ml。
[0024] 偶联比测定:配制100ug/ml的牛γ球蛋白ros溶液，将偶联物用ros稀释到100ug/ ml，在276处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1，A2，则偶联比率γ为：γ = [ (Ai-A2)/ ε]/(100Χ 10-3/65000)，本发明计算得 γ ~17。
[0025] 其中ε为摩尔吸光系数(L/mol)，65000为牛γ球蛋白的分子量，100Χ 10-3为牛γ球 蛋白浓度(ug/ml)。
[0026] 本发明的有益效果:本发明合成了苯胺绿的人工抗原，合成工艺先进，特异性强， 得到的苯胺绿人工抗原用于免疫新西兰白兔，检测结果表明，苯胺绿人工抗原的免疫血清 的效价为1:72000,完全可用于免疫分析中，为苯胺绿的检测提供更加方便快速准确的途 径。
【附图说明】
[0027] 图1是苯胺绿人工半抗原的液相色谱图。
[0028]图2是苯胺绿人工半抗原的质谱图。
[0029]图3是苯胺绿人工抗原制备前后的紫外扫描图。
【具体实施方式】
[0030] 苯胺绿人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以N，N_二甲基苯 胺、苯甲醛衍生物为原料，Amberlyst 15树脂为催化剂，在一定条件下合成苯胺绿半抗原； 第二步为人工抗原的制备与检测:采用活泼酯和重氮化法分别将获得的半抗原与牛γ球蛋 白（BGG)偶联，制备苯胺绿的人工抗原即苯胺绿-牛γ球蛋白形成相应全抗原。
[0031] 实施例1
[0032] (1)制备人工半抗原半抗原4-MGC的合成：
[0033] (a)将Ν，Ν_二甲基苯胺（3g)和4-羧基苯甲醛以摩尔比为2:1加入圆底烧瓶中，100 °C下搅拌反应6小时;反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶得到白色固体产物I; [0034] (b)称取2g产物I，加入苯30ml以及5gAmberlySt 15树脂催化剂一起放入圆底烧瓶 中，氮气保护，130°C下回流搅拌过夜;反应结束后，将溶剂减压转干，用乙醚提取得产物Π ; [0035] (c)将产物Π 经硅胶柱层析纯化，提取得到目标半抗原4_(双(4-二甲胺基)苯基） 甲基苯甲酸(4-MGC)白色固体；
[0036] (2)制备苯胺绿人工抗原苯胺绿-BGG的合成：
[0037] (d)称取0.425g半抗原4-MGC和N-羟基琥珀酰亚胺0.225g溶于10.0mlN，N-二甲基 甲酰胺中，存放于烧杯中，再将溶解有〇.255g N，N-二环己基碳二亚胺的10.0mlN，N-二甲基 甲酰胺的溶液慢慢滴加，边滴加边磁力搅拌，结束后20°C磁力搅拌过夜，得到A液；
[0038] (e)将牛γ球蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
[0039] (f)在常温磁力搅拌条件下，将A液逐滴加入到10ml的B液中，得到人工抗原混合 液，4 °C冰箱内磁力搅拌过夜；
[0040] (g)制备钠离子浓度为0. lmol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4;
[0041 ] (h)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，4 °C搅拌透析，每4小时换一次缓冲液， 透析2天，紫外扫描透析液无小分子吸收峰时，将产物离心取上清，在无菌条件下通0.2μπι的 滤膜，即得到苯胺绿人工抗原:苯胺绿-牛γ球蛋白。
[0042] (3)苯胺绿人工抗原的鉴定：
[0043]偶联比测定：估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率）的方法虽然很 多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含量(或相对含量）的原理建立起来的。分 光光度法是利用物质对光的吸收与其浓度呈比例关系的原理分别测定被偶联的两种分子 浓度。在大分子与小分子偶联物中，两种分子均有各自不同的紫外扫描光谱，并表现出光谱 图迭加的性质。
[0044] 摩尔吸收系数ε :配制苯胺绿半抗原浓度为0，5，10，20，30，40ug/ml的roS溶液，通 过紫外扫面图可知苯胺绿半抗原的最大吸收波长为288nm，在288nm处测吸光值，每个浓度 做平行样。摩尔吸光系数计算为ε =吸光值/摩尔浓度。计算得e = 5014.35L/mol
[0045] 偶联物蛋白浓度的测定:配制浓度为0，10，20，30，40，60，80，100，120ug/ml的牛γ 球蛋白PBS溶液lml，加入3ml考马斯亮蓝染色液，立即混匀，30°C水浴温热5分钟，每个浓度 做平行样，在655nm处测吸光值，绘制蛋白浓度与吸光值的关系曲线。将抗原溶液按一定比 例吸收，在655处测得抗原的吸光值，从曲线上得到抗原溶液的相应蛋白浓度值。计算得苯 胺绿抗原的蛋白浓度为3.183mg/ml。
[0046] 偶联比测定:配制100ug/ml的牛γ球蛋白ros溶液，将偶联物用ros稀释到100ug/ ml，在276处测得吸光值，以PBS为空白，测得吸光值A1，A2，则偶联比率γ为：γ = [ (Ai-A2)/ ε]/(100 X10-3/65000)，计算得 γ ~17。
[0047] 其中ε为摩尔吸光系数(L/mol) ,65000为牛γ球蛋白的分子量，100Χ 10_3为牛γ球 蛋白浓度(ug/ml)。
[0048] 苯胺绿人工半抗原的液相色谱图如图1所示，苯胺绿人工半抗原的质谱图如图2所 示，苯胺绿人工抗原制备前后的紫外扫描图如图3所示。
【主权项】
1. 一种苯胺绿人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 制备人工半抗原： (a) 将N，N-二甲基苯胺和4-羧基苯甲醛以摩尔比为2:1的比例加入圆底烧瓶中，100 °C下搅拌反应6小时;反应结束后反应液用乙醚提取，转干，经重结晶得到白色固体产物I; (b) 称取2g产物I，加入苯30ml以及5gAmberlyst 15树脂催化剂的，放入圆底烧瓶中， 在氮气保护、130°C下回流搅拌过夜;反应结束后，将溶剂减压转干，用乙醚提取得产物Π ; (c) 将产物Π 经硅胶柱层析纯化，提取得到苯胺绿半抗原4-(双(4-二甲胺基)苯基） 甲基苯甲酸(4-MGC)白色固体； (2) 制备苯胺绿人工抗原： (d) 称取0.425g半抗原和N-羟基琥珀酰亚胺0.225g，溶于10.0mlN，N-二甲基甲酰 胺中，再慢慢滴加溶解有〇.2558~小-二环己基碳二亚胺的10.〇1111~少-二甲基甲酰胺， 边滴加边磁力搅拌，结束后20°C磁力搅拌过夜，得到A液； (e) 将牛γ球蛋白溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液； (f) 在常温磁力搅拌条件下，将A液逐滴加入到10ml的B液中，得到人工抗原混合液，4 °(：冰箱内磁力搅拌过夜； (g) 制备钠离子浓度为〇. lmol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4; (h) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，4°C搅拌透析，每4小时换一次缓冲液，透 析2天，紫外扫描透析液无小分子吸收峰时，将产物离心取上清，在无菌条件下通0.2μπι的 滤膜，即得到苯胺绿人工抗原:苯胺绿-牛γ球蛋白。
【文档编号】C07K14/47GK106046143SQ201610594859
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月25日 公开号201610594859.9, CN 106046143 A, CN 106046143A, CN 201610594859, CN-A-106046143, CN106046143 A, CN106046143A, CN201610594859, CN201610594859.9
【发明人】叶肖俊
【申请人】杭州莱和生物技术有限公司