一种白喉类毒素的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种白喉类毒素的制备方法，它包括如下步骤：(1)取白喉杆菌培养液，加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20～24％(w/v)，离心，去除沉淀，澄清过滤；(2)加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为21～25％(w/v)，离心，收集沉淀；(3)将沉淀溶解后超滤，即为精制毒素；(4)取精制毒素，加入甲醛溶液，脱毒，即可。本发明方法制备的白喉类毒素纯度高、单体含量高、残余氨基含量高、效力好、毒性低、且制备工艺能规模化生产，工艺稳定，操作易于控制，成本低，生产效率高，应用前景良好。
【专利说明】
一种白喉类毒素的制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物制品领域，具体涉及一种制备白喉类毒素的方法。
【背景技术】
[0002] 白喉(Diphtheria)是由白喉杆菌所引起的一种急性呼吸道传染病，以发热，气憋， 声音嘶哑，犬吠样咳嗽，咽、扁桃体及其周围组织出现白色伪膜为特征。严重者全身中毒症 状明显，可并发心肌炎和周围神经麻痹。
[0003]白喉毒素由白喉棒状杆菌分泌表达，分子量约58KD，包含A、B两个片段，B片段负责 粘附和穿透细胞，A片段具有ADP核糖基转移酶活性，能终止蛋白合成导致细胞死亡。将白喉 毒素精制、脱毒制备成白喉类毒素单苗或多联疫苗后进行预防接种，能有效防止白喉的爆 发流行。根据疫苗不良反应监测，白破(DT)二联、吸附无细胞百白破(DTaP)三联疫苗依然存 在一定的副反应。以DTaP为基础，与b型流感嗜血杆菌疫苗(Hib)、脊髓灰质炎疫苗（IPV)等 单苗联合，开发能减少注射次数、具高附加值的多联疫苗是当前细菌性疫苗的研究热点及 发展趋势。随着多联疫苗的研发，对多联疫苗各成分的质量提出了更高的要求，白喉类毒素 原液的质量也需予以更多的关注。
[0004] 毒素纯度越高，杂质含量越低，有利于降低副反应。当前白喉毒素的提纯工艺均采 用硫酸铵盐析纯化的方法，该方法操作简单，通量高、成本低。
【发明内容】
[0005] 本专利通过硫酸铵盐析方法实现了白喉毒素精制纯化，但工艺过程的精细控制使 得制备的类毒素纯度高、单体含量高、残余氨基含量高，且该工艺能规模化生产，工艺稳定， 应用前景好。
[0006] 本发明提供了一种白喉类毒素的制备方法以及该方法制备得到的白喉类毒素。
[0007] 本发明白喉类毒素的制备方法，它包括如下步骤：
[0008] (1)取白喉杆菌培养液，加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20~24% (w/v)，离心，去 除沉淀，澄清过滤；
[0009] (2)加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为21~25%(w/v)，离心，收集沉淀；
[0010] ⑶将沉淀溶解后超滤，即为精制毒素；
[0011] (4)取精制毒素，加入甲醛溶液，脱毒，即可。
[0012] 步骤(1)中，所述白喉杆菌培养液的白喉毒素絮状单位为160~200Lf/ml。
[0013] 步骤(1)中，所述离心的转速为13000~17000转/分钟，优选15000转/分钟。
[0014]步骤(1)中，离心采用连续流离心机离心;和/或，澄清过滤采用微孔膜筒式滤器进 行澄清过滤。
[0015] 步骤(2)中，加入硫酸铵之前先进行超滤，所述超滤是超滤至原体积的1/6-1/10， 超滤采用膜孔径为10kD的超滤膜。
[0016] 步骤(2)中，所述离心的条件是4000~6000转/分钟，离心的时间为40~60分钟。
[0017] 步骤（3)中，超滤至残余硫酸铵浓度小于千分之一；超滤采用膜孔径为lOkD超滤 膜。
[0018] 步骤（4)中，加入甲醛溶液至甲醛的终浓度为0.4~0.5% (v/v)，脱毒的温度为 36.5~38.5°C，脱毒的时间为30~45天。
[0019]步骤(4)中，加入甲醛溶液前先对精制毒素进行稀释，稀释的倍数为1.5~1.7倍， 然后加入赖氨酸，赖氨酸的终浓度为0.15~0.25% (w/v);
[0020] 本发明还提供了前述方法制备得到的白喉类毒素。
[0021] 综上，本发明方法制备得到的白喉类毒素质量优良，纯度在2150Lf/mgPN以上，并 且其单体含量高达90 %、残余氨基含量高于18mo 1-NH/mo 1DT、效力好、毒性低。此外，本发明 制备方法能规模化生产，工艺稳定，操作易于控制，成本低，生产效率高，应用前景好。
[0022] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0023] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0024]图1 3批白喉类毒素原液280nm下HPLC分析峰型结果，三批峰图高度重合进一步证 明产品的批间一致性。
【具体实施方式】
[0025]菌株：白喉PW8株(CMCC 38007)
[0026]仪器和试剂：
[0027] 仪器:DHP-9272电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；1000L发酵罐，成都 英德生物工程有限公司；GQLY-125N/150N连续流离心机，辽阳阳光制药机械有限公司； FLTR0N超滤器，日本株式会社；SAS011G23J微孔膜筒式滤器，颇尔过滤器(北京)有限公司； 超滤膜，颇尔过滤器(北京)有限公司。
[0028] 试剂：甲醛溶液，广东光华科技股份有限公司;硫酸铵，成都市科龙化工试剂厂。
[0029] 实施例1本发明制备白喉类毒素的方法
[0030] 一、制备方法
[0031] 1.白喉培养
[0032] 检定合格的白喉杆菌启开后经培养基传代，后进行培养，至得到白喉毒素絮状单 位达160Lf/ml的培养液，即可。
[0033] 2.-段盐析收集上清
[0034]培养液中加入硫酸铵至浓度为24% (w/v)，进行一段盐析，连续流离心机13000转/ 分钟离心去除沉淀，再经微孔膜筒式滤器进行澄清过滤，收集上清。
[0035] 3.二段盐析
[0036] 上清液经10KD超滤膜超滤浓缩至原体积的1/6,加入硫酸铵至浓度为21 % (w/v)， 进行二段盐析，4000转/分钟离心60分钟，收集沉淀。
[0037] 4 ·超滤脱盐
[0038] 二盐沉淀经溶液溶解后，用10kD超滤膜超滤脱盐至残余硫酸铵含量小于千分之 一，即为精制毒素。
[0039] 5.脱毒
[0040] 精制毒素用注射用水稀释1.5倍后，加入赖氨酸溶液至其终浓度为0.15% (g/ml)， 加入甲醛溶液至甲醛的终浓度为0.4% (ml/ml)，置38.5°C脱毒30天，即可。
[0041] 二、收率
[0042]经检测，本发明制备方法在培养液体积为500L的情况下，制备白喉类毒素的收率 为 54.7%〇
[0043] 实施例2本发明制备白喉类毒素的方法
[0044] -、制备方法
[0045] 1.白喉类毒素培养
[0046] 检定合格的白喉杆菌启开后经培养基传代，后进行培养，至得到白喉毒素絮状单 位达180Lf/ml的培养液，即可。
[0047] 2.-段盐析收集上清
[0048]培养液中加入硫酸铵至浓度为20% (w/v)，进行一段盐析，连续流离心机15000转/ 分钟离心去除菌体，再经微孔膜筒式过滤器进行澄清过滤，收集上清。
[0049] 3.二段盐析
[0050] 上清液经10KD超滤膜超滤浓缩至原体积的1/8,加入硫酸铵至浓度为23% (w/v)， 进行盐二段析，5000转/分钟离心50分钟，收集沉淀。
[0051 ] 4.超滤脱盐
[0052]超滤去除硫酸铵同实施例1。
[0053] 5.脱毒
[0054] 精制毒素用注射用水稀释1.6倍后，加入赖氨酸溶液至其终浓度为0.2%(g/ml)， 加入甲醛溶液至甲醛的终浓度为0.45% (ml/ml)，置37°C脱毒40天，即可。
[0055] 二、收率
[0056]经检测，本发明制备方法在培养液体积为500L的情况下，制备白喉类毒素的收率 为 62.1%。
[0057]实施例3本发明制备白喉类毒素的方法 [0058] 一、制备方法
[0059] 1.白喉类毒素培养
[0060]检定合格的白喉杆菌启开后经培养基传代，后进行培养，至得到白喉毒素絮状单 位达200Lf/ml的培养液，即可。
[0061 ] 2.-段盐析收集上清
[0062]培养液中加入硫酸铵至浓度为22% (w/v)，进行一段盐析，连续流离心机17000转/ 分钟离心去除菌体，再经微孔膜筒式过滤器进行澄清过滤，收集上清。
[0063] 3.二段盐析
[0064] 上清液经10KD超滤膜超滤浓缩至原体积的1/10,加入硫酸铵至浓度为25% (w/v)， 进行二段盐析，6000转/分钟离心40分钟，收集沉淀。
[0065] 4 ·超滤脱盐
[0066] 超滤去除硫酸铵同实施例1。
[0067] 5.脱毒
[0068]精制毒素用注射用水稀释1.7倍后，加入赖氨酸溶液至其终浓度为0.25% (g/ml)， 加入甲醛溶液至甲醛的终浓度为0.5% (ml/ml)，置36.5°C脱毒45天，即可。
[0069] 二、收率
[0070] 经检测，本发明制备方法在培养液体积为500L的情况下，制备白喉类毒素的收率 为 69.4%。
[0071] 质量检测：
[0072] 1.按现行药典方法对3个实施例白喉类毒素原液样品进行检定。
[0073] 2. TNBS检测白喉类毒素残余氨基数量
[0074] 3. HPLC检测白喉类毒素单体含量 [0075] 检测结果如下表和图1所示：
[0076]表1 3个实施例白喉类毒素原液质量结果统计
[0078]由表1可知，三批白喉类毒素原液纯度、单体含量、残余氨基值均较高，批间一致性 良好。
[0079] 实验结果证明，本发明方法生产出的白喉类毒素原液质量高，不易造成接种副反 应，更多的残余氨基说明抗原完整性好。单体含量高、残留氨基高有利于开发高质量的单苗 或多联疫苗。
[0080] 综上，本发明方法制备的白喉类毒素质量优良，纯度在2150Lf/mgPN以上，单体含 量高达90%，残余氨基含量高于18m 〇l-NH/m〇l TT，且制备工艺能规模化生产，工艺稳定，操 作易于控制，成本低，生产效率高，应用前景良好。
【主权项】
1. 一种白喉类毒素的制备方法，其特征在于： (1) 取白喉杆菌培养液，加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为20~24% (w/v)，离心，去除沉 淀，澄清过滤； (2) 加入硫酸铵至硫酸铵的终浓度为21~25% (w/v)，离心，收集沉淀； (3) 将沉淀溶解后超滤，即为精制毒素； (4) 取精制毒素，加入甲醛溶液，脱毒，即可。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，所述白喉杆菌培养液的白 喉毒素絮状单位为160~200Lf/ml。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤（1)中，所述离心的转速为13000 ~17000转/分钟，优选15000转/分钟。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(1)中，离心采用连续流离心机离 心;和/或，澄清过滤采用微孔膜筒式滤器进行澄清过滤。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，加入硫酸铵之前先进行超 滤，所述超滤是超滤至原体积的1/6-1/10,超滤采用膜孔径为10kD的超滤膜。6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(2)中，所述离心的条件是4000~ 6000转/分钟，离心的时间为40~60分钟。7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)中，超滤至残余硫酸铵浓度小 于千分之一;超滤采用膜孔径为10kD超滤膜。8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(4)中，加入甲醛溶液至甲醛的终 浓度为0.4~0.5% (v/v)，脱毒的温度为36.5~38.5°C，脱毒的时间为30~45天。9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(4)中，加入甲醛溶液前先对精制 毒素进行稀释，稀释倍数为1.5~1.7,然后加入赖氨酸，赖氨酸的终浓度为0.15~0.25 % (w/v)〇10. 权利要求1~9任意一项所述方法制备的白喉类毒素。
【文档编号】C07K1/36GK106046127SQ201610655056
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月10日 公开号201610655056.X, CN 106046127 A, CN 106046127A, CN 201610655056, CN-A-106046127, CN106046127 A, CN106046127A, CN201610655056, CN201610655056.X
【发明人】秦敏, 张飞伟, 张华 , 唐朝晖, 吴永超, 顾洁, 耿其秀
【申请人】成都生物制品研究所有限责任公司