含S?β?咔啉?3?酰基?RGDV的siRNA递送系统的制备及其在SURVIVIN基因沉默上的应用
【专利摘要】本发明公开了一种新型的siRNA递送系统的构建方法，还公开了该递送系统在制备加载抗肿瘤基因治疗药物中的应用。本发明通过方法探索合成了一种具有抗肿瘤活性的双亲性化合物S?β?咔啉?3?酰基?RGDV，简称为CRV。本发明将合成的目标化合物作为一种膜材代替磷脂与胆固醇共同形成脂质体外膜，后加载抗肿瘤基因治疗药物形成一种新型的siRNA递送系统，其中加载抗肿瘤基因治疗药物的新型siRNA递送系统可以特异性沉默SURVIVIN mRNA的表达，下调SURVIVIN蛋白的表达，抑制肿瘤细胞生长。
【专利说明】
含s-β-咔啉-3-酰基-RGDV的s i RNA递送系统的制备及其在 SURVIVIN基因沉默上的应用
技术领域
[00011本发明涉及一种新型的siRNA递送系统，尤其加载SURVIVIN-siRNA的药物载体及 其构建方法，本发明还涉及药物载体在制备加载抗肿瘤基因治疗药物中的应用，属于生物 医药学领域。
【背景技术】
[0002] 如今，恶性肿瘤极大地威胁着人类健康。传统的治疗手段如化疗，其毒副作用大且 超过半数的癌症患者都会产生多药耐药性;放疗则是对癌细胞和正常细胞无选择的杀伤， 对患者自身免疫力造成极大伤害;手术治疗存在诸多局限，容易复发和转移。因此，寻找特 异，高效的肿瘤治疗手段是临床医学研究的一大热点。
[0003] SURVIVIN基因是近年来发现的凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中的一个新成员，具有抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂的双重功能， 在正常的终末分化组织中几乎不表达。在生理状态下，SURVIVIN仅表达于成人分泌期子宫 内膜、胎盘、睾丸、胸腺及胚胎中，但在病理状态下，SURVIVIN广泛表达于人类各种恶性肿瘤 组织中。SURVIVIN表达增高可抑制肿瘤细胞凋亡而促进其增殖，而且其表达与病程进展明 显相关，最大表达值在6 2肩期。近来，基因治疗通过抑制SURVIVIN表达，从而达到促使肿瘤 细胞凋亡和阻止肿瘤细胞分化的的目的。因此SURVIVIN-siRNA转染或为肿瘤治疗提供新的 思路。
[0004] SURVIVIN-siRNA的作用机理是通过RNAi (RNA interference，RNA干扰）导致 SURVIVIN基因表达沉默。RNAi是由siRNA(small interfering RNA，小干扰RNA)引发的特异 性序列转录后基因沉默的现象。siRNA是21-23nt的双链RNA，siRNA作为向导序列与RNA诱导 沉默复合物（RNA induced silencing complex,RISC)的无活性前体结合，在ATP参与下 s iRNA双链结构解旋诱导形成有活性的RISC，特异性识别目的mRNA，通过核酸内切酶剪切使 其降解。siRNA介导的基因治疗，在临床上用于癌症、自身免疫、感染和神经疾病等病理状 况。
[0005] 虽然siRNA基因治疗具有很好的应用前景，但是未经修饰或载体保护的siRNA在体 内递送过程会遇到严重阻碍。因此基因载体是制约siRNA基因治疗的重要问题。目前siRNA 的递送载体主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体。病毒载体的虽然具有转染效率高等 优点，但是其高免疫原性，使其安全性备受质疑。非病毒载体中脂质体以其良好的生物相容 性、易修饰性逐渐受人关注。脂质双分子层及内水相的结构，使得脂质体具有既可载水溶性 药物，又可载脂溶性药物的优点。阳离子脂质体在脂质体可运载药物的基础上，由于其正电 荷作用，使它能与带负电的核酸大分子通过静电结合，从而顺利运载基因。但是研究表明： 阳离子脂质体转染效率低于病毒基因载体，无抗肿瘤作用，因此有必要研制转染率高、可实 现基因沉默效应的新型基因载体。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种具有抗肿瘤活性的双亲性化合物S-β-咔啉-3-酰基_ RGDV，简称为CRV。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供双亲性化合CRV的合成方法，包括以下步骤:将L-色 氨酸经PS缩合、Boc保护后，与疏水端N-Boc-S-β-味啉羧酸;采用主链一侧用Boc保护氨基端 或OBzl保护羧基端，侧链用适宜的保护基保护的L-氨基酸，液相法接肽，得到全保护二肽。 分别经过氢解脱去OBzl保护或酸解脱去Boc保护后，液相法接肽，得到全保护四肽。经过酸 解脱去Boc保护后，最终得到亲水端氨基裸露的四钛RGDV;将得到的疏水端N-Boc-S-β-咔啉 羧酸与亲水端氨基游离的RGDV液相法接肽，按常规方法用三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液脱 去保护基，最终得到目标产物CRV。
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种新型siRNA递送系统，含有所述的具有抗肿瘤 活性的两亲性化合物CRV和抗肿瘤基因治疗药物SURVIVIN-siRNA.
[0009] 进一步的，所述的新型SiRNA递送系统，由以下各组分组成:抗肿瘤基因治疗药物 SURVIVIN-siRNA，胆固醇，鱼精蛋白，小牛胸腺DNA和所述的具有抗肿瘤活性的两亲性化合 物 CRV〇
[0010] 更进一步的，所述的新型siRNA递送系统，由以下各组分组成，下述百分比均为质 量百分比：SURVIVIN-siRNA 8 · 74-8 · 80%，胆固醇3 · 15-3 · 17%，鱼精蛋白6 · 35-6 ·40%，小 牛胸腺DNA 3.48-3.50%和具有抗肿瘤活性的两亲性膜材CRV78.2-78.78% .
[0011] 进一步的，抗肿瘤药物为:CRV、siRNA中的一种或多种。
[0012] 进一步的，所述的阳离子脂质为：胆固醇，鱼精蛋白，小牛胸腺DNA中的一种或多 种。
[0013] 本发明的另一个目的在于提供一种制备上述新型siRNA递送系统的方法，包括:将 胆固醇及具有抗肿瘤活性的两亲性化合物CRV用氯仿与甲醇的混合溶剂溶解，旋转蒸发去 除溶剂，形成均一薄膜。真空干燥过夜，除去痕量有机试剂。加入lmL浓度为1 %的吐温-80DEPC水水化超声10min，将脂质体薄膜完全从瓶壁洗下，再用探头超声15min，得空白脂质 体。将SURVIVI N-s i RNA与小牛胸腺DNA按照2.5:1 (w: w)的比例混合，反复吹打，室温下静置 10min。同时将空白脂质体与适量的鱼精蛋白混合，反复吹打，室温下静置10min。后将脂质 体/鱼精蛋白复合物加入到SURVIVIN-siRNA/DNA复合物中，反复快速吹打，室温静置15min， 即得。
[0014] 本发明涉及所述的的CRV在制备新型siRNA递送系统中的应用。
[0015] 本发明涉及所述的新型siRNA递送系统等各种药物载体在制备治疗肿瘤的药物中 的应用。
[0016] 本发明涉及以宫颈癌HeLa细胞株为模型，用MTT法评价所述的新型siRNA递送系统 的体外抗肿瘤活性，结果显示新型siRNA递送系统可以将siRNA递送进入细胞，且其自身也 具有抗肿瘤活性。
[0017] 本发明涉及以宫颈癌HeLa细胞株为模型，通过ELISA测定蛋白水平的基因沉默效 率，通过RT-PCR测定mRNA水平的基因沉默效率，结果表明，新型siRNA递送系统与市售转染 试剂相比，基因沉默效率无显著性差异。
[0018] 本发明涉及以荷肉瘤S18Q小鼠为模型，通过尾静脉注射给药的方式评价体内抗肿 瘤活性，结果表明新型siRNA递送系统表现明显的体内抗肿瘤活性，且毒性较小，应用前景 较好。
[0019] 本发明涉及以ICR雄性小鼠为模型，通过腹腔注射给药的方式评价具有抗肿瘤活 性的两亲性膜材CEV的安全性，结果表明CRV急毒剂量下(体内试验给药剂量100倍)表现轻 微的肝脏毒性，毒性较小，安全性高。
[0020] 本发明涉及以宫颈癌HeLa细胞株为模型，采用AnnexinV-FITC/PI双染法定量凋亡 细胞的发生率，采用PI染色法考察细胞周期时相变化，结果表明新型SiRNA递送系统可以将 siRNA递送进入细胞，抑制细胞进入S期进行DNA合成，并且伴有G2/M期阻滞的作用，从而引 起细胞凋亡，且凋亡的高峰期是在给药后24-48h。
[0021] 本发明相对于现有产品而言，有益效果主要表现在：
[0022] 本发明首次将S-β-咔啉-3-酰基-RGDV用于基因载体的制备，并成功研制了一个新 的siRNA递送系统:CRV liposomes，可加载SURVIVIN-siRNA实现基因沉默。体外细胞毒实验 结果显示，SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes与市售转染试剂相比，细胞毒作用有显著 性提高;基因沉默效应实验结果显示，SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes与市售转染试 剂相比，基因沉默效应无显著性差异；体内实验结果显示，SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes与阿霉素相比，抗肿瘤活性无显著性差异，但是毒性较小，应用前景较好;细胞凋 亡实验与细胞周期结果显示，SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes作用机制是抑制细胞 进入S期进行DNA合成，并且伴有G2/M期阻滞的作用，从而诱导细胞凋亡，且凋亡的高峰期是 在给药后24-48h。
[0023] 对本发明中所记载的相关术语作进一步的解释：
[0024] PS:脱水
[0025] Boc:叔丁氧羰基 [0026] 〇Bzl:苄酯
[0027] RGDV:精-甘-天冬-缬氨酸序列(Arg-Gly-Asp-Val)
[0028] DMF:二甲基甲酰胺
[0029] B〇C2〇:二碳酸二叔丁酯
[0030] SURVIVIN-siRNA:生存素小干扰 RNA [0031] NC:生存素小干扰RNA的阴性对照
[0032] CH:胆固醇
[0033] CRV liposomes(简称 100%lipo):未载SURVIVIN-siRNA的基因递送系统
[0034] SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes(简称S/lipo):载SURVIVIN-siRNA的基因 递送系统
[0035] NC/lipo:载NC的基因递送系统
[0036] S/R:载SURVIVIN-siRNA的市售转染试剂 [0037] N/R:载NC的市售转染试剂
[0038] Zeta-Potential :Zeta电位，又叫电动电位或电动电势
[0039] 0D:optical density(光密度)的缩写，检测单位用0D值来表示
[0040] DEPC水：用DEPC(diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯）处理过并经高温高压灭 菌的纯水。
[0041 ] RNase-free:无 RNA酶
【附图说明】
[0042]图1:24h细胞毒实验结果;☆表示相对于NC组有统计学差异；
[0043] ★表示相对于NC组有统计学显著差异；Δ表示相对于NC/R组有统计学差异；▲表 示相对于NC/R组有统计学显著差异;横坐标缩略词表示意义;?表示相对于100 % 1 ipo组有 统计学差异；?表示相对于100%lip〇组有统计学显著差异：?表示相对于S/R组有统计学 差异;?表示相对于S/R组有统计学显著差异。
[0044]图2:蛋白水平基因沉默效应结果;P>0.05表示无统计学差异;P<0.01表示有统 计学明显差异。
[0045] 图3:mRNA水平基因沉默效应结果;P>0.05表示无统计学差异;P<0.01表示有统 计学明显差异。
[0046]图4:体内抗肿瘤活性实验结果;P>0.01表示无统计学显著差异;P<0.01表示有 统计学显著明显差异。
[0047]图5:体内抗肿瘤实验脏体比结果;P<0.05表示有统计学明显差异;P<0.01表示 有统计学显著明显差异。
[0048]图6:急性毒性实验脏体比结果;P<0.05表示有统计学明显差异。
[0049] 图7:细胞早期凋亡实验结果。
[0050] 图8:细胞晚期凋亡实验结果。
[0051] 图9:细胞周期分布图。
【具体实施方式】
[0052]为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0053]实施例1异喹啉衍生物的制备
[0054] S-β-咔啉-3-酰基-RGDV(简称为CRV)的制备方法。
[0055] l)N-Boc_S-咔啉羧酸的制备
[0056] 在稀硫酸的催化下，色氨酸(L-Trp)与甲醛在常温下发生PS反应，缩合生成S-β-咔 啉羧酸;将所得的S-β-咔啉羧酸溶解于DMF中，在碱性条件下与Boc 20反应，得到N-Boc-S-β-咔啉羧酸。
[0057] 2)RGDV的制备
[0058] 将Boc-Arg(Tos)-〇H和H-Gly-〇Bzl · HC1通过液相法接肽，得到全保护二肽％。- Arg(Tos)-Gly-〇Bzl，同理得到全保护的Boc_Asp(0Bzl )-Val_0Bzl。分别将Boc-Arg(Tos)-Gly-OBzl氢解裸露羧基，B〇C-ASp(0Bzl )-Val-〇Bzl酸解裸露氨基，通过液相法接肽，得到全 保护四肽。经过酸解最终得到亲水端氨基裸露的RGDV。
[0059] 3) S-β-咔啉-3-酰基-RGDV的制备
[0060]将得到的疏水端N-Boc-S-β-咔啉羧酸与亲水端氨基裸露的RGDV液相法接肽，制得 全保护的中间体 N-Boc-S-β-咔啉-3-酰基-Arg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-Val-0Bzl。按常规方 法用三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液脱去保护基，产物用Sephadex G10柱纯化，最终得到目标 产物S-β-咔啉-3-酰基-RGDV，为浅黄色固体粉末。
[0061] ESI-MS(m/z)+30V 644.36[M+H]+.
[0062] 1HNMR(300MHz,DMS0-d6)5/ppm=11.04(s,lH) ,10.89(s,lH) ,9.62(s,lH) ,8.83 (m,lH),8.33(d ,J = 6.6Hz,2H),7.95(m,lH),7.49(m,lH),7.37(d ,J=ll.lHz,lH),7.30(d, J=10.8Hz,lH),7.22(m,lH),7.19(m,lH),7.12(m,lH),4.75(m,lH),4.43(m,2H),4.28(d,J =12.6Hz,2H),3.81(s,2H),3.13(s,2H),2.81(m,lH),2.65(m,lH),2.12(m, lH),1.91(s,lH),1.57(s,3H),1.27(m,4H),1.17(m,lH),0.87(s,6H).
[0063] 13CNMR(75MHz，DMS0-d6)S/ppm=173.16，172.05，171.34，171.22，168.99，168.60， 157.09,136.82,135.26,126.80,126.15 123.30,119.72,119.03,105.26,60.85,57.74， 55.64,53.00,49.76,42.07,39.18,34.72,32.28,32.11,29.80,25.43,19.53,18.39.
[0064] IR：vNH-：3350.08cm_1
[0065] vC-H:2967.78cm-1
[0066] vC = 0(酰胺）：1660.07cm-1
[0067] vC = C(苯环）：1538.97cm-1 1454.05cm-1
[0068] δ〇-Η:面内 1172 · 62cm-1 面外 1028 · 07cm-1
[0069] δ〇(：(苯环骨架）：761 · 68cm-1，638 · 24cm-1
[0070] HPLC purity = (98.92±1.08)% ·
[0071] 实施例2.空白脂质体的制备
[0072] 膜材及药物溶液的配制：
[0073] 10mM CRV(MW=643)的氯仿：甲醇= l:l(v:v)混合液:精确称取64.3mg CRV用适量 氯仿：甲醇=1:1 (V: V)混合液溶解后，转入10mL棕色容量瓶，用混合液定容；
[0074] 10mM CH(Mff = 387)的氯仿溶液:精确称取38.7mg CH用适量氯仿溶解，转入10mL棕 色容量瓶，以氯仿定容；
[0075] 按相应的比例量取适量膜材溶液，加入茄瓶，37 °C水浴、120rpm、真空度250mbar旋 转蒸发30min后，每5min降低50mbar直至lmbar，除去有机溶剂，形成均一薄膜。真空干燥过 夜，除去痕量有机试剂。加入lmL 1 %吐温-80溶液溶解后水化超声10min，将脂质薄膜完全 从瓶壁洗下，再用探头超声15min(总功率130W，90%，超2s，停2s)，冷却即得100%CRV liposomes。
[0076] 粒径 150_200nm之间，Zeta-Potential 25mV左右。
[0077] 实施例3.新型siRNA递送系统的制备
[0078] 1〇μΜ SURVIVIN-siRNA的DEPC溶液：10D的SURVIVIN-siRVIVIN干粉离心后，用250μ L的DEPC水充分溶解后即得。
[0079] 0. 1μg/μL小牛胸腺DNA的DEPC溶液:取lmg的小牛胸腺DNA干粉离心后，用lmL DEPC 水充分溶解得到储备液。使用时取l〇〇yL的储备液，加入900yL DEPC水稀释后即得。
[0080] 2yg/yL鱼精蛋白的DEPC溶液:精确称取4mg的鱼精蛋白，用2mL DEPC水充分溶解后 即得。
[0081 ] 将SURVIVIN-siRVIVIN与小牛胸腺DNA按照2.5:1 (w:w)的比例混合，反复吹打，室 温下静置l〇min。同时将空白脂质体与适当的鱼精蛋白混合，反复吹打，室温下静置10min。 后将脂质体/鱼精蛋白复合物加入到SURVIVIN-siRVIVIN/DNA复合物中，反复快速吹打，室 温静置 15min，即得SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes。全程使用RNase-free枪头、EP 管。
[0082] 粒径 150_200nm之间，Zeta-Potential OmV左右。
[0083] 实施例4.新型siRNA递送系统的体外抗肿瘤活性评价 [0084] 细胞培养
[0085]培养细胞:人类宫颈癌细胞系HeLa细胞，
[0086] 培养液:含10 %胎牛血清，青霉素终浓度为100U/mL，硫酸链霉素终浓度为100yg/ mL的DMEM培养液培养；
[0087] 培养环境:37°C，体积分数与5%的C02饱和湿度的恒温培养箱中；
[0088] 传代方法:每1-2天按照1:2或1:3的比例传代
[0089]于倒置显微镜下观察其形态及生长状况，发现细胞贴壁生长，呈三角形或多角形， 边缘清晰，均匀分布。
[0090] 药物配制
[0091] I实验组
[0092] 取20yL的 10μΜ SURVIVIN-siRNA的DEPC溶液和 10.4yL的0· lyg/mL的小牛胸腺DNA 的DEPC溶液于RNase-free tube，反复吹打，室温下静置10min;同时39.2yL的C空白脂质体 与19.2yL的鱼精蛋白置于另RNase-free tube中，反复吹打，室温下静置10min。后将脂质 体/鱼精蛋白复合物加入到siRNA/DNA复合物中，反复快速吹打，室温静置15min，即得。 [0093] 用不含血清和抗生素的DMEM培养基分别稀释至2mL，得到SURVIVIN-siRNA浓度为 100nM的母液。分别取200、400、600yL的母液，用不含血清和抗生素的DMEM培养基分别稀释 至800yL，得到SURVIVIN-siRNA 浓度为 100nM 的母液和 25、50、75nM 的 SURVIVIN-siRNA/100% CRV liposomes的稀释液，备用。
[0094] Π 制剂组
[0095] 取配制新型siRNA递送系统母液时所需要的相同体积的空白脂质体于RNase-free tube，用不含血清和抗生素的DMEM培养基分别稀释2mL，得到CRV浓度为100nM的母液。分别 取200、400、600yL的母液，用不含血清和抗生素的DMEM培养基分别稀释至800yL，得到CRV浓 度为100nM的母液和25、50、75nM的100 % CRV 1 iposomes的稀释液，备用。
[0096] ΙΠ 裸 siRNA 组
[0097] 取20yL的 10μΜ SURVIVIN-siRNA的DEPC溶液于RNase-free tube，用不含血清和抗 生素的DMEM培养基稀释至2mL，得到SURVIVIN-siRNA浓度为100nM的母液，分别取200、400、 600yL的母液，用不含血清和抗生素的DMEM培养基分别稀释至800yL，得到SURVIVIN-siRNA 浓度为ΙΟΟηΜ的母液和25、50、75nM的Naked SURVIVIN-siRNA稀释液，备用。
[0098] IV阳性对照组
[0099] 取20yL的 10μΜ SURVIVIN-siRNA的DEPC溶液于RNase-free tube，用lmL不含血清 和抗生素的DMEM培养基稀释，另取60yL RNAiMAX，用lmL不含血清和抗生素的DMEM培养基稀 释，分别稀释均匀后，后将SURVIVIN-siRNA的DMEM液加入到RNAiMAX的DMEM液中，反复吹打 后，室温静置5min，即得。
[0100] 用不含血清和抗生素的DMEM培养基分别稀释至2mL，得到SURVIVIN-siRNA浓度为 ΙΟΟηΜ的母液。分别取200、400、600yL的母液，用不含血清和抗生素的DMEM培养基分别稀释 至 800yL，得到 SURVIVIN-siRNA 浓度为 ΙΟΟηΜ 的母液和 25、50、75nM 的 SURVIVIN-siRNA/ RNAiMAX稀释液，备用。
[0101] V阴性对照组
[0102] 取20yL ΙΟμΜ NC-siRNA的DEPC溶液于RNase-free tube，其后的步骤同ΙΠ ，得到 NC-s iRNA浓度为ΙΟΟηΜ的母液和25、50、75nM的NC-s iRNA稀释液，备用。
[0103] 取20yL ΙΟμΜ NC-siRNA的DEPC溶液于RNase-free tube，其后的步骤同IV，得到 NC-s iRNA浓度为ΙΟΟηΜ的母液和25、50、75nM的NC/RNAiMAX稀释液，备用。
[0104] VI空白组（control)
[0105] 正常培养的HeLa细胞，与实验组相同操作，只在给药时给予等量的不含血清和抗 生素的DMEM培养基培养。
[0106] 珊调零组
[0107] 孔内不种细胞，其他处理同实验组。
[0108] 实验方法
[0109] 人宫颈癌细胞系HeLa细胞为贴壁生长细胞，以适当浓度接种于培养瓶中，加入含 10%胎牛血清，100U/mL的青霉素、100yg/mL的链霉素的DMEM完全培养液，置于37°C恒温、 5 % C02饱和湿度的培养箱中培养。取对数生长期He La细胞，0.25 %胰酶消化完全后，加入适 当的完全培养基终止消化，吹打后转移至15mL的离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清后， 以新鲜完全培养液重新悬浮，细胞计数仪计数，稀释至4 X 104cel ls/mL的细胞悬浮液。100μ L/wel 1将细胞悬液接种于96孔培养板，37 °C、5 % C02孵箱培养24h，待给药。
[0110] 小心吸去上清液，用ros液洗3次后，加入配制好的含药培养基100yL，调零孔和对 照孔加入等体积的不含血清和抗生素的DMEM培养基，每组设6个复孔。置37°C、5%⑶ 2孵箱 培养4h后吸去上清液，用PBS液洗3次后，换成完全培养基继续培养20h。
[0111] 每孔加入20yL新鲜配制的含5mg/mLMTT的无血清培养基，37°C、5%C02孵箱继续培 养4h。终止培养后，将96孔板用高速离心机lOOOrpm离心5min，使细胞沉入孔底。小心吸去上 清液，并加入150yL DMS0,用微型振荡器震荡500rpm，10min。混匀后，在酶标仪上以检测波 长为490nm测定吸光度(0D)值，计算肿瘤细胞生存率。细胞生存率（％ )=(实验组0D值-空白 组0D值)/(对照组0D值-空白组0D值）X 100%。
[0112] 实验结果
[0113] 由附图1可以看出，在实验浓度范围内：
[0114] Naked SURVIVIN-siRNA组与Naked NC组没有统计学差异(Ρ>0·05)，说明与阴性 对照Naked NC相比，Naked SURVIVIN-siRNA几乎无细胞毒作用，同时也证明游离的siRNA不 能被细胞摄取;NC/RNAiMAX组与Naked NC组当NC浓度为25nM和50nM时没有统计学差异(P> 0.05)，然而当NC浓度为75nM时有统计学差异(P<0.05)，当NC浓度为ΙΟΟηΜ时有统计学显著 差异，说明当高浓度的NC也会对细胞产生毒性作用。
[0115] 100%CRV liposomes组与NC组当CRV浓度为ΙΟΟηΜ时有统计学差异(Ρ<0.05)，说 明当100 % CRV 1 iposomes具有明显的抗肿瘤作用，并且呈现剂量依赖性。
[0116] SURVIVIN-siRNA/RNAiMAX 组与 NC/RNAiMAX 组当 siRNA 浓度为 25nM 和 50nM 时没有统 计学差异(P>〇. 05)，然而当siRNA浓度为75nM和ΙΟΟηΜ时有统计学差异(P<0.05)，说明当 SURVIVIN-siRNA浓度较低时的并不能对细胞造成显著的毒性作用。
[0117] SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes与 100%CRV liposomes在siRNA浓度为 50nM和75nM时有统计学差异（P<0.05)，在siRNA浓度为ΙΟΟηΜ时有统计学显著差异（P< 0.01)，说明SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes在siRNA较低浓度或中高浓度下的抗肿 瘤作用均来自基因沉默与载体自身的总和，即1 〇〇 % CRV 1 iposomes转染效率较好，可以将 大部分s iRNA转染进入细胞。
[0118] SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes与SURVIVIN-siRNA/RNAiMAX在siRNA浓度 为50nM和ΙΟΟηΜ时有统计学差异(P<0.05)，在siRNA浓度为75nM时有统计学显著差异(P< 0.01)，说明在SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes在siRNA较低浓度或中高浓度下的体 内抗肿瘤活性均优于市售转染试剂。
[0119] 实验例5.新型siRNA递送系统蛋白水平沉默效率的评价
[0120] 总蛋白的提取
[0121 ]取转染结束的细胞培养板，弃去培养基，将6孔板置于冰上，用冰roS洗3遍，再加入 lmL/we 11的冰PBS，用细胞刮仔细完全地刮下细胞。将刮下的含有细胞的roS液转移至1.5mL 的tube中，3000rpm，4 °C离心5min，弃去上清液，加入250yL/we 11的混合裂解液，稍祸旋振荡 超声后置于冰上，反应30min。反应完毕后，12000rpm，4 °C离心10min，取上清液，-80 °C保存 备用。
[0122] 总蛋白定量
[0123] 标准曲线的测定
[0124] 取配制好的标准样品25yL于96孔板内，每孔加入200yL的BCA工作液，后将96孔板 置于振荡器上振荡30s，使之充分混合。将96孔板转移至37°C下孵育30min。反应完毕后将96 孔板冷却至室温，用酶标仪在562nm波长下测定其吸光度
[0125]样品的测定
[0126] 取提取的样品25yL于96孔板内，其后步骤同上。根据公式计算样品的总蛋白浓度。
[0127] ELISA
[0128] 溶液的配制
[0129] Wash Buffer:取2mL的Wash Buffer浓缩液（25 X )于50mL离心管中，用纯净水稀释 至50mL，即得。
[0130] Substrate Solution:将Color Reagent A和B等体积混合，避光，混合后15min内 使用。
[0131] Calibrator Diluent RD5_33(1X):取2mLCalibrator Diluent RD5-33于15mL离 心管中，用纯净水稀释至12mL，即得。
[0132] SURVIVIN Standard:用lmL DEPC水重悬SURVIVIN标准品，充分混合均匀，静置 15min，即得浓度为 20000pg/mL 的 SURVIVIN 母液。
[0133] SURVIVIN标准曲线的配制
[0134] 准备2mL RNase-free tube 8支，取 100yL的SURVIVIN母液于管 1，用Calibrator Diluent RD5-33(1X)稀释至 1000yL，剩下的每管加入500yL Calibrator Diluent RD5-33 (1 X )，取500yL管1溶液加入管2,然后依次取500yL混匀后的溶液加入后面的管子，倍比稀 释。得到浓度为31.2、62.5、125、250、500、1000、200(^8/11^的51]1^1￥頂标准溶液，用 Calibrator Diluent RD5_33(1X)作为对照。
[0135] 试剂盒检测
[0136] 1.将各种试剂及样品室温下平衡30min并准备试剂见2.5.1;
[0137] 2.除去微孔板包装，将多余的放入铝箱装重新包装；
[0138] 3.每孔加入 100yL的Assay Diluent RD1_9(测定稀释剂）；
[0139] 4.分别设标准组、对照组和样品组。对照组加100yL Calibrator Diluent RD5-33 (IX);标准组加入100此2.5.2中配好的标准样品；样品组加入总蛋白为50yg的样品，不足 1〇〇此者，用DEPC水补足。轻轻晃动混匀后，用提供的粘性胶带密封微孔板，而后转移至涡旋 仪500 ± 50rpm，室温下涡旋2h;
[0140] 5 ·弃去孔内液体，甩干，400μLν次wash buffer洗3次，最后一次倒扣在干净滤纸上 轻拍至干净无液体；
[0141] 6.每孔加入200yL Survivin Conjugate，重新密封微孔板，室温孵育2h;
[0142] 7.重复第5步；
[0143] 8 ·每孔加入200yLSubstrate Solution，重新密封微孔板，室温避光孵育30min;
[0144] 9.每孔加入50yL的Stop Solution终止反应，溶液颜色由蓝变黄即可，若为绿色可 轻敲或低速涡旋微孔板，以确保完全混匀；
[0145] 10.在反应终止30min内用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光度，再用540nm作 为校准波长，用450nm波长下测得的吸光度减去540nm波长下测得的吸光度即得校准后的吸 光度。
[0146] 实验结果
[0147] 由附图2可以看出：
[0148] Naked SURVIVIN-siRNA组和Naked NC组的胞内SURVIVIN含量相对于control组没 有统计学差异，Naked SURVIVIN-siRNA组相对于Naked NC组胞内SURVIVIN含量也没有统计 学差异，说明在给药浓度下，Naked siRNA不能起到下调目标蛋白表达的效应；
[0149] SURVIVIN-siRNA/RNAiMAX组的胞内SURVIVIN含量相对于Naked NC和control组都 有统计学差异，而NC/RNAiMAX组的胞内SURVIVIN含量相对于Naked NC和control组都没有 统计学差异，说明市售转染试剂RNAiMAX的确可以将SURVIVIN-siRNA转染进入细胞，并且特 异性下调SURVIVIN蛋白的表达，可以作为阳性对照；
[0150] SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes组的胞内SURVIVIN含量相对于Naked NC和 control组都有统计学显著差异，而NC/100%CRV liposomes组的胞内SURVIVIN含量相对于 Naked NC和control组都没有统计学差异，说明100%CRV liposomes可以将SURVIVIN-siRNA 转染进入细胞 ，并且特异性下调SURVIVIN 蛋白的表达；
[0151] SURVIVIN-siRNA/100 % CRV 1 iposomes 组的胞内 SURVIVIN 含量相对于 SURVIVIN-siRNA/RNAiMAX组没有统计学差异，说明在给药浓度下，SURVIVIN-siRNA/100%CRV 1 iposomes特异性下调SURVIVIN蛋白的表达的效果与市售转染试剂无显著性差异。
[0152] 实验例6.新型siRNA递送系统mRNA水平沉默效率的评价
[0153] 细胞全RNA的提取
[0154] 1.细胞裂解：.取转染结束的6孔板，弃去上清(弃净，但不要洗涤细胞，以免mRNA降 解），加入lmL/well的Trizol裂解液，用移液枪反复吹打，直至细胞完全裂解，转移至EP管， 静置5min，使得核酸蛋白复合物完全分解；
[0155] 2.相分离：向每管中加入0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温下放置2-3min， 然后12000 Xg，4°C离心15min。离心后分成三层，最底层为红色苯酸-氯仿相，最上层为无色 水相，和介于两者之间的中间层。RNA只存在于水相中，水相约占总体积的50% ;
[0156] 3 ·沉淀RNA:小心将上层无色水相转移至RNase-free tube中每管加入0 · 5mL异丙 醇，混匀后室温静置1 Omin，然后12000 X g，4 °C离心1 Omin.。离心前看不出RNA沉淀，离心后 在管侧和管底出现絮状胶样沉淀，即为沉淀下来的RNA;
[0157] 4.洗涤RNA:取上清，每管加入lmL已配好的75%乙醇，振荡器混匀后，7500 X g，4°C 离心5min;
[0158] 5. RNA再溶解:去上清，室温下放置5-1 Omin，干燥RNA沉淀。注意不能将RNA沉淀完 全干燥，因为这样会极大降低它的溶解度。用25yL的DEPC水重悬RNA沉淀，用RNase-free tips反复吹打使之混匀，于55-60°C水浴下放置10_15min，直至RNA沉淀完全溶解。-20°C保 存；
[0159] 6.测浓度：用DEPC水清洗并校准Nanodrop-ΙΟΟΟ后，依次取2yL混匀后的RNA溶液样 品，滴到上样池内，封闭上样池，选择RNA-40，点击measure开始测量并记录，注意测量不同 的样品前清洗上样池。
[0160] 逆转录
[0161] 1.将所有的样品和试剂置于4°C融化；
[0162] 2.样品准备:保证每个样品的上样量为2yg，根据测得的RNA浓度，计算所需的RNA 体积；
[0163] 3.取一MicroAmp? Optical 96-Well Reaction，每个反应孔加入 10yL 2 XRT Buffer，lyL20 X RT EnzymeMix和适当体积的RNA溶液，若不足20yL则以DEPC水补足，而后用 Optical adhesive film将板子封口。4°C，1000rmp离心lmin，使液体聚集于底部并赶走气 泡；
[0164] 4.放入PCR System 9700,设置条件。94Γ5π?η，94Γ3〇8,55Γ3〇8,72Γ3〇8,72Γ 7min，4°C 00。共 30 个循环。
[0165] 5.测浓度：用DEPC水清洗并校准Nanodrop-1000后，依次取2yL混匀后的cDNA溶液 样品，滴到上样池内，封闭上样池，选择DNA-50，点击measure开始测量并记录，注意测量不 同的样品前清洗上样池。
[0166] RT-PCR
[0167] 1 ·4°C融化TaqMan?Gene ExpressionMaster Mix、T._Man?:Gene Expression Assays中的BIRC5引物和GAPDH引物；
[0168] 2.样品准备：保证每个样品的上样量为20ng，根据测得的cDNA浓度，计算所需的 cDNA体积；
[0169] 3.取一MicroAmp? Optical 96-Well Reaction，每个反应孔加入lOyLTaqMan:? Gene ExpressionMaster Mix、lyL引物(BIRC5或GAFOH)和适当体积的cDNA样品，若不足20μ L则以DEPC水补足，而后用Optical adhesive film将板子封口。4°C，lOOOrpm离心lmin，使 液体聚集于底部并赶走气泡
[0170] 4.放入Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System，设置条件。Hold:5CTC 2min，95°C 10η?η<Χ}^1θ(40〇5^1θ8) :95°C 15s，6CTC lmin。
[0171] 5.数据处理中，Ct值的threshold选择Applied Biosystems Sequence detection software(7500FastSystem SDS Software version 1·4)的automatically calculated。 以GAPDH为内参，运用2~-Δ Δ Ct法相对定量各实验组mRNA的量。
[0172] 实验结果
[0173] 由附图3可以看出：
[0174] Naked SURVIVIN-siRNA组和Naked NC组的SURVIVIN mRNA相对含量对于control 组没有统计学差异，且Naked SURVIVIN-siRNA组的SURVIVIN mRNA相对含量对于Naked NC 组也没有统计学差异，说明在给药浓度下，Naked siRNA不能起到基因沉默的作用。
[0175] SURVIVIN-siRNA/RNAiMAX组的SURVIVIN mRNA相对含量对于Naked NC和control 组都有统计学显著差异，而NC/RNAiMAX组的对含量对于Naked NC和control组都没有统计 学差异，说明市售转染试剂RNAiMAX的确可以将SURVIVIN-siRNA转染进入细胞，并且特异性 沉默SURVIVIN基因，可以作为阳性对照。
[0176] SURVIVIN/100%CRV liposomes组的SURVIVIN mRNA相对含量对于Naked NC和 control组都有统计学显著差异，而NC/100%CRV liposomes组的SURVIVIN mRNA相对含量 相对于Naked NC和control组都没有统计学差异，说明100%CRV liposomes可以将 SURVIVIN-siRNA转染进入细胞，并且特异性沉默SURVIVIN基因。
[0177] SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes组的SURVIVIN mRNA相对含量相对于 SURVIVIN-siRNA/RNAiMAX组没有统计学差异，说明在给药浓度下，SURVIVIN-siRNA/100 % CRV liposomes特异性沉默SURVIVIN基因的作用与市售转染试剂大无显著性差异。
[0178] 实施例7.新型siRNA递送系统的体内抗肿瘤活性评价
[0179] 模型建立
[0180] 将518〇荷肉瘤小鼠腹腔肿瘤细胞接种于一只ICR小鼠腹腔，连续传代，第八天时无 菌抽取小鼠腹腔肿瘤细胞，加入生理盐水调整细胞悬液中细胞密度至1.5 X107cell/mL，用 于接种。用2 %碘酒棉球和75 %酒精棉球将小鼠右侧腋下消毒，注入0.2mL瘤细胞液。按此方 法给每只ICR小鼠接种，并将小鼠随机分为5组，每组12只，各组间体重无差异，放入屏障饲 养。
[0181] 抗肿瘤活性评价
[0182] 种瘤后的第八天起开始给药，按0.2mL/只尾静脉注射配好的药液，连续给药5天。 首次给药后第六天将小鼠处死，解剖取出肿瘤组织称重;解剖取出心脏、肝脏、脾脏、肾脏、 脑分别称重。将种瘤后的第七天记作第〇天，于〇，1，2，3，4，5天用电子秤称量小鼠体重。记录 小鼠体重变化，并计算抑瘤率，脏器指数。
[0183] 实验结果
[0184] 由附图4可以看出：
[0185] Naked SURVIVIN-siRNA组和 100%CRV liposomes组的瘤重相对于NS组有统计学 显著差异，说明在给药浓度下，Naked SURVIVIN-siRNA和100%CRV liposomes均具有一定 的体内抗肿瘤作用，一定程度上抑制肿瘤生长。
[0186] D0X组的瘤重相对于NS组有统计学极显著差异，说明在给药浓度下，D0X具有明确 的体内抗肿瘤作用，明显抑制肿瘤生长，可以作为阳性对照。SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes组的瘤重相对NS组有统计学极显著差异，说明在给药浓度下，SURVIVIN-siRNA/ 100%CRV liposomes具有明确的体内抗肿瘤作用，明显抑制肿瘤生长。
[0187] SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes组的瘤重相对阳性对照组D0X组没有明显 差异性，说明在给药浓度下，SURVIVIN_siRNA/100%CRV liposomes的体内抗肿瘤作用与市 售疗效确切的抗肿瘤药物D0X大致相同。
[0188] SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes组的瘤重相对于Naked SURVIVIN-siRNA组 或100%01^11?〇8〇1116 8组具有统计学极显著差异，说明在给药浓度下，100%〇1^ liposomes可以将SURVIVIN-siRNA转染进入细胞，并且特异性沉默SURVIVIN基因，在体内水 平表现明显的抗肿瘤活性。
[0189] 由附图5可以看出：
[0190] D0X组在给药浓度下，有明显的心脏毒性、肝脾毒性和轻微的肾脏毒性;31]1^1￥預-siRNA/100%CRV liposomes组在给药浓度下，有轻微的肝脏毒性。说明SURVIVIN-siRNA/ 100%CRV liposomes是经肝脏代谢，但是与阿霉素相比毒性较小，应用前景较好。
[0191 ] 实施例8. CRV急性毒性评价
[0192] 急性毒性评价
[0193] 将小鼠随机分为2组，每组10只，各组间体重无差异，放入屏障饲养。
[0194] 适应性饲养1天后，第二天开始给药，按照0.2mL/只腹腔注射急毒剂量(体内实验 给药剂量的1〇〇倍)的药液，给药后常规饲养，观察7天，处死，解剖取出心脏、肝脏、脾脏、肾 脏、脑、睾丸分别称重。将给药第一天记作第1天，于1，2,3,4,5,6,7天用电子秤称量小鼠体 重。观察小鼠外表行动，反射活动，饮量，存活情况，体重变化等，并计算脏器指数。
[0195] 实验结果
[0196] 由附图6可以看出：
[0197] 与对照组(C.g)相比，实验组(E.g)肝脏和脾脏的脏体比有统计学差异。说明急毒 剂量下(体内实验给药剂量的1〇〇倍），CRV具有轻微肝脏毒性。
[0198] 实施例9.细胞凋亡实验
[0199] 细胞的处理与标记
[0200] 分别于给药后6，12，24，48h收集细胞。每孔用0.3mL的0.25 %的胰蛋白酶消化完全 后，加入lmL完全培养基终止消化，吹打后转移至15mL的离心管中，1500rpm离心3min，弃去 上清后，得到细胞团块。以lmL冰roS洗涤，1500rpm离心3min，弃去洗涤液。将洗好的细胞用 200yL的1 XBinding Buffer重悬，测定细胞密度，稀释至1 X 106cell/mL
[0201] 取100yL细胞液，计入5yL FITC annexin V和lyL的PI工作液，室温下避光孵育 15min，上机检测前再补400yL的 1 XBinding Buffer。
[0202] 过膜，尽快用流式细胞仪检测。
[0203]实验结果
[0204] 由附图7和8可以看出：
[0205]比较裸siRNA组与空白对照组，发现两组间各个时间点细胞凋亡率基本一致，说明 游离的SURVIVIN-siRNA不能进入细胞，引起细胞凋亡；比较实验组和空白对照组，发现两组 间各个时间点细胞凋亡率有显著差异，其中SURVIVIN-siRNA/100%CRV liposomes有诱导 HeLa细胞早期凋亡的作用但是并不明显，而诱导HeLa细胞晚期凋亡的作用则十分明显，从 24h起到48h是晚期凋亡的高峰期。说明100%CRV liposomes可以将SURVIVIN-siRNA转染进 入细胞，引起细胞凋亡，凋亡高峰期是在给药后24-48h。
[0206]实施例10.细胞周期实验 [0207]细胞固定
[0208] 分别于给药后6，12，24，48h收集细胞。每孔用0.3mL的0.25 %的胰蛋白酶消化完全 后，加入lmL完全培养基终止消化，吹打后转移至15mL的离心管中，1500rpm离心3min，弃去 上清后，得到细胞团块。以lmL冰roS洗涤，1500rpm离心3min，弃去洗涤液，将细胞团块完全 悬浮于0.5mL PBS中，逐滴滴入已准备好的9.5mL 70%乙醇溶液中，-20°C过夜，保存待用。
[0209] PI 染色
[0210] 取出固定的细胞，lOOOrpm，离心10min，倒掉乙醇，冰PBS洗涤2次，lOOOrpm，离心 l〇min，弃去洗涤液。将细胞团块重悬于lmL配制好的RNase A的PBS液，加入50yL的PI溶液 (lmg/mL)，37°C水浴避光染色30min。采用流式细胞仪检测细胞周期，Cytosoft软件进行分 析。
[0211] 实验结果
[0212]由附图9可以看出：
[0213]比较裸siRNA组与空白对照组，发现两组间细胞周期时相变化基本一致，说明游离 的SURVIVIN-siRNA不能进入细胞，引起细胞周期时相变化;比较实验组和空白对照组，发现 两组间细胞周期时相存在差异，实验组给药后可以抑制HeLa细胞进入S期进行DNA合成，并 且伴有G 2/M期阻滞的作用，这与文献上SURVIVIN基因抑制细胞凋亡和维持细胞有丝分裂的 作用机理相吻合。说明l〇〇%CRV liposomes可以将SURVIVIN-siRNA转染进入细胞，引起细 胞凋亡。
【主权项】
1. 一种具有抗肿瘤活性的两亲性化合物S-β-咔啉-3-酰基-RGDV，简称为CRV。2. 权利要求1所述的化合物，其特征在于，该化合物为抗肿瘤活性的小分子并能自组装 形成纳米载体。3. -种制备权利要求1所述两亲性化合物CRV的合成方法，包括以下步骤:将L-色氨酸 经PS缩合、Boc保护后得到疏水端N-Boc-S-β-咔啉羧酸;采用主链一侧用Boc保护氨基端或 OBzl保护羧基端，侧链用适宜的保护基保护的L-氨基酸，液相法接肽，得到全保护二肽，分 别经过氢解脱去OBzl保护或酸解脱去Boc保护后，液相法接肽，得到全保护四肽，经过酸解 脱去Boc保护后，最终得到亲水端氨基裸露的四钛RGDV;将得到的疏水端N-Boc-S-β-咔啉羧 酸与亲水端氨基裸露的RGDV液相法接肽，按常规方法用三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液脱去 保护基，最终得到目标产物CRV。4. 根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，包括以下步骤： 1 )N-Boc-S-咔啉羧酸的制备 在稀硫酸的催化下，色氨酸(L-Trp)与甲醛在常温下发生PS反应，缩合生成S-β-咔啉羧 酸;将所得的S-β-咔啉羧酸溶解于DMF中，在碱性条件下与Boc20反应，得到N-Boc-S-β-咔啉 羧酸， 2. RGDV的制备 将Boc-Arg(Tos)-〇H和H-Gly-OBzl · HC1通过液相法接肽，得到全保护二肽Boc-Arg (Tos)-Gly-OBzl，同理得到全保护的Boc-Asp(OBzl)-Val_OBzl，分别将Boc_Arg(Tos)-Gly-OBzl氢解裸露羧基，B 〇C-ASp(0Bzl)-Val-0BZl酸解裸露氨基，通过液相法接肽，得到全保护 四肽，经过酸解最终得到亲水端氨基裸露的RGDV， 3. S-β-咔啉-3-酰基-RGDV的制备 将得到的疏水端N-Boc-S-β-咔啉羧酸与亲水端氨基裸露的RGDV液相法接肽，制得全保 护的中间体 N-Boc-S-β-咔啉-3-酰基-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-〇Bzl，按常规方法用 三氟乙酸-三氟甲磺酸混合液脱去保护基，产物用Sephadex G10柱纯化，最终得到目标产物 S-β-咔啉-3-酰基-RGDV，为浅黄色固体粉末。5. -种新型siRNA递送系统，其特征在于:含有权利要求1或2所述的具有抗肿瘤活性的 两亲性化合物CRV和抗肿瘤基因治疗药物SURVIVIN-siRNA。6. 根据权利要求5所述的递送系统，其特征在于，由以下各组分组成:抗肿瘤基因治疗 药物SURVIVIN-siRNA，胆固醇，鱼精蛋白，小牛胸腺DNA和所述的具有抗肿瘤活性的两亲性 化合物CRV。7. 根据权利要求5所述的递送系统，其特征在于，由以下各组分组成，下述百分比均为 质量百分比：51]1^1￥11811?祖 8.74-8.80%，胆固醇3.15-3.17%，鱼精蛋白6.35-6.40%， 小牛胸腺DNA 3.48-3.50%和具有抗肿瘤活性的两亲性膜材CRV 78.2-78.78%。8. -种制备权利要求5-7任一项所述的新型siRNA递送系统的方法，包括以下步骤:将 胆固醇及具有抗肿瘤活性的两亲性化合物CRV用氯仿与甲醇的混合溶剂溶解，旋转蒸发去 除溶剂，形成均一薄膜，真空干燥过夜，除去痕量有机试剂，加入lmL浓度为1 %的吐温-80DEPC水水化超声lOmin，将脂质体薄膜完全从瓶壁洗下，再用探头超声15min，得空白脂质 体，将SURVIVIN-siRNA与小牛胸腺DNA按照2.5:1 (w: w)的比例混合，反复吹打，室温下静置 lOmin，同时将空白脂质体与适量的鱼精蛋白混合，反复吹打，室温下静置lOmin，后将脂质 体/鱼精蛋白复合物加入到SURVIVIN-siRNA/DNA复合物中，反复快速吹打，室温静置15min， 即得。9. 权利要求1-2任一项所述的S-β-咔啉-3-酰基-RGDV在制备siRNA递送系统中的应用。10. 权利要求5-7所述的新型siRNA递送系统在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
【文档编号】A61K31/713GK106046118SQ201610362271
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】王玉记, 崔纯莹, 咸颖
【申请人】首都医科大学