一种聚酮化合物及其制备方法和用图

一种聚酮化合物及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明属于医药技术领域，涉及从一株刺囊壳属真菌（Ascotricha sp.）中分离得到的一个具有抗肿瘤活性的聚酮化合物及其制备方法。本发明所涉及的化合物结构新颖，对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株和人白血病K562细胞株具有显著的生长抑制作用，并且其发酵工艺和提取分离方法简便，有利于对其进行进一步的药理和临床研究，开发其在制备抗白血病药物中的应用。CGMCC No.827820130927
【专利说明】
一种聚酮化合物及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明属于医药技术领域，涉及从一株刺囊壳属（Ascotricha sp. ZJ-M-5)真菌发 酵所得菌丝体中分离得到的一种具有抑制人白血病细胞株生长的聚酮化合物及其制备方 法。
【背景技术】
[0002] 微生物能够产生结构新颖并具有抗肿瘤、抗感染等多样生物活性的次级代谢产 物，因此从微生物中寻找药物先导化合物一直是创新药物研究的热点。传统的微生物培养 采用提供丰富营养物质促进其生产的方式，然而在此条件下，大多数微生物的合成次级代 谢产物的基因处于沉默状态，导致产生的次级代谢产物数量较少，含量较低，并且往往产 生很多诸如脂肪酸、环二肽等非活性物质干扰提取分离。有鉴于此，Axel Zeeck等人提出 OSMAC (one strain many compounds，单菌多物）策略（ChemBioChem，2002, 3 :619_627)，即 通过改变培养基成分、培养条件及添加酶抑制剂等方法，激活在传统培养条件下微生物次 级代谢的"沉默途径"，从而获取结构更为新颖、活性更为多样和产量更为丰富的微生物来 源活性天然产物。
[0003] 刺囊壳属真菌（Ascotricha sp. ZJ-M-5)是通过化学和生物活性筛选，从浙江奉化 市莼湖镇桐照村黄滩涂地的海泥样品中分离得到的一株能够产生抗肿瘤化合物的微生物。 发明人前期工作中，从该菌株含有丰富营养物质的培养基发酵产物中获得了环橙花二醇类 衍生物（Natural Product Research，2013,27 :847-850)和一个 C3,4 位裂环的羊毛脂烷 型三萜类化合物（药学学报，2013,48 :89-93)。然而，采用0SMAC策略，通过改变培养基组 成，发现该菌株在寡营养条件下的次级代谢与在含有丰富营养物质培养基条件下的次级代 谢存在显著的差异。从其寡营养培养物的菌丝体中，通过简单的提取分离工艺，得到了一个 新的具有28元大环内酯结构的聚酮化合物。
[0004] 大环多聚内酯类化合物在自然界非常罕见，仅由真菌产生，从生合成角度考虑为 醋酸-丙二酸途径合成的不同片段之间相互缩合而成。目前报道的该类结构主要由2, 4-二 羟基-6- (2-羟基丙基）-苯甲酸片段和3-羟基丁酸或3, 4-二羟基丁酸片段组成，如NG-011 和 NG012 (The Journal of Antibiotics，1992,45:1559-1565)，BK223-B 和 BK223-C (The Journal of Antibiotics，1993,46:1101_1108)，以及从Hypoxylon oceanicum LL-15G256 菌株中分离得到的 15G156a 系列衍生物（The Journal of Antibiotics，1998, 51: 296-302 ;Tetrahedron，2002, 58 :6825-6835)。但如式 I 结构中，含有 2, 4-二羟基-6- (4-羟 基-2-酮-戊基）_苯甲酸片段的大环多聚内酯类化合物国内外均未见报道。大环多聚内 酯类化合物目前报道具有抗真菌和神经生长因子促进作用，但其抗肿瘤活性，尤其是对白 血病细胞株的生长抑制作用国内外均未见报道。

【发明内容】

[0005] 本发明提供一种从刺囊壳属真菌Ascotricha sp. ZJ-M-5中分离得到的对人白血 病细胞株具有显著生长抑制作用的聚酮化合物。本发明所述化合物的结构如式I所示：
[0006]
[0007] 本发明的制备技术方案包括如下步骤：
[0008] 挑取刺囊壳属真菌（Ascotricha sp. ZJ-M-5,保藏号CGMCC No. 8278)的孢子，直 接接种到液体培养基中静置培养7~56天，其中培养基由蒸馏水配制，包含蔗糖2~4%， NaN0 30. 2 ~0? 4 %，CaCl2 0? 12 ~0? 92 %，K2HP04 0? 05 ~0? 15 %，KC1 0? 03 ~0? 07 %， FeS04 WHW0.00 05~0. 0015%，培养温度为20~30°C。发酵产物经过滤除去发酵液后，菌 丝体采用丙酮超声提取1~3次，将提取物合并后经1~20倍量200~300目硅胶柱色谱 分离，以体积配比为5 :1-1 :1的石油醚-丙酮混合溶剂梯度洗脱，其中体积配比为3 :1的 石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分得到式I化合物。
[0009] 所得化合物经过系统结构鉴定结果如下：主要利用高分辨电喷雾质谱、二级低分 辨电喷雾质谱、核磁共振谱（ :H NMR，13C NMR，2D-NMR)。
[0010] 式I化合物为白色粉末（甲醇），[a ]2°D-52. 0° (c 0. 25, CH30H)，易溶于甲醇。
[0011] HRESI-MS (图 1)给出准分子离子峰 m/z :819. 2465[M+Na]+，795. 2501[M-H]确定 化合物分子式为c4〇h44o17。
[0012] 虫 NMR(600MHz，DMS0-d6)谱（图 2)中给出 6 个酚羟基质子信号：S 10.80(lH，s)、 10. 36 (1H，s)、10. 28 (1H，s)、10. 19 (1H，s)、9. 90 (1H，s)、9. 86 (1H，s)，在 S 6. 23 (1H，d，J = 2. 3Hz)和6. 14 (1H，d，J = 2. 3Hz)处给出一组间位偶合的芳香质子信号，在S 6. 16~6. 18 范围内给出4个呈单峰的芳香质子信号，在S5. 35(2H，m)、5. 30(1H，m)和4. 99(2H，m)处 给出5个sp3杂化的连氧次甲基质子信号，在S 3. 89(1H，d，J = 17. 4Hz)和3. 78(1H，d，J =17. 4Hz)处给出sp3杂化亚甲基上一组偕偶的质子信号，在S 2. 61~3. 03处给出10个 sp3杂化碳上质子信号，在高场区给出5个甲基双峰质子信号：S 1. 30 (3H，d，J = 6. 2Hz)、 1. 25 (3H，d，J = 6. 2Hz)、1. 19 (3H，d，J = 6. 2Hz)、1. 11 (3H，d，J = 6. 2Hz)和 1. 08 (3H，d，J =6. 2Hz)。13C NMR(150MHz，DMS0-d6)谱（图3)中共给出40个碳信号，其中包括1个酮羰 基碳信号：S 204. 3, 5个酯羰基碳信号：S 169. 3、169. 2、168. 6、168. 3和168. 2,18个苯环 上的碳信号，5个sp3杂化的连氧次甲基碳信号：S 71. 3、71. 2、68. 2、68. 1和67. 6,6个sp3杂 化的亚甲基碳信号：S 49. 4、46. 9、40. 2、40. 0、39. 6和39. 4,以及5个甲基碳信号：S 19. 8、 19. 4、19. 3、19. 2和19. 2。通过HSQC (图4)图谱将以上碳氢信号归属，进一步通过HMBC (图 5)图谱推导出式I化合物结构中存在两个3-羟基丁酸片段，两个2, 4-二羟基-6-(2-羟 基丙基）-苯甲酸片段和一个2, 4-二羟基-6- (4-羟基-2-酮-戊基）-苯甲酸片段，并通 过HMBC谱（图5)归属了上述5个片段中的碳氢信号。从上述片段中连氧次甲基质子信号 位于较低场区及酯羰基碳信号化学位移大小，结合化合物分子式判断，以上各片段中羧基 均和另一个片段的醇羟基形成酯，即式I化合物结构中不存在游离的羧基和醇羟基，而是 一个大环多聚内酯结构。由于在HMBC(图5)谱图中没有观察到各片段之间连氧次甲基质 子信号和相应酯羰基之间的远程相关，片段之间的连接方式借助低分辨ESI-MS (图6)二级 碎片离子（图7)的结构归属来完成。在负离子模式下，对m/z 795. 4[M-H]进行裂解（图 8)，可以观察到其发生麦氏重排后脱去1个2, 4-二羟基-6- (2-羟基丙基）-苯甲酸片段后 形成的m/z 601. 1碎片（图8)，该碎片继续脱去1个3-羟基丁酸片段后形成的m/z 515. 1 碎片（图8)，以及m/z 515. 1碎片脱去1个2, 4-二羟基-6- (2-羟基丙基）-苯甲酸片段后 形成的m/z 320. 9碎片（图8)，m/z 515. 1碎片发生麦氏重排形成的m/z 279. 0碎片（图 8)，m/z 515. 1碎片脱去[2, 4-二羟基-6-(2-羟基丙基）-苯甲酸-3-羟基丁酸酯]形成 的m/z 234. 9碎片（图8)，以及m/z 515. 1碎片脱去1个2, 4-二羟基-6-(2-酮-3-戊烯 基）_苯甲醛形成的m/z 296. 9碎片（图8)。以上碎片可以很明确地将式I化合物各个片 段的连接顺序确定为[2, 4-二羟基-6-(4-羟基-2-酮-戊基）-苯甲酸]-[2, 4-二羟 基-6- (2-羟基丙基）-苯甲酸]-[3-羟基丁酸]-[2, 4-二羟基-6- (2-羟基丙基）-苯 甲酸]-[3-羟基丁酸]，然后末端的3-羟基丁酸片段的醇羟基又与2, 4-二羟基-6-(4-羟 基-2-酮-戊基）_苯甲酸的羧基成酯，从而形成式I化合物的28元大环内酯结构。其各 结构片段 1H NMR和13C NMR信号归属于表1中。
[0013]
[0014] 表1.式I化合物的1H NMR和13C NMR信号归属
[0015]
[0016] 式I化合物结构中手性碳原子的绝对构型通过对其生合成片段测试比旋光度 或圆二色谱（CD)进行确定。其中从该菌株的发酵液中，分离得到比旋光度为-54.4°的 orthosporin，而文献[Tetrahedron，1996, 52 :7159_7162]中该化合物结构中手性碳为S 构型时其旋光方向为右旋，由于orthosporin应该为2, 4-二羟基-6-(4_羟基-2-酮-戊 基）_苯甲酸通过分子内烯醇化和酯化反应而得，因此确定式I化合物结构中2, 4-二羟 基-6-(4-羟基-2-酮-戊基）-苯甲酸片段的C-11位手性碳为R构型。此外，从该菌株发 酵液中，分离得到6-hydroxymellein，测得其⑶图谱（图9)与文献[Tetrahedron，2002， 58 :6825-6835]中报道的手性碳为R构型，且旋光方向为左旋的该化合物的⑶图谱一致， 即在267nm呈负的Cotton效应，由于6-hydroxymellein应该为2, 4-二羟基_6-(2_羟基丙 基）-苯甲酸通过分子内酯化反应而得，因此确定式I化合物结构中2, 4-二羟基-6- (2-羟 基丙基）-苯甲酸片段的手性中心，即C-21和C-35位为R构型。根据生合成途径中3-羟 基丁酸片段应该与2, 4-二羟基-6-(4-羟基-2-酮-戊基）-苯甲酸片段和2, 4-二羟 基-6-(2-羟基丙基）-苯甲酸片段共用相同的酮基还原酶，以及式I化合物比旋光度也为 左旋，确定3-羟基丁酸片段中手性中心，即C-25和C-39位手性碳为R构型。综上，确定了 式I化合物的平面结构及绝对构型。
[0017] 对所得到的式I化合物进行人白血病细胞株生长抑制活性的测试。实验结果表明 式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株和人白血病K562细胞株具有显著 的生长抑制作用，GI5。值为6. 7~7. 7 y M，且作用强度均高于阳性对照药顺铂数倍，因此，本 发明所述的新聚酮化合物具有制备临床白血病预防和治疗药物的前景。
[0018] 本发明的优点在于，所得到的化合物结构新颖，在国内外未见其结构类似物的报 道，且其具有抑制肿瘤细胞生长的活性。其发酵培养基组成简单，提取分离方法简易，发酵 产量高，便于对其进行进一步的药理和临床研究，为开发疗效好且毒副作用小的新型抗白 血病药物提供先导化合物。
[0019] 本发明所用的菌种ZJ-M-5由中国科学院微生物研究所鉴定为刺囊壳属真菌 (Ascotricha sp.)，检验鉴定报告编号：（2011)微检字第227号，并于2013年9月27日由 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)保藏，地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 8278。
【附图说明】：
[0020] 图1 :式I化合物的高分辨ESI-MS谱；
[0021] 图2 :式I化合物的1H NMR谱；
[0022] 图3 :式I化合物的13C NMR谱；
[0023] 图4 :式I化合物的HSQC谱；
[0024] 图5 :式I化合物的HMBC谱；
[0025] 图6 :式I化合物的低分辨ESI-MS -级谱；
[0026] 图7 :式I化合物的低分辨负离子ESI-MS二级谱；
[0027] 图8 :式I化合物的低分辨负离子ESI-MS二级谱中主要碎片离子结构归属；
[0028] 图9 :由式I化合物中2, 4-二羟基-6-(2_羟基丙基）_苯甲酸片段形成的 6-hydroxymellein 的 CD 图谱。
【具体实施方式】：
[0029] 下面所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。实施例1:式I化合物的制备：
[0030] 挑取刺囊壳属真菌（Ascotricha sp. ZJ-M-5,保藏号为CGMCC No. 8278)的孢 子，直接接种到液体培养基中静置培养28天，其中培养基由蒸馏水配制，含有蔗糖3%， NaN030. 3 %，CaCl20. 46 %，KC1 0? 05 %，FeS04 ? 7H20 0? 001 %，K2HP040. 1 %，培养温度为 25°C。发酵产物经过滤除去发酵液后，菌丝体采用丙酮超声提取3次，将提取液合并回收溶 剂后经3倍量200~300目硅胶柱色谱分离，以体积配比为5 :1-1 :1的石油醚-丙酮混合 溶剂梯度洗脱，其中体积配比为3 :1的石油醚-丙酮混合溶剂洗脱部分，经Sephadex LH-20 柱色谱，甲醇为洗脱剂纯化后得到式I化合物，收率为12mg/L。
[0031] 实施例2 :式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株和人白血病 K562细胞株的生长抑制实验：
[0032] HL-60或K562细胞培养于含有10%经加热灭活的胎牛血清、100IU/mL青霉素、 100 y g/mL链霉素及lmmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培养液中，置37°C、5% 0)2的饱和湿 度培养箱中孵育，待细胞70% -80%融合使用。称取台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水 稀释到4%的储存浓度，用滤纸过滤，4°C保存。使用时，将该储存液用PBS稀释至0. 4%工 作浓度。取HL-60或K562细胞以3X 104个/mL密度，每孔lmL接种于24孔板中后，随即加 入不同浓度药物或阳性对照药（终浓度为〇. l、〇. 5、1、3、10、30、100 yM)，对照组加入等容 积DMS0。孵育72小时后制备单个细胞悬液，取50 y L细胞悬液加入50 y L的0. 4%台盼蓝 溶液，混匀，在3分钟内，于显微镜下观察，用血球计数板分别计数各组活细胞和死细胞（死 细胞被染成蓝色，而活细胞拒染）。利用下列公式求得细胞生长抑制率并计算GI 5。，结果如 表2所示。抑制率=[1 -(加药孔细胞数/对照孔细胞数）]X 100%。
[0033] 表2式I化合物对HL-60和K562细胞的生长抑制作用[GI5Q±SE ( y M)，n = 6]
[0034]
[0035] 体外实验结果表明式I化合物在体外对人急性早幼粒白血病HL-60细胞株和人白 血病K562细胞株表现出显著的生长抑制作用，其作用均强于阳性对照药顺铂，因此具有开 发成为抗白血病药物的前景。
【主权项】
1. 具有如式I结构的聚酬化合物：2. -种制备如权利要求1所述聚酬化合物的方法，其特征在于，挑取刺囊壳属真菌 Usco皆icAs SP. ZJ-M-5)的抱子，直接接种到液体培养基中静置培养7~56天，其中培养 基由蒸馈水配制，包含薦糖2~4%，NaN〇3 0. 2~0. 4%，CaClz 0. 12~0. 92%，K2HPO4 0. 05~ 0. 15%，KCl 0. 03 ~0. 07%，FeS〇4 ? 7&0 0. 0005 ~0. 0015%，培养溫度为 20 ~30。C，发 酵产物经过滤除去发酵液后，菌丝体采用丙酬超声提取1~3次，将提取物合并后经1~20 倍量200~300目硅胶柱色谱分离，W体积配比为5 :1-1 :1的石油酸-丙酬混合溶剂梯度 洗脱，其中体积配比为3 :1的石油酸-丙酬混合溶剂洗脱部分得到式I化合物。3. -种药物组合物，包括权利要求1所述的化合物和药学上可接受的载体。4. 权利要求1所述的化合物或权利要求3所述的组合物在制备抗白血病药物中的应 用。5. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的刺囊壳属真菌保藏编号为 CGMCC No. 8278O
【文档编号】C12R1/645GK106032368SQ201510122517
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月19日
【发明人】李占林, 华会明, 王文静, 张金玲, 李丹毅
【申请人】沈阳药科大学