使用具有过表达yajL基因的肠肝菌科细菌生产L-氨基酸的方法

使用具有过表达yajL基因的肠肝菌科细菌生产L-氨基酸的方法
【专利摘要】本发明提供通过使用肠杆菌科的细菌，特别是属于埃希氏菌属的细菌发酵生产L?氨基酸或其盐的方法，所述细菌已经以过表达yajL基因的方式进行了修饰。VKPM B-792620000410 VKPM B-896120041206 VKPM B-738619970519 VKPM B-801220000718 VKPM B-399619870407 VKPM B-806620010130 FERM BP-154319810501
【专利说明】
使用具有过表达yajL基因的肠肝菌科细菌生产L-氨基酸的 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物学产业，并且具体来说涉及通过肠肝菌科细菌的发酵生产L-氨 基酸的方法，所述肠肝菌科细菌已经以过表达yajL基因的方式进行了修饰。
【背景技术】
[0002] 常规地，在产业上通过利用从天然来源获得的微生物菌株或其突变体的发酵方法 生产L-氨基酸。典型地，该微生物经修饰以提高L-氨基酸的生产产率。
[0003] 已经报道了许多提高L-氨基酸生产产率的技术，包括使用重组DNA的微生物转化 (见，例如美国No. 4,278,765A)和调节区的改变，如启动子，前导序列，和/或弱化子 (attenuator)，或本领域技术人员已知的其它调节区（见例如US20060216796 A1和 TO9615246 A1)。用于提高生产产率的其它技术包括增加参与氨基酸生物合成的酶的活性 和/或使目标酶对所得L-氨基酸的反馈抑制脱敏(见，例如W09516042 A1，EP068555 A1或美 国专利Nos.4,346,170 A，5,661,012 A和6,040,160 A)。
[0004]用于增强L-氨基酸生产产率的另一种方法是减弱以下基因的表达:参与目标L-氨 基酸降解的一个基因或几个基因，将目标L-氨基酸的前体从该氨基酸生物合成途径中转向 的基因，参与碳、氮和磷酸盐通量再分配的基因，以及编码毒素的基因等。
[0005] yajL基因编码YajL蛋白质，其属于PfpI/Hsp31/DJ-l超家族，所述PfpI/Hsp31/DJ-1超家族包括分子伴侣，肽酶，和蛋白质DJ_l(Messaoudi N.等，Global stress response in a prokaryotic model of DJ-1-associated Parkinsonism，J.Bacteriol?，2013，195 (6) :1167-1178)<^儿是01-1的最接近的原核同源物。例如，大肠杆菌也(：〇11外 &儿蛋白与 人DJ-1具有40%序列同一性和相似的三维结构，人DJ-1是一种癌基因和神经保护蛋白质， 其功能丧失突变体与某些类型的家族性，常染色体隐性帕金森症（Parkinsonism)相关 (Wilson M.A?等，The atomic resolution crystal structure of the YajL(ThiJ) protein from Escherichia co1i:a close prokaryotic homo 1ogue of the Parkinsonism-associated protein DJ-1，J.Mol.Biol?,2005,353(3):678_691)JajL和 DJ-1的高同源性和晶体结构的相似性提示该蛋白质具有相似的功能。最近发现YajL保护细 菌免受氧化应激和氧化应激诱导的蛋白聚集，可能是通过其分子伴侣功能和对基因表达的 控制（Kthiri F?等，Protein aggregation in a mutant deficient in YajL, the bacterial homolog of the Parkinsonism-associated protein DJ-1,J.Biol.Chem., 2010，285:10328-10336)。在大肠杆菌中，YajL作为共价分子伴侣发挥功能，当氧化应激时， 其与分子伴侣，蛋白酶，核糖体蛋白，过氧化氢酶，过氧化物酶，和FeS蛋白形成混合的二硫 化物（Messaoudi N?等，J.Bacteriol. ,2013,195(6): 1167-1178)。
[0006]迄今为止，尚未报道证明yajL基因的过表达对通过经修饰的肠肝菌科细菌菌株生 产L-氨基酸的影响的数据。

【发明内容】

[0007] 本发明的一个方面是提供属于肠肝菌科的细菌，其可以属于埃希氏菌属，更具体 的，属于大肠杆菌物种，其已经以过表达yajL基因的方式进行了修饰。
[0008] 本发明的另一个方面是提供了使用如后文所述的肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的 方法，例如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨 酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨 酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸或L-缬氨酸。
[0009] 通过以下出乎意料的发现实现了这些目的，即在属于肠肝菌科的细菌中yajL基因 的过表达对该微生物赋予更高的L-氨基酸生产率(productivity)，如特别是但不限于，丙 酮酸家族的L-氨基酸如L-缬氨酸，和芳香族L-氨基酸如L-苯丙氨酸，所述细菌可以属于埃 希氏菌属，且更具体的，属于大肠杆菌物种。
[0010] 本发明的一个方面是提供用于生产L-氨基酸的方法，包括：
[0011] (i)在培养基中培养肠杆菌科的产L-氨基酸的细菌，以在所述细菌中或所述培养 基中，或所述培养基和所述细菌中生产L-氨基酸;和
[0012 ] (i i)从所述细菌或所述培养基，或从所述细菌和所述培养基收集所述L-氨基酸，
[0013] 其中所述细菌已经以过表达yajL基因的方式进行了修饰。
[0014] 本发明的进一步的方面提供了如上文所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌 属。
[0015] 本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。
[0016] 本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中通过增加yajL基因的拷贝数 或修饰yajL基因的表达控制序列，使得与未修饰的细菌相比所述基因的表达增强来过表达 yajL基因。
[0017] 本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸选自L-苯丙氨 酸，L-色氨酸，L-酪氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱 氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫 氨酸，L-鸟氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸和L-缬氨酸。
[0018]本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸选自L-丙氨 酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸和L-苯丙氨酸。
[0019]本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨 酸。
[0020] 本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法，其中所述L-氨基酸是L-缬氨酸。
[0021] 发明详述
[0022]本发明在下面详细地描述。
[0023] 1 ?细菌
[0024]短语"产L-氨基酸的细菌"可以表示当在培养基中培养该细菌时，具有产生，排泄 (excrete)或分泌L-氨基酸，和/或引起L-氨基酸在培养基和/或细菌细胞中积累的能力的 肠杆菌科细菌。
[0025]短语"产L-氨基酸的细菌"也可以表示与野生型或亲本菌株，例如大肠杆菌K-12相 比能够以更大的量产生，排泄或分泌L-氨基酸，和/或引起L-氨基酸在培养基中积累的细 菌，且也可以表示该微生物能够引起不少于0.5g/L或不少于1. Og/L量的目标L-氨基酸在培 养基中积累。
[0026]短语"产L-氨基酸的能力"可以表示当在培养基中培养细菌时，所述细菌以下述水 平产生，排泄或分泌L-氨基酸，和/或引起L-氨基酸在所述培养基或所述细菌细胞内积累的 能力，所述水平使得可以从所述培养基或所述细菌细胞中收集L-氨基酸。
[0027]短语"L-氨基酸"可以表示L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨 酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨 酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸，L-酪氨 酸和L-缬氨酸。
[0028]短语"芳香族L-氨基酸"包括，例如L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸。由于L-组氨 酸具有芳香族部分，如咪唑环，除了上述芳香族L-氨基酸之外，短语"芳香族L-氨基酸"也可 以包括L-组氨酸。
[0029]短语"非芳香族L-氨基酸"包括，例如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨 酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨 酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸和L-缬氨酸。由于芳香族氨基酸 如L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸的合成途径与L-组氨酸的生物合成途径不同，除了上 述非芳香族L-氨基酸之外，短语"非芳香族L-氨基酸"也可以包括L-组氨酸。
[0030] L-氨基酸可以属于一个或多个L-氨基酸家族。作为例子，L-氨基酸可以属于谷氨 酸家族，包括L-精氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，和L-脯氨酸;丝氨酸家族，包括L-半胱氨酸， 甘氨酸，和L-丝氨酸;天冬氨酸家族，包括L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-异亮氨酸，L-赖氨酸， L-甲硫氨酸，和L-苏氨酸;丙酮酸家族，包括L-丙氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，和L-亮氨酸； 且芳香族家族包括L-苯丙氨酸，L-色氨酸和L-酪氨酸。由于一些L-氨基酸可以是特定L-氨 基酸的生物合成途径中的中间体氨基酸，上述氨基酸家族也可以包括其它L-氨基酸，例如 非生蛋白性(non-proteinogenic)L-氨基酸。例如，L-瓜氨酸和L-鸟氨酸是来自精氨酸生物 合成途径的氨基酸。因此，谷氨酸家族可以包括L-精氨酸，L-瓜氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰 胺，L-鸟氨酸，和L-脯氨酸。
[0031] L-精氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-赖氨酸，L-鸟氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-苏氨酸，L-色氨酸和L-缬氨酸是具体的例子。丙酮酸家族氨基酸如 L-丙氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，和L-亮氨酸是优选的例子。芳香族氨基酸如L-苯丙氨酸， L-色氨酸和L-酪氨酸仍是优选的例子。L-缬氨酸和L-苯丙氨酸是更优选的例子。
[0032]短语"L-氨基酸"不仅包括游离形式的L-氨基酸，而且还可以包括L-氨基酸的盐或 水合物，或由L-氨基酸和另一种有机或无机化合物形成的加合物。
[0033] 属于肠杆菌科的细菌可以来自肠杆菌属(Enterobacter)，欧文氏菌属(Erwinia)， 埃希氏菌属，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，摩根氏菌属(Morgane 11a)，泛菌属，发光杆菌属 (Photorhabdus)，普罗威登斯菌属(Providencia)，沙门氏菌属（Salmonella)，耶尔森氏菌 属(Yersinia)等等，并且可以具有产生L-氨基酸的能力。特别地，可以使用根据NCBI(国家 生物技术信息中心）数据库（www ? ncbi ? nlm? nih ? gov/Taxonomy/Browser/wwwtax ? cgi?id = 543)中使用的分类法归入肠杆菌科的那些细菌。可以修饰的来自肠肝菌科的菌株的例子包 括埃希氏菌属，肠杆菌属，或泛菌属的细菌。
[0034] 可以经修饰以获得依照本公开的主题的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属细菌菌株 没有具体限制，并且特别地，可以使用Neidhardt等的工作中描述的那些菌株(Bachmann, B.J.,Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E.coli K~12, p.2460-2488.In F.C.Neidhardt et al.(ed.),E.coli and Salmonella:cellular and molecular biology,2nd ed.ASM Press,Washington,D.C. ,1996)。大肠杆菌物种是具体的 例子。大肠杆菌的具体例子包括大肠杆菌W3110(ATCC27325)，大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等等，其来源于原型野生型菌株，大肠杆菌K-12菌株。这些菌株可以从例如美国典型 培养物保藏中心（American Type Culture Collection)(P.0.Box 1549，Manassas，VA 20108，United States of America)获得。也就是说，对于每个菌株给出了登记号，并且可 以通过使用这些登记号订购菌株(参见http://www.atcc.org)。菌株的登记号列在美国典 型培养物保藏中心的目录中。
[0035] 肠杆菌属细菌的例子包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)等等。泛菌属细菌的例子包括菠萝泛菌(Pantoea ananatis)等 等。基于16S rRNA的核苷酸序列分析等，成团肠杆菌的一些菌株最近重新分类为成团泛菌 (Pantoea agglomerans)，菠萝泛菌，或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。可以使用属于肠杆 菌属或泛菌属的任一个的细菌，只要它是分类为肠杆菌科的细菌。当通过遗传工程技术培 育菠萝泛菌时，可以使用菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)及其衍生物。这些菌株当它们被分离时鉴定为成团肠 杆菌，并且以成团肠杆菌保藏。然而，如上文所述，基于16S RNA的核苷酸测序等，它们最近 重新分类为菠萝泛菌。
[0036]产L-氨基酸的细菌
[0037]可以使用属于肠杆菌科并以过表达yajL基因的方式修饰的细菌，其能够生产芳香 族或非芳香族L-氨基酸。
[0038]所述细菌可以固有地具有产L-氨基酸的能力，或可以通过使用突变方法或DNA重 组技术修饰以具有产L-氨基酸的能力。可以通过在固有地具有产L-氨基酸的能力的细菌中 过表达yajL基因来获得所述细菌。或者，可以通过将产L-氨基酸的能力赋予已经使yajL基 因过表达的细菌来获得所述细菌。
[0039]所述细菌可以单独或以两种或更多种L-氨基酸的混合物产生L-氨基酸。
[0040]产L-精氨酸的细菌
[0041]可以用于衍生产L-精氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌 属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请No. 2002/058315 A1)和其含 有突变体N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(RU2215783)，大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)(EP 1170358A1)，一种产精氨酸的菌株，向其中引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因 (EP1170361 A1)等等。
[0042]可以用于衍生产L-精氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中编码L-精氨酸生 物合成酶的一种或多种基因的表达增强的菌株。此类基因的例子包括编码以下酶的基因： N-乙酰-y -谷氨酰磷酸还原酶(acetyl- y -glutamylphosphate reductase，argC)、鸟氨酸 乙酰转移酶（ornithine acetyltransferase，argj)、N_ 乙酰谷氨酸激酶（N_ acetylglutamate kinase，argB)、N_ 乙酰鸟氨酸转氨酶（N-acetylornithine aminotransferase，argD)、鸟氨酉爱氨基甲酉先车专移酉每（ornithine carbamoyltransferase, argF)、精氨基琥泊酸合酶(argininosuccinate synthase ,argG)、精氨基琥泊酸裂合酶 (argininosuccinate lyase，argH)，和氨甲酉先磷酉爱合成酉每（carbamoyl phosphate synthetase，carAB)〇 [0043]产L-瓜氨酸的细菌
[0044]可以用于衍生产L-瓜氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌 属的菌株，如大肠杆菌突变体N-乙酰谷氨酸合酶菌株237/pMADSll，237/pMADS12,和237/ pMADS13(俄罗斯专利吣.2215783，欧洲专利吣.117036181，美国专利如.6,790,64782)，大 肠杆菌333菌株(VKPM B-8084)和374菌株(VKPM B-8086)，两者都含有突变体反馈抗性的氨 甲酰磷酸合成酶(俄罗斯专利RU2264459C2)，其中a-酮戊二酸合酶活性增加，并且铁氧还原 蛋白NADP+还原酶，丙酮酸合酶，或a-酮戊二酸脱氢酶活性另外修饰的大肠杆菌菌株(EP 2133417A1)，以及菠萝泛菌NAlsucAsdhA菌株，其中琥珀酸脱氢酶和a-酮戊二酸脱氢酶活性 降低（美国专利申请No. 2009286290)等等。
[0045]由于L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途径的中间体，可以用于衍生产L-瓜氨酸的细 菌的亲本菌株的例子包括其中编码L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达增强的 菌株。此类基因的例子包括但不限于编码以下酶的基因:N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰 谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、N-乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟 氨酸脱乙酰基酶(argE)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF/I)、和氨甲酰磷酸合成酶(carAB)，或 其组合。
[0046]还可以通过由argG基因编码的精氨基琥珀酸合酶的失活，容易地从任何产L-精氨 酸的细菌，例如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)获得产L-鸟氨酸的细菌。
[0047]产L-半胱氨酸的细菌
[0048]可以用于衍生产L-半胱氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏 菌属的菌株，如使用编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌 JM15(美国专利No. 6，218，168，俄罗斯专利No. 2279477 )，具有过表达的编码适合于分泌细 胞毒性物质的蛋白质的基因的大肠杆菌W3110 (美国专利No. 5，972，663 )，具有降低的半胱 氨酸脱巯基酶活性的大肠杆菌菌株(JP11155571 A2)，具有由cysB基因编码的半胱氨酸调 节子的正转录调控物的活性增加的大肠杆菌W3110(W00127307 A1)等等。
[0049]产L-谷氨酸的细菌
[0050]可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌 属的菌株，如大肠杆菌VL334thrC+(EP 1172433 A1)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是一种 具有thrC和i lvA基因中的突变的L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株(美国专利No . 4， 278,765)。通过使用在野生型大肠杆菌K-12菌株(VKPM B-7)细胞上培养的噬菌体P1进行的 通用转导方法转移thrC基因的野生型等位基因。结果，得到了L-异亮氨酸营养缺陷型菌株 VL334thrC+(VKPM B-8961)，其能够产生L-谷氨酸。
[0051]可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于其中编码L-谷 氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。此类基因的例子包括编码以下 酶的基因：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸 脱氢酶（icdA)、乌头酸水合酶(acnA、acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (ppc)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF、lpdA)、丙酮酸激酶(pykA、pykF)、磷酸稀 醇式丙酮酸合酶(PPsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA、pgmI)、磷酸甘油酸激酶 (pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、磷酸丙糖异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷 酸果糖激酶(pfkA，pfkB)，和磷酸葡糖异构酶(pgi)。
[0052]经修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢 酶基因的表达增强的菌株的例子包括EP 1078989 A2、EP955368 A2和EP952221 A2中公开 的那些菌株。
[0053]可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括具有降低或消除的酶 活性的菌株，所述酶通过从L-谷氨酸生物合成途径分叉而催化与L-谷氨酸不同的化合物的 合成。此类酶的例子包括异柠檬酸裂合酶(aceA)、a-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、磷酸转乙酰酶 (pta)、乙酸激酶（ack)、乙酰轻酸合酶（ilvG)、乙酰乳酸合酶（ilvl)、甲酸乙酰转移酶 (pfl)、乳酸脱氢酶（ldh)，和谷氨酸脱羧酶(gadABha-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或具有降 低的酮戊二酸脱氢酶活性的属于埃希氏菌属的细菌和用于获得它们的方法描述于美国 专利No. 5，378，616和5，573，945。具体地，这些菌株包括以下：
[0054] 大肠杆菌W3110sucA: :KmR，
[0055] 大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)，
[0056] 大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)，
[0057] 大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)。
[0058] 大肠杆菌W3110sucA: :KmR是通过破坏大肠杆菌W3110的a-酮戊二酸脱氢酶基因 (此后称为"sucA基因"）获得的菌株。该菌株是a-酮戊二酸脱氢酶完全缺陷的。
[0059]产L-谷氨酸的细菌的其它例子包括属于埃希氏菌属并且对天冬氨酸抗代谢物具 有抗性的那些菌株。这些菌株也可以在酮戊二酸脱氢酶活性中有缺陷，并包括例如大肠 杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利No. 5，908，768)，FFRM P-12379，其另外具有低的L-谷氨酸分解能力（美国专利如.5,393,671)，六113138$￡1?18?-5565)(美国专利吣.6，110， 714)等等。
[0060]产L-谷氨酸的细菌的例子包括属于泛菌属的突变体菌株，其在a-酮戊二酸脱氢酶 活性中有缺陷或具有降低的酮戊二酸脱氢酶活性，并且可以如上文所述获得。此类菌株 包括菠萝泛菌AJ13356(美国专利如.6,331，419)。菠萝泛菌六113356于1998年2月19日以保 藏号FERM P-16645保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industry(目前，Incorporated Administrative Agency,National Institute of Technology and Evaluation,International Patent Organism Depositary(NITE-IP0D) ,#120,2-5-8Kazusakamatari ,Kisarazu_shi ,Chiba_ken 292-0818 JAPAN)。然后，于 1999年1月11日依据布达佩斯条约的规定将它转为国际保藏物，并且接受了保藏号FERM BP-6615。由于aK⑶H-E1亚基基因（sucA)的破坏，菠萝泛菌AJ13356在a-酮戊二酸脱氢酶活 性中有缺陷。上述菌株当它被分离时鉴定为成团肠杆菌，并且保藏为成团肠杆菌AJ13356。 然而，基于16S rRNA核苷酸测序等，它最近重新分类为菠萝泛菌。虽然AJ13356在上述保藏 单位作为成团肠杆菌保藏，为了本说明书的目的，将它们描述为菠萝泛菌。
[0061 ]产L-组氨酸的细菌
[0062]可以用于衍生产L-组氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌 属的菌株，如大肠杆菌24菌株(VKPM B-5945，RU 2003677)、大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270, RU2119536)、大肠杆菌NRRL B-12116-B-12121(美国专利如.4,388,405)、大肠杆菌11-9342 (FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利勖.6,344,347)、大肠杆菌11-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087)、大肠杆菌AI80/pFM201 (美国专利No ? 6，258，554)等。
[0063]可以用于衍生产L-组氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中编码L-组氨酸生 物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。此类基因的例子包括编码以下酶的基 因:ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环水解酶(hisl)、磷酸核糖基-ATP环水解 酶/磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(hisIE)、磷酸核糖基亚胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核苷酸异 构酉每（phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase, hisA)、酰胺转移酶（amidotransferase ,hisH)、组胺醇磷酸氨基转移酶（histidinol phosphate aminotransferase ,hisC)、组胺醇磷酸酶（histidinol phosphatase ,hisB)和 组胺醇脱氢酶(histidinol dehydrogenase,hisD)等等。
[0064] 已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶受到L-组氨酸的抑制，并且因 此也可以通过将对赋予反馈抑制抗性的突变引入ATP磷酸核糖基转移酶中来有效增强产L-组氨酸的能力(俄罗斯专利No. 2003677和2119536)。
[0065]具有产L-组氨酸的能力的菌株的具体例子包括大肠杆菌FERM-P 5038和5048,其 已经使用携带编码L-组氨酸-生物合成酶的DNA的载体转化(JP 56-005099 A)，使用rht( - 种用于氨基酸输出的基因）转化的大肠杆菌菌株(EP1016710 A)，赋予磺胺胍，DL-1，2,4-三 唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，RU2119536)等等。
[0066]产L-异亮氨酸的细菌
[0067]可以用于衍生产L-异亮氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于具有对6-二 甲基氨基嘌呤抗性的突变体(JP 5-304969A)，具有对异亮氨酸类似物，如硫代异亮氨酸和 异亮氨酸异羟肟酸盐抗性的突变体，和另外地具有对DL-乙硫氨酸和/或精氨酸异羟肟酸盐 (arginine hydroxamate)抗性的突变体(JP 5-130882 A)。另外，用编码参与L-异亮氨酸生 物合成的蛋白，如苏氨酸脱氨酶和乙酰醇酸合酶(acetohydroxate synthase)的基因转化 的重组菌株也可以用作亲本菌株(JP 2-458A，EP0356739 A1，和美国专利No.5,998，178)。 [0068]产L-亮氨酸的细菌
[0069] 可以用于衍生产L-亮氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌 属的菌株，如对亮氨酸(例如，57菌株(VKPM B-7386，美国专利No. 6，124，121))或对亮氨酸 类似物抗性的大肠杆菌菌株，所述亮氨酸类似物包括0-2-噻吩丙氨酸（0-2_ 1：11161171&1&11；[116)、3-羟基亮氨酸(3-117(11'(?71611(3；[116)、4-氮杂亮氨酸(4-&2&1611(3；[116)和5， 5,5-三氟亮氨酸（5,5,5-trifluoroleucine)(JP 62-34397 B和JP 8-70879 A);通过W096/ 06926中所述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株;大肠杆菌H-9068(JP 8-70879 A)等等。
[0070] 可以通过增强参与L-亮氨酸生物合成的一种或多种基因的表达改进所述细菌。例 子包括leuAB⑶操纵子的基因，其可以以突变体leuA基因代表，所述突变体leuA基因编码解 除L-亮氨酸的反馈抑制的异丙基苹果酸合酶(a-isopropylmalate synthase)(美国专利 No.6,403,342)。另外，可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的一种或多种 基因的表达改进所述细菌。此类基因的例子包括b2682和b2683基因（ygaZH基因） (EP1239041 A2)。
[0071]产L-赖氨酸的细菌
[0072]属于埃希氏菌家族的产L-赖氨酸的细菌的例子包括具有对L-赖氨酸类似物的抗 性的突变体。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是当L-赖氨酸存在于 培养基中时，该抑制被完全或部分脱敏。L-赖氨酸类似物的例子包括但不限于氧杂赖氨酸 (oxalysine)、赖氨酸异轻聘酸盐（lysine hydroxamate)、S-(2_氨基乙基）-L-半胱氨酸 (AEC)、y -甲基赖氨酸、a-氯己内酰胺(a-chlorocaprolactam)等等。可以通过将属于埃希 氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理，获得对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体。可 用于生产L-赖氨酸的细菌菌株的具体例子包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543、NRRL B-12185;见美国专利如.4,346，170)和大肠杆菌￥1611。在这些微生物中儿-赖氨酸对天冬氨 酸激酶(aspar tokinas e)的反馈抑制是脱敏的。
[0073]可以用于衍生产L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中编码L-赖氨酸生 物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。此类基因的例子包括但不限于编码以 下酶的基因：二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase，dapA)、天冬氨酸激酶 (lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶 (ddh)(美国专利No . 6,040，160)、磷酸稀醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶 (asd)、和天冬氨酸酶(aspA)(EP 1253195 A1)。另外，所述亲本菌株可以具有参与能量效率 的基因（cyo) (EP1170376 A1 )，编码烟酰胺核苷酸转氢酶（nicotinamide nucleotide transhydrogenase)的基因（pntAB)(美国专利No ? 5，830，716)、yb jE基因（TO2005/073390)， 或其组合的表达水平升高。
[0074]产L-氨基酸的细菌可以具有降低的酶活性或无酶活性，所述酶催化引起从L-氨基 酸生物合成途径分叉，并且导致另一种化合物的产生的反应。另外，所述细菌可以具有降低 的酶活性或无酶活性，所述酶负面作用于L-氨基酸合成或积累。参与L-氨基酸产生的此类 酶的例子包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA，ldcC)、苹果酸酶等等，并且其中这些 酶的活性被减少或删除的菌株公开于W095/23864、W096/17930、W02005/010175等等。
[0075]为了减少或删除赖氨酸脱羧酶活性，可以减少编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基 因两者的表达。可以通过例如W02006/078039中所述的方法减少两个基因的表达。
[0076] 产L-赖氨酸的细菌的例子可以包括大肠杆菌WC196 AcadAA ldcC/pCABD2菌株 (TO2006/078039)。通过向具有被破坏的编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因的WC196菌株 中引入含有赖氨酸生物合成基因的质粒pCABD2(美国专利No. 6，040，160)获得该菌株。 [0077] WC196菌株从W3110菌株培育，其来源于大肠杆菌K-12,通过使用编码突变体天冬 氨酸激酶III的突变体lysC基因代替W3110菌株染色体上的野生型lysC基因得到，所述突变 体天冬氨酸激酶III中位置352处的苏氨酸被异亮氨酸替代，导致对L-赖氨酸反馈抑制的脱 敏(美国专利如.5,661，012)，并对所得的菌株赋予六￡(：抗性(美国专利5,827,698)。1(：196菌 株指定为大肠杆菌AJ13069,于1994年12月6日保藏在National Institute of Bioscience and Human Technology,Agency of Industrial Science and Technology(目前，NITE IPOD ,#120，2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu_shi，Chiba_ken，292-0818 Japan)，并且指定 了保藏号FERM P-14690。然后，于1995年9月29日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏， 并且分配了保藏号FERM BP-5252 (美国专利No. 5，827，698)。
[0078] WC196 AcadAA ldcC菌株自身也是例示性的产L-赖氨酸的细菌。WC196 AcadAA ldc指定为AJ110692,并于2008年10月7日以保藏号FERM BP-11027作为国际保藏物保藏在 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depo s i tary (目前，NITE IPOD ,#120,2-5-8Kazusakamatari，Kisarazu_shi，Chiba-ken，292-0818，Japan)。产L_甲硫氨酸的细菌 [0079]产L-甲硫氨酸的细菌及可以用于衍生产L-甲硫氨酸的细菌的亲本菌株的例子包 括但不限于大肠杆菌菌株，如AJ11539(NRRL B-12399)、AJ11540(NRRL B-12400)、AJ11541 (NRRL B-12401)、AJ11542(NRRL B-12402)菌株(专利GB2075055);对正亮氨酸（L-甲硫氨酸 类似物）有抗性的218菌株（VKPM B-8125)(专利RU2209248)和73菌株(VKPM B-8126)(专利 RU2215782)等等。大肠杆菌73菌株于2001年5月14日在保藏号VKPM B-8126下保藏于俄罗斯 国家工业微生物保藏中心（Russian National Collection of Industrial Microorganisms)(VKPM)FGUP GosNII Genetika(lDorozhny proezd,IMoscow 117545, Russian Federation)，并于2002年2月1日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏物。此 外，甲硫氨酸阻遏物缺陷菌株和使用编码参与L-甲硫氨酸生物合成的蛋白质如高丝氨酸转 琥I白酰基酶(homoserine transsuccinylase)和胱硫醚y -合酶的基因转化的重组菌株(JP 2000-139471A)也可以用作其亲本菌株。
[0080] 产L-鸟氨酸的细菌
[0081] 可以通过由argF和argl基因两者编码的鸟氨酸氨甲酰基转移酶的失活，从任意产 L-精氨酸的细菌，如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)容易地得到产L-鸟氨酸的细菌。用于 鸟氨酸氨甲酰基转移酶的失活的方法描述于本文。
[0082]产L-苯丙氨酸的细菌
[0083]可以用于衍生产L-苯丙氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏 菌属的菌株，如大肠杆菌AJ12739(tyrA: : TnlO，tyrR) (VKPM B-8179)，含有突变体pheA34基 因的大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(美国专利No .5,354,672)，大肠杆菌MWEC101-b (KR8903681)，大肠杆菌NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国 专利吣.4,407,952)。另外，大肠杆菌1(-12[13110(七7^)/^撤8](?￡1?18?-3566)、大肠杆菌 K-12[W3110(tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659)、大肠杆菌 K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)和大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-arpG4，pACMAB]，命名为AJ12604 (FERM BP-3579)可以用作亲本菌株(EP488424B1)。此外，还可以使用属于大肠埃希氏菌属 的产L-苯丙氨酸的细菌，其具有提高的由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性(美国 专利申请2003/0148473A1 和2003/0157667A1)。
[0084]产L-脯氨酸的细菌
[0085]可以用于衍生产L-脯氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌 属的菌株，如大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)，其在ilvA基因中是缺陷的且能够产生L-脯 氨酸(EP1172433A1)。可以通过增强参与L-脯氨酸生物合成的一种或多种基因的表达来改 进该细菌。可以用于产L-脯氨酸的细菌中的基因的例子包括编码具有脱敏的L-脯氨酸反馈 抑制的谷氨酸激酶的proB基因（DE3127361A1)。另外，可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的一种或多种基因的表达来改进该细菌。此类基因通过b2682和b2683基因 (ygaZH 基因）示例（EP1239041A2)。
[0086]具有产生L-脯氨酸的活性的属于埃希氏菌属的细菌的例子包括以下大肠杆菌菌 株：冊此8-12403和冊此8-12404(68专利2075056)、￥仙]?8-8012(俄罗斯专利申请 N〇.2000124295)，DE312761A1 中描述的质粒突变体，由Bloom F.R?等在"The 15th Miami winter symposium"，1983，p.34中描述质粒突变体等等。
[0087]产L-苏氨酸的细菌
[0088] 可以用于衍生产L-苏氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌 属的菌株，例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利No. 5，175，107，美国专利 吣.5,705,371)、大肠杆菌472123/^丫阶(厶1〇： 98081)(美国专利吣.5,631，157)、大肠杆菌 此8-21593(美国专利勖.5,939,307)、大肠杆菌？￡1^8?-3756(美国专利勖.5,474， 918)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利如.5,376,538)、大肠杆菌1^442 (Gusyatiner M?等，Genetika(Russian)，1978，14:947-956)、大肠杆菌VL643和VL2055(EP 1149911 A2)等等。
[0089] TDH-6菌株是thrC基因缺陷以及鹿糖-同化（sucrose-assimilative)的，并且ilvA 基因具有渗漏突变（leaky mutation)。该菌株在rhtA基因中也具有突变，其赋予对高浓度 的苏氨酸或高丝氨酸的抗性。B-3996菌株含有质粒pVIC40,其是通过将thrA*BC操纵子插入 RSF1010-衍生的载体中获得，所述操纵子包括突变体thrA基因。该突变体thrA基因编码具 有实质性脱敏的苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I。该B-3996菌株于1987 年 11 月19日在保藏号RIA 1867下保藏在All-Union Scientific Center of Antibiotics (Russian Federation, 117105Moscow，Nagatinskaya Street 3_A)。该菌株还于 1987年4月 7日在保藏号VKPM B-3996下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM)F⑶P GosNII Genetika(lDorozhny proezd,IMoscow 117545，Russian Federation)。
[0090] 大肠杆菌VKPM B-5318(EP0593792A1)也可以用作亲本菌株用于衍生产L-苏氨酸 的细菌。B-5318菌株就异亮氨酸而言是原养型的；且温度敏感型A-噬菌体Cl阻遏物和PR启 动子替代质粒PVIC40中的苏氨酸操纵子的调控区。VKPM B-5318菌株于1990年5月3日在保 藏号VKPM B-5318下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)F⑶P GosNII Genetika (lDorozhny proezd,IMoscow 117545，Russian Federation)。
[0091]该细菌可以另外地经修饰以增强一种或多种以下基因的表达：
[0092] _突变体thrA基因，其编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱 氢酶I;
[0093] -thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；
[0094] -thrC基因，其编码苏氨酸合酶；
[0095] -rhtA基因，其编码苏氨酸和高丝氨酸流出系统的推定跨膜蛋白；
[0096] -asd基因，其编码天冬氨酸-0-半醛脱氢酶;和
[0097] -aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶）；
[0098]已经阐明了编码大肠杆菌的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因 (KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,条目号b0002;GenBank登录号NC_ 000913.2;核苷酸位置：337至2,799;基因ID:945803)。该thrA基因位于大肠杆菌K-12的染 色体上的thrL和thrB基因之间。
[0099]已经阐明了编码大肠杆菌的高丝氨酸激酶的thrB基因（KEGG条目号b0003 ; GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置：2，801 至3，733;基因 ID: 947498)。thrB基因位于 大肠杆菌K-12染色体上的thr A和thrC基因之间。
[0100] 已经阐明了编码大肠杆菌的苏氨酸合酶的thrC基因（KEGG条目号b0004 ;GenBank 登录号NC_000913.2;核苷酸位置:3，734至5，020;基因ID: 945198)。thrC基因位于大肠杆菌 K-12染色体上的thrB基因和yaaX基因之间。全部三个基因作为单个的苏氨酸操纵子thr ABC 发挥功能。为了增强该苏氨酸操纵子的表达，期望从该操纵子移除影响转录的弱化子区 (W02005049808 A1,W02003097839 Al)〇
[0101]突变体thrA基因，其编码对L-苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶I和高丝氨 酸脱氢酶I，以及thrB和thrC基因可以作为一个操作子从公知的质粒pVIC4获得，所述质粒 存在于产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPM B-3996中。质粒pVIC4详细描述于美国专利5，705， 371 中。
[0102]已经阐明了rhtA基因，其编码大肠杆菌的苏氨酸和高丝氨酸流出系统的蛋白（内 膜转运蛋白）（KEGG条目号b0813; GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:848，433至849， 320，互补物;基因ID: 947045) ahtA基因位于大肠杆菌K-12的染色体上的dps和ompX基因之 间，与glnHPQ操纵子(其编码谷氨酰胺转运系统的组分)接近。rhtA基因与ybiF基因(KEGG条 目号b0813)相同。
[0103]已经阐明了asd基因，其编码大肠杆菌的天冬氨酸-0-半醛脱氢酶（KEGG条目号 b3433; GenBank 登录号 NC_000913.2;核苷酸位置：3，571，798至3，572，901，互补物；基因 ID: 947939)。&8(1基因位于在大肠杆菌K-12的染色体上的同一条链上的glgB和gntU基因（相反 链上的yhgN基因）之间。
[0104]另外，已经阐明了aspC基因，其编码大肠杆菌的天冬氨酸氨基转移酶(KEGG条目号 130928;661^31^登录号叱_000913.2;核苷酸位置：983,742至984,932，互补物 ；基因10: 945553)。&叩(：基因位于大肠杆菌K-12的染色体上相反链上的ycbL基因和同一条链上的 ompF基因之间。
[0105]产L-色氨酸的细菌
[0106] 可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌 属的菌株，如大肠杆菌 JP4735/pMU3028(DSM10122)和 JP6015/pMU91(DSM10123)，其在由突 变体trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶上缺陷（美国专利No. 5，756，345)，大肠杆菌SV164 (PGH5)，其具有编码解除丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码解除 色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因（美国专利N〇.6，180,373)，酶色氨酸 酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44) (NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美 国专利如.4,371，614)，大肠杆菌六6乂17/^6乂50 4六〇?41口8，其中磷酸烯醇式丙酮酸生产能 力得到增强(W09708333,美国专利如.6.319,696)等等可以使用。还可以使用具有由 76(1八基 因或yddG基因编码的鉴定蛋白质的活性增强的属于埃希氏菌属的产L-色氨酸的细菌(美国 专利申请No.2003148473 A1 和2003157667 A1)。
[0107] 可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中选自邻氨基苯甲 酸合酶，磷酸甘油酸脱氢酶和色氨酸合酶的酶的一种或多种活性增强的菌株。邻氨基苯甲 酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此，可以将脱 敏该反馈抑制的突变引入这些酶中。具有此类突变的菌株的具体例子包括大肠杆菌sv 164，其含有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶，和通过向大肠杆菌SV164导入质粒pGH5获得的转化 体菌株(W0 94/08031)，所述质粒pGH5含有编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变体 serA基因。
[0108]可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中已经引入了色氨 酸操纵子的菌株，所述色氨酸操纵子含有编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因（1?57_ 71397 A，JP 62-244382 A，美国专利No.4,371，614)。此外，可以通过增强色氨酸操纵子 (trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达，赋予产L-色氨酸的能力。所述色氨酸合酶由分别 由trpA和trpB基因编码的a和0亚基组成。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶 操纵子的表达，改进产L-色氨酸的能力(W02005/103275)。
[0109]产L-缬氨酸的细菌
[0110] 可以用于衍生产L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于以过表达 i 1 vGMEDA操纵子的方式修饰的菌株(美国专利No. 5，998，178)。期望除去i 1 vGMEDA操纵子中 对于弱化所要求的区域，使得该操纵子的表达不被产生的L-缬氨酸弱化。此外，期望的是该 操纵子中的i lvA基因被破坏，使得苏氨酸脱氨酶活性降低。
[0111] 用于衍生产L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括具有氨基酰基tRNA合成酶 中具有突变的突变体(美国专利No. 5，658，766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，其在编码 异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日在保藏号 VKPM B-4411下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM)FGUP GosNII Genetika (lDorozhny proezd,IMoscow 117545，Russian Federation)。
[0112] 此外，需要硫辛酸用于生长和/或缺乏H+-ATP酶的突变体也可以用作亲本菌株 (W096/06926)〇
[0113] 用于衍生产L-缬氨酸的细菌的亲本菌株还包括大肠杆菌H81菌株(VKPM B-8066; 见例如￡?194218381)，冊乩8-12287和冊乩8-12288(美国专利如.4,391，907)，￥即]?8-4411(美国专利No.5,658,766)，VKPM B-7707(欧洲专利申请EP1016710 A2)等等。
[0114]属于肠杆菌科的本发明的细菌已经以过表达yajL基因的方式修饰。
[0115] 短语"以过表达yajL基因的方式修饰的细菌"可以表示所述细菌以下述方式进行 了修饰，从而在该修饰的细菌中，对应的基因蛋白产物如YajL的总酶促活性与未修饰的菌 株，例如如上文和下文所述的野生型或亲本菌株相比增加，或yajL基因的表达水平比未修 饰的菌株，例如如上文和下文所述的野生型或亲本菌株中的水平更高。充当参照用于以上 比较的未修饰的菌株的例子可以包括属于埃希氏菌属的微生物的野生型菌株，如大肠杆菌 MG1655菌株(ATCC 47076)，W3110菌株(ATCC 27325)等等。
[0116] 短语"yajL基因是过表达的"可以表示与未修饰的菌株相比，对应的基因蛋白产物 如YajL蛋白的总酶活性增加，例如通过向细菌基因组中引入和/或增加yajL基因的拷贝数， 或增加由所述基因编码的蛋白的每分子活性(可以称作比活性)进行。可以修饰该细菌使得 每细胞的YajL蛋白活性增加到未修饰菌株的150 %或更多，200 %或更多，300 %或更多。 YajL的分子伴侣活性可以用于确定每mg蛋白质的比酶活性。例如，柠檬酸合酶可以用作对 照蛋白以测量还原或氧化条件下YajL的重折叠活性(Kthiri F.等，J.Biol .Chem. ,2010， 285:10328-10336)。可以通过Bradford蛋白测定（Bradford M.M.，Anal ? Biochem.，1976， 72:248-254)使用牛血清白蛋白作为标准品确定蛋白浓度。
[0117]短语"yajL基因是过表达的"也可以表示yajL基因的表达水平比未修饰的菌株中 的该水平高。因此，"yajL基因是过表达的"等同于短语"yajL基因的表达增强"。
[0118]可以用于增强yajL基因的表达的方法包括但不限于，根据本领域技术人员已知的 遗传工程化方法增加细菌基因组中（染色体中和/或自主复制质粒中）yajL基因拷贝数和/ 或将yajL基因引入载体中，所述载体能够增加肠肝菌科的细菌中yajL基因的拷贝数和/或 yajL基因的表达水平。
[0119] 载体的例子包括但不限于宽宿主范围质粒，如pMW118/119、pBR322、pUC19等等。也 可以通过例如同源重组，Mu-驱动的整合等将yajL基因的多个拷贝引入细菌的染色体DNA 中。可以使用在染色体DNA中具有多个拷贝的序列进行同源重组。在染色体DNA中具有多个 拷贝的序列包括但不限于，存在于可转座元件末端的反向重复或重复DNA。另外，将yajL基 因整合到转座子中并允许其转移以将yajL基因的多个拷贝引入染色体DNA中是可能的。通 过使用Mu-驱动的整合，可以在单次行为期间将基因的多于3个拷贝引入染色体DNA中 (Akhverdyan V. Z?等，Biotechnol ? (Russian)，2007，3:3-20) 〇
[0120] 还可以通过yajL基因的临近调控区的修饰或引入天然和/或经修饰的外来调控 区，通过增加yajL基因的表达水平实现增强yajL基因表达。调控区或序列可以通过启动子， 增强子，弱化子和终止信号，抗终止信号，核糖体结合位点（RBS)和其它表达控制元件（例 如，与抑制子或诱导子结合的区域和/或转录和翻译调控蛋白的结合位点，例如，在转录的 mRNA中）不例。此类调控区描述于例如Sambrook J.，Fritsch E.F?和Maniatis T.， "Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中。使用已知的方法可以将对控制基因表达的区域的修饰与增加细菌基因组 中该修饰的基因的拷贝数组合（见，例如A k h v e r d y a n V ? Z ?等， Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,91:857-871；Tyo K.E?J?等，Nature Biotechnol., 2009,27:760-765)〇
[0121]增强yajL基因表达的示例性启动子可以是有力的启动子，其比天然yajL启动子更 强。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lambdaB策菌体的Pr或Pl启动子 都是有力的启动子。可以使用在属于肠肝菌科的细菌中提供高水平的基因表达的有力的启 动子。或者，可以通过例如向yajL基因的启动子区中引入突变以获得更强的启动子功能来 增强启动子的效果，从而导致位于该启动子下游的yajL基因的增加的转录水平。此外，已知 Shine-Dalgarno(SD)序列中，和/或SD序列和起始密码子之间的间隔物中，和/或核糖体结 合位点中起始密码子紧接上游和/或紧接下游的序列中几个核苷酸的取代极大地影响mRNA 的翻译效率。例如，取决于起始密码子前的三个核苷酸的特性，发现了表达水平的20倍范围 (Gold L?等，Annu.Rev.Microbiol.，1981，35:365-403;Hui A?等，EMB0 J. ,1984,3:623-629) 〇
[0122]可以测量基因的拷贝数，存在或不存在，例如通过限制化处理染色体DNA，接着使 用基于基因序列的探针的Southern印迹，荧光原位杂交(FISH)等进行。可以使用多种公知 的方法，包括Northern印迹法，定量RT-PCR等，通过测量从基因转录的mRNA的量确定基因表 达的水平。可以通过已知的方法，包括SDS-P AGE，接着进行免疫印迹法测定(Western印迹法 分析），或蛋白样品的质谱术分析等，测量由基因编码的蛋白质的量。
[0123] 用于操作重组DNA分子和分子克隆的方法，如质粒DNA的制备，DNA的消化，连接和 转化，选择寡核苷酸作为引物，掺入突变等的方法可以是对于本领域的技术人员公知的普 通方法。这些方法描述于例如Sambrook J.，Fritsch E.F?和Maniatis T.，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)或Green M.R?和Sambrook J.R.,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，4th ed. ,Co 1d Spring Harbor Laboratory Press(2012);Bernard R.Glick,Jack J?Pasternak和Cheryl L?Patten,"Molecular Biotechnology:principles and applications of recombinant DNA"，4th ed.,Washington,DC,ASM Press(2009)〇
[0124] yajL基因编码氧化应激抗性的分子伴侣YajL(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,条目号b0424 ;Protein Knowledgebase ,UniProtKB/Swiss-Prot登录 号Q46948) jajL基因（GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:442275至442865,互补物； 基因10:945066)位于大肠杆菌1(-12菌株染色体上相同链上的口 &1^基因和相反链上的也11 基因之间。yajL基因的核苷酸序列和由yajL基因编码的YajL蛋白的氨基酸序列分别示于 SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 2中。在一些微生物中，YajL蛋白被错误地描述为参与硫胺素代 谢的Thi J(EcoGene :EG13272;http: //www ? ecogene ? org/old/geneinfo ? php?eg_id = EG13272)。该表型现在被归因于临近的 thil基因（T. Begley, personal communication cited in Mueller E.G?等，Identification of a gene involved in the generation of 4-thiouridine in tRNA，Nucleic Acids Res.,1998,26(11):2606_2610)〇
[0125] 由于在肠肝菌科的属，种或菌株之间DNA序列可能存在一些差异，yajL基因不限于 SEQ ID NO: 1中所示的基因，而可以包括作为SEQ ID NO: 1的变体核苷酸序列或与SEQ ID NO: 1同源，且编码YajL蛋白的变体的基因。
[0126] 短语"变体蛋白"可以表示与SEQ ID N0:2相比序列中具有一个或多个变化的蛋 白，不论它们是取代，缺失，插入和/或添加一个或几个氨基酸残基，但仍然维持了与YajL蛋 白相似的活性或功能，或相对于野生型或未修饰的蛋白，YajL蛋白的三维结构没有显著变 化。变体蛋白中的变化数目取决于蛋白的三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。其可以 是但不严格限于，SEQ ID N0:2中的1至30个，在另一个例子中1至15个，在另一个例子中1至 10个，和在另一个例子中1至5个。这是因为一些氨基酸彼此具有高同源性，使得这样的改变 不影响活性或功能，或YajL的三维结构相对于野生型或未修饰的蛋白没有显著改变。因此， 相对于SEQ ID N0: 2中所示的完整氨基酸序列，由yajL基因编码的蛋白变体可以具有不少 于70%，不少于80%，不少于90%，不少于95%，不少于98%，或不少于99%的同源性（其在 使用计算机程序BLAST时定义为参数"同一性"），只要维持了YajL蛋白的活性或功能，或 YajL的三维结构相对于野生型或未修饰的蛋白没有显著改变。
[0127] 示例性的取代，缺失，插入，和/或添加一个或几个氨基酸残基可以是保守突变。代 表性的保守突变为保守取代。保守取代可以是但不限于取代，其中如果取代位点是芳香族 氨基酸，那么取代在Phe、Trp和Tyr之间相互发生;如果取代位点是疏水氨基酸，那么在Ala、 1^11、116和\^1之间相互发生;如果取代位点是亲水性氨基酸，在6111、48。、6111、4811、561'、把8 和Thr之间相互发生；如果取代位点是极性氨基酸，在Gin和Asn之间相互发生；如果取代位 点是碱性氨基酸，在Lys、Arg和His相互发生;如果取代位点是酸性氨基酸，在Asp和Glu之间 相互发生;如果取代位点是具有羟基的氨基酸，在Ser和Thr之间相互发生。保守取代的例子 ^?SeroScThrllX^AlajGln ^isfiicLysIlX^ArgjGlu ,Gln ,Lys ^isoScAspIlX^Asn； Asn,GluH!c Gin 取代 Asp; Ser 或 Ala 取代 Cys; Asn ,Glu, Lys ,His, Asp 或 Arg 取代 Gin; Asn ,Gln ,Lys 或 Asp 取 代Glu;Pro取代Gly ;Asn,Lys ,Gln,Arg或Tyr取代His ;Leu,Met,Val或Phe取代lie; lie,Met， Val或Phe取代Leu;Asn，Glu，Gln，His或Arg取代Lys; lie，Leu, Val或Phe取代Met;Trp，Tyr， Met，I le或Leu取代Phe; Thr或Ala取代Ser; Ser或Ala取代Thr; Phe或Tyr取代Trp; Hi s，Phe或 Trp取代Tyr;和Met, lie或Leu取代Val。
[0128] 示例性的取代，缺失，插入，和/或添加一个或几个氨基酸残基也可以是非保守突 变，只要该突变被氨基酸序列的不同位置中的一个或多个次级突变(secondary mutation) 补偿，使得变体蛋白的活性或功能得到维持并与YajL蛋白的活性或功能相似，或YajL的三 维结构相对于野生型或未修饰的蛋白没有显著变化。
[0129] 为了评估蛋白或DNA同源性的程度，可以使用几种计算方法，如BLAST搜索、FASTA 搜索和ClustalW方法。BLAST(基本局部对比搜索工具，www .ncbi .nlm. nih.gov/BLAST/)搜 索是由 bias tp，bias tn，bias tx，megablast，tb las tn，和tblastx 程序米用的启发式搜索算 法(heuristic search algorithm);这些程序使用Karlin S?和Altschul S.F?的统计学方 法（Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87: 2264-2268;Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences ,Proc .Natl .Acad? Sci .USA, 1993,90: 5873-5877)，将显著性归于它 们的发现。计算机程序BLAST计算三个参数：得分，同一性和相似性。FASTA搜索方法由 Pearson W.R?描述（"Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA"，Methods Enzymol ?，1990，183 :63-98)。ClustalW方法由Thompson J.D?等人描述 ("CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice"，Nucleic Acids Res.，1994,22:4673-4680)〇
[0130] 此外，yajL基因可以是变体核苷酸序列。短语"变体核苷酸序列"可以表示编码"变 体蛋白"的核苷酸序列，其使用根据标准遗传密码表的任意同义氨基酸密码子（见例如 Lewin B.，"Genes VI11"，2004，Pearson Education,Inc.,Upper Saddle River,NJ 07458)。因此，yajL基因可以是由于遗传密码的简并性所致的变体核苷酸序列。
[0131] 短语"变体核苷酸序列"也可以表示但不限于在严格条件下与SEQ ID NO: 1中所示 的序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，或可以在严格条件下从核苷酸序列制备的探 针，只要其编码活性或功能性蛋白质。"严格条件"包括如下那些条件，在该条件下形成特异 性杂交体，例如具有不低于60%，不低于70%，不低于80%，不低于90%，不低于95%，不低 于96%，不低于97%，不低于98%，或不低于99%的同源性（当使用计算机程序BLAST时定义 为参数"同一性"）的杂交体，而不形成非特异性杂交体，例如具有低于上文的同源性的杂交 体。例如，严格条件可以通过以盐浓度为lxSSC(标准柠檬酸钠或标准氯化钠），0.1%SDS( + 二烷基硫酸钠），或在另一个例子中，0. lxSSC，0.1 %SDS在60°C或65°C洗涤一次或多次，或 在另一个例子中，两次或三次例示。洗涤的持续时间依赖于用于印迹法的膜类型，且通常， 应当是制造商所推荐的。例如，对于Amersham Hybond?-N+带正电荷的尼龙膜（GE Healthcare)，在严格条件下推荐的洗涤持续时间是15分钟。该洗涤步骤可以进行2至3次。 作为探针，也可以使用与SEQ ID NO: 1中所示序列互补的序列的一部分。可以使用寡核苷酸 作为基于SEQ ID NO: 1中所示的序列制备的引物和含有核苷酸序列的DNA片段作为模板通 过PCR产生此类探针。探针的长度推荐为>50bp;其可以根据杂交条件适当地选择，并通常为 lOObp至lkbp。例如，当具有约300bp长度的DNA片段作为探针使用时，杂交后的洗涤条件可 以以 2xSSC，0.1%SDS 在 50°C，60°C 或 65°C例示。
[0132] 由于已经阐明了大肠杆菌物种的编码YajL蛋白的基因（见上文），可以如下获得编 码YajL蛋白的yajL基因，和编码YajL蛋白的变体蛋白的变体核苷酸序列：利用基于yajL基 因的核苷酸序列制备的引物从属于肠杆菌科的细菌通过PCR(聚合酶链式反应;参见White T.J?等，The polymerase chain reaction,Trends Genet. ,1989,5:185-189)获得；或者通 过体外处理含有野生型yajL基因的DNA进行的定点诱变法(例如使用羟胺），或用于处理微 生物(例如含有野生型yajL基因的属于肠杆菌科的细菌)的方法，用紫外线(UV)照射或诱变 剂进行，如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和通常用于此类处理的亚硝酸;或者作为全 长基因结构化学合成。以相似的方式可以获得编码肠杆菌科的其它微生物的YajL蛋白或其 变体蛋白的基因。
[0133] 短语"野生型蛋白"可以表示由肠杆菌科的野生型或亲本细菌菌株，例如由野生型 大肠杆菌MG1655菌株天然产生的天然蛋白。野生型蛋白可以由天然存在于野生型细菌的基 因组中的"野生型基因"或"未修饰的基因"编码。
[0134] 可以通过修饰固有地具有产L-氨基酸的能力的细菌以过表达yajL基因来获得本 文所述的细菌，例如通过将前述的DNA引入细菌中。或者，可以通过将产L-氨基酸的能力赋 予已经经修饰以过表达yajL基因的细菌来获得本文所述的细菌。
[0135] 除了已经提到的特性外，在不偏离本发明的范围的情况下，细菌可以具有其它特 定的特性，如各种营养需求，药物抗性，药物敏感性和药物依赖性。2.方法
[0136] 本发明的方法包括用于生产L-氨基酸的方法，如L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰 胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮 氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨酸，L-苯丙氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏 氨酸，L-色氨酸，L-酪氨酸和L-缬氨酸，或其混合物。用于生产L-氨基酸的方法可以包括下 述步骤:在培养基中培养细菌以允许L-氨基酸产生，分泌，和/或在培养基中或在细菌细胞 中积累，以及从所述培养基和/或所述细菌细胞收集L-氨基酸。L-氨基酸可以以其盐形式或 水合形式，或其组合产生。例如，可以通过该方法产生L-氨基酸的钠、钾、铵等盐。L-氨基酸 可以与例如另一种有机或无机化合物的其加合物形式产生。特别地，可以通过该方法产生 L-氨基酸的单盐酸盐，如L-赖氨酸的单盐酸盐。
[0137] 细菌的培养，以及L-氨基酸从培养基的收集和纯化等可以以与常规发酵方法相似 的方式进行，其中使用微生物产生L-氨基酸。用于L-氨基酸的生产的培养基可以是合成的 或天然的培养基，如含有碳源，氮源，硫源，无机离子，和需要的其它有机和无机组分的典型 培养基。作为碳源，可以使用糖类，如葡萄糖，鹿糖，乳糖，半乳糖，果糖，阿拉伯糖，麦芽糖， 木糖，海藻糖，核糖，和淀粉水解物;醇，如乙醇，甘油，甘露糖醇，和山梨糖醇;有机酸，如葡 糖酸，富马酸，柠檬酸、苹果酸和琥珀酸；脂肪酸等。作为氮源，可以使用无机铵盐，如硫酸 铵，氯化铵和磷酸铵;有机氮，如大豆水解产物;氨气；氨水等。硫源可以包括硫酸铵，硫酸 镁，硫酸亚铁，硫酸锰等。维生素如维生素B1，需要的物质，例如有机营养物，如核酸，如腺嘌 呤和RNA，或酵母提取物等可以以适当量（即便是痕量)存在。除了这些，如果必要的话，可以 添加少量的磷酸钙，铁离子，锰离子等。
[0138] 可以在需氧条件下进行培养，持续16至72小时，或32至68小时;培养期间的培养温 度可以控制在30至45°C，或30至37°C内；且pH可以调节在5和8之间，或6.0和7.5之间。可以 通过使用无机或有机酸性或碱性物质，以及氨气调节pH。
[0139] 培养后，可以通过离心或膜过滤从液体培养基除去固体，如细胞和细胞碎片，然后 可以通过常规技术(例如浓缩，离子交换层析，和结晶）的任意组合从发酵液回收目标L-氨 基酸。 实施例
[0140] 本发明将参考以下非限制性实施例来更精确解释。
[0141]实施例1.以过表达yajL基因的方式修饰的大肠杆菌产L-缬氨酸的菌株的构建
[0142] 1.1已经修饰yajL调控区的大肠杆菌MG1655菌株的构建
[0143] 使用由Datsenko K.A.和Wanner B.L.开发的，称为"ARed/ET介导的整合"的方法 (Datsenko K ? A?和Wanner B ? L?，Proc ? Natl ? Acad ? Sci ? USA，2000，97(12): 6640-6645)改变 了大肠杆菌中yajL基因的表达。根据该程序，构建了PCR引物P1(SEQ ID N0:3)和P2(SEQ ID N0:4)，它们与邻近yajL基因和赋予氯霉素抗性(CmR)的基因的区域和临近模板染色体中启 动子的区域两者同源。氯霉素抗性大肠杆菌MG1655菌株的染色体用作PCR反应中的模板，所 述染色体含有tac样启动子，所述tac样启动子具有lacZ上游-35区作为TGGCCA(从5'-端到 3 ,-端）的结构（参见表 1，Katashkina J.L?等，Tuning the expression level of a gene located on a bacterial chromosome，Mol.Biol.(俄国Mosk.) ,2005,39(5) :719_726中的 克隆7) ICR的条件如下:95°C变性3分钟;35个循环的概况:95°C 1分钟，58°C 1分钟，72°C 1分 钟；最后的延伸：72°C5分钟。在琼脂糖凝胶中纯化获得的DNA片段1 (1，768bp) (SEQ ID N0: 5)并用于大肠杆菌MG1655菌株(ATCC 47076)的电穿孔，所述大肠杆菌MG1655菌株含有具有 温度敏感型复制起点的质粒PKD46。该pKD46质粒（Datsenko K.A.和Wanner B.L.， Proc.Natl.Acad.Sci .USA,2000,97(12): 6640-6645)包括噬菌体人的2,154nt(31088-33241)的DNA片段(GenBank登录号J02459)并含有在阿拉伯糖诱导型P araB启动子控制下的入 Red同源重组系统的基因（y、f3、exo基因）JKD46质粒对于DNA产物整合到大肠杆菌M1655菌 株的染色体中是必要的。
[0144] 如下制备单感受态细胞:在含有氨苄青霉素（100mg/L)的LB培养基（5&1111^〇(^，入 和Russell，D.W."Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))中在30°C培养大肠杆菌MG1655细胞过夜，并且用5mL含 有氨苄青霉素（l〇〇mg/L)和L-阿拉伯糖（lmM)SOB培养基（Sambrook J.，Fritsch E.F?和 Maniatis T?，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press( 1989))稀释培养物。获得的培养物在30°C通气（250rpm)培养至 OD6Q0为约0.6,接着通过浓缩100倍并使用冰冷的去离子H 20洗涤三次制成电感受态。使用70 此细胞和约100ng的DNA片段1进行电穿孔。接着，使用lmL的S0C培养基（Sambrook J.et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd ed.),Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)在37°C孵育细胞达2 ? 5小时，放置到含有LB培养基（Sambrook，J ? 和Russell，D.W."Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))，琼脂（1.5% )和氯霉素（lOmg/L)的平板上，并在37°C培 养以选择CmR-重组体。为了消除pKD46质粒，在42 °C在有氯霉素(20mg/L)的L-琼脂上进行了 1次传代，且对获得的菌落测试对氨苄青霉素的敏感性。因此，获得了大肠杆菌MG1655P tac7_ yajL菌株。
[0145] 1 ? 2对yajL调控区的修饰的确认
[0146] 通过PCR使用基因座特异性引物P3(SEQ ID N0:6)和P4(SEQ ID N0:7)确认了含有 用CmR-基因（cat)标记的yajL基因的启动子区的替换的突变体。PCR的条件如下:94°C变性3 分钟；30个循环的概况:94 °C 30秒，58 °C 30秒，72 °C 2分钟；最终延伸:72 °C 6分钟。使用来自亲 本大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板的反应中获得的DNA片段2长度为966bp(SEQ ID N0:8)。使用来自突变体大肠杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体DNA作为模板的反应中 获得的DNA片段3长度为l，820bp(SEQ ID N0:9)。
[0147] 1.3产L-缬氨酸的大肠杆菌菌株的构建
[0148] 通过P1 车专导(Miller J.H. "Experiments in molecular genetics"，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(1972))将Ptac7启动子控制下的yajL基因引入产 L_缬氨酸的大肠杆菌H81菌株（俄罗斯专利N 〇.2355763，EP1942183Bl)中。大肠杆菌 MG1655Ptac7_yajL菌株（见实施例1.1)用作供体。H81菌株在2001年1月30日以保藏号VKPM B-8066保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM)FGUP GosNII Genetika(lDorozhny proezd，俄罗斯，邮政编码113545，莫斯科（IMoscow 117545，Russian Federation))，然后 其于2002年2月1日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏物。在含有LB培养基，琼脂 (1.5 % )和氯霉素（20mg/L)的平板上选择含有Ptac7-ya jL基因盒的大肠杆菌H81突变体。由 此获得大肠杆菌H8lPtac7-ya jL菌株。通过实施例1的1.2小节中描述的PCR确认了ya jL基因 启动子区的置换。
[0149] 实施例2.通过大肠杆菌H81Ptac7-yajL菌株的L-缬氨酸的产生
[0150] 将经修饰的大肠杆菌H81Ptac7-yajL和对照大肠杆菌H81菌株分别在LB培养基（也 称为溶原性肉汤或Lur ia-Bertani培养基，如描述于Sambrook，J.和Russell，D.W. "Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))中在32°C培养18小时。然后，将0.2mL获得的培养物接种到20 X 200-mm试管中 的2mL发酵培养基中并在旋转振荡器上（250rpm)在32°C培养66小时至OD55Q为约29,直到葡 萄糖消耗。
[0151] 发酵培养基的组分(g/L)如下： 葡萄糖 66.0 (NH4)2S〇4 15.0 KI-I2P〇4 1.5
[0152] MgS0.r7I-I20 1.0 硫胺素-I-ICI 0.1 CaCO.、 25.0 LB 培养基 10%(v,，v)
[0153] 发酵培养基在116°C灭菌30分钟，除了葡萄糖和CaC03如下单独灭菌:葡萄糖在110 °C灭菌30分钟而CaC0 3在116°C灭菌30分钟。通过添加K0H溶液将pH调节到7.0。
[0154] 培养后，使用薄层色谱法(TLC)测量培养基中积累的L-缬氨酸。使用含非荧光指示 剂的Sorbfi ?硅胶（Sorbpolymer ?,Krasnodar,Russian Federation)的0.11-mm层包被 TLC平板（10X20cm)。使用Camag Linomat ? 5样品敷料器（applicator)将样品应用到平 板。该Sorbfil平板使用流动相显色，所述流动相由丙-2-醇：乙酸乙酯：25%氨水:水（16: 16 : 5 :10，v/v)组成。溶于丙酮的讳三酮溶液（2%，w/v)用作可视化试剂（visualizing reagent)。显色后，将平板干燥并使用Camag TLC Scanner ? 3以吸光度模式扫描，其中使 用winCATS软件(版本1 ? 4 ? 2)在520nm检测。
[0155] 3次独立的试管发酵的结果示于表1中。如可以从表1中看到，与亲本大肠杆菌H81 菌株相比，经修饰的大肠杆菌H81Ptac7-yajL菌株能够积累更高量的L-缬氨酸。
[0156] 表1.L-缬氨酸的生产
[0158]实施例3.以过表达yajL基因的方式修饰的产L-苯丙氨酸的大肠杆菌菌株的构建
[0159] 将Ptac7-yajL片段引入大肠杆菌DV269(TyrA-LAA)菌株，也称为大肠杆菌 MG1655htrE: (PL-yddG) [MUDaroG4-pheAfbl-aroL]，如实施例 1 的小节1.3中所述的。大肠杆 菌MG1655Ptac；7-yajL菌株(见实施例1.1)用作供体。大肠杆菌DV269(TyrA-LAA)菌株的构建 描述于Doroshenko V ? G ?等，Construction of an L-phenylalanine-producing tyrosine-prototrophic Escherichia coli strain using tyrA ssrA-1ike tagged alleles，Biotechnol.Lett. ,2010,35:1117-1121。在含有LB培养基，琼脂（1.5%)和氯霉素 (20mg/L)的平板上选择含有Ptw-yajL盒的大肠杆菌DV269(TyrA-LAA)突变体。由此获得大 肠杆菌 H81DV269(TyrA-LAA)Ptac7-yajL 菌株。
[0160] 实施例4.通过大肠杆菌DV269(TyrA-LAA)Ptac7-yajL菌株的L-苯丙氨酸的生产
[0161] 以108CFU/mL(集落形成单元，CFU)的量从L-琼脂平板上采集产L-苯丙氨酸的大肠 杆菌DV269(TyrA-LAA)P tac7-yajL和对照大肠杆菌DV269(TyrA-LAA)菌株的新鲜培养的细 胞，接种到15X150-mm试管中的3mL LB培养基中并在旋转振荡器上（250rpm)在34°C培养3 个小时。然后，将〇. 2mL获得的培养物接种到20 X 200-mm试管中的2mL发酵培养基中并在旋 转振荡器(240印111)在34°(：培养30小时至0055〇为约6.5-7，直到葡萄糖消耗、
[0162] 发酵培养基的组分(g/L)如下： 葡萄糖 50.0 (NH4),SO.i 0.6
[0163] K2HP0^3H20 0.6 FeS04,7H2C) 0.01 MnS04-5H20 0.01
[0164] 酵母提取物 2.0 CaC03 20.Q
[0165] 葡萄糖单独灭菌。CaC03在180°C干热灭菌2小时。
[0166] 培养后，使用薄层色谱法（TLC)测量积累的L苯丙氨酸。使用含非荧光指示剂的 Sorbfi硅胶（Sorbpolymer，Krasnodar，Russian Federation)的0? 11-mm层包被TLC平板（10 X20cm)。使用Camag Linomat 5样品敷料器将样品应用到平板。该Sorbfil平板使用流动相 显色，所述流动相由丙-2-醇：乙酸乙酯：25 %氨水:水（16:16:5:10，v/v)组成。溶于丙酮的 茚三酮溶液（l%，w/v)用作可视化试剂。显色后，将平板干燥并使用Camag TLC Scanner 3 以吸光度模式扫描，其中使用winCATS软件(版本1.4.2)在52〇11111检测。
[0167] 10次独立的试管发酵的结果示于表2中。如可以从表2中看到，与亲本大肠杆菌 DV269(TyrA-LAA)菌株相比，经修饰的大肠杆菌DV269(TyrA-LAA)P tac7-yajL菌株能够积累 更高量的L-苯丙氨酸。
[0168] 表2. L-苯丙氨酸的生产
[0170] 实施例5.通过大肠杆菌382Ptac7-yajL菌株的L-精氨酸的生产
[0171] 为了测试ya jL基因的过表达对L-精氨酸生产的影响，通过P1转导(Mi 1 ler，J. H. (1972),Experiments in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Lab.Press, Plainview，NY)将来自上述的大肠杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产 精氨酸的大肠杆菌382菌株，以获得382P tac7-yajL菌株。382菌株在2000年4月10日以保藏号 VKPM B-7926保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM)FGUP GosNII Genetika (lDorozhny proezd,俄罗斯，邮政编码 113545,莫斯科（1 Mo scow 117545, Russian Federation))，然后其于2001年5月18日转为依据布达佩斯条约的规定的保藏物。
[0172] 将大肠杆菌382和382Ptac7_yajL菌株分别在3mL营养肉汤中在37°C振荡（220rpm) 培养18小时，并将0.3mL获得的培养物接种到20 X 200-mm试管中的2mL发酵培养基中并在旋 转振荡器(220rpm)上在32°C培养48小时。
[0173] 培养后，通过纸色谱法使用由丁-1-醇：乙酸：水= 4:1: l(v/v)组成的流动相确定 培养基中积累的L-精氨酸的量。溶于丙酮中的茚三酮溶液(2%，w/v)用作可视化试剂。将含 有L-精氨酸的点切出，使用CdCl2的0.5%水溶液洗脱L-精氨酸，且L-精氨酸的量在540nm用 分光光度法测定。
[0174] 发酵培养基的组分(g/L)如下： 葡萄糖 48.0 CNH4)2S〇4 35.0 KH2P〇4 2.0 MgS0；r7H,0 1.0
[0175] - 硫胺素-HCI 0.0002 酵母提取物 LO L-异亮氨酸 0.1 CaCO, 5.0
[0176] 葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaC03在180 °C干热灭菌2小时。将pH调节到7.0。
[0177]实施例6.通过大肠杆菌眞15(7(16〇)?1；￡^7-5^儿的1-半胱氨酸的生产
[0178] 为了测试yajL基因的过表达对L-半胱氨酸生产的影响，通过P1转导将来自上述的 大肠杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产半胱氨酸的大肠杆菌JM15 (ydeD)菌株以获得 JM15(ydeD)Ptac7-yajL 菌株。
[0179] 大肠杆菌JM15(ydeD)是大肠杆菌JM15(美国专利No.6,218，168Bl)的衍生物，其已 经使用含有ydeD基因的DNA转化，所述ydeD基因编码膜蛋白，并且不参与任何L-氨基酸的生 物合成途径(美国专利No. 5,972,663)。
[0180]用于评价L-半胱氨酸生产的发酵条件和方案详细描述于美国专利No. 6,218,168 的实施例6中。
[0181] 实施例7.通过大肠杆菌VL334thrC+Ptac7-ya jL的L-谷氨酸的生产
[0182] 为了测试yajL基因的过表达对L-谷氨酸生产的影响，通过P1转导将来自上述的大 肠杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产L-谷氨酸的大肠杆菌VL334thrC+ 菌株(EP1172433A1)以获得 VL334thrC+Ptac7-yajL 菌株。VL334thrC+菌株在 2004年 12 月6 日以 保藏号VKPM B-8961保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)F⑶P GosNII Genetika (lDorozhny proezd,俄罗斯，邮政编码 113545,莫斯科（1 Mo scow 117545, Russian Federation))，然后其于2004年12月8日转为依据布达佩斯条约的规定的保藏物。
[0183] 将大肠杆菌VL334thrC+和VL334thrC+Ptac；7-yajL菌株分别在L-琼脂平板上在37°C 培养18-24个小时。然后，将一环细胞转移到含有2mL发酵培养基的20 X 200-mm试管中。在30 °C进行振荡培养3天。
[0184] 培养后，通过纸色谱法使用由丁-1-醇：乙酸：水=4:1:1 (v/v)组成的流动相确定 培养基中积累的L-谷氨酸的量，接着通过茚三酮(溶于丙酮的1%溶液)染色，在具有0.5% CdCl2的50 %乙醇中洗脱该化合物，并在540nm进一步评估L-谷氨酸。
[0185] 发酵培养基的组分(g/L)如下： 葡萄糖 60.0 (NH4)2S〇4 25.0 KH2P〇4 2.0
[0186] MgS0；r7H20 1.0 硫胺素-HC1 0.1 L-异亮氨酸 0.07 CaCO：, 25.0
[0187] 葡萄糖和CaC03单独灭菌。将pH调节到7.2。
[0188] 实施例8.通过大肠杆菌57Ptac7-yajL的L-亮氨酸的生产
[0189] 为了测试yajL基因的过表达对L-亮氨酸生产的影响，通过P1转导将来自上述的大 肠杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产L-亮氨酸的大肠杆菌57菌株 (VKPM B-7386，美国专利No.6，124，121)以获得57Ptac7_yajL菌株。该57菌株在 1997年5月 19 日以保藏号VKPM B-7386保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM)FGUP GosNII Genetika(lDorozhny proezd,俄罗斯，邮政编码 113545,莫斯科（IMoscow 117545，Russian Federation))〇
[0190] 将大肠杆菌57和57Ptac；7-yajL菌株分别在L-琼脂平板上在37°C培养18-24小时。为 了获得种子培养物，将菌株在旋转振荡器(250rpm)上在含有2mL补充有蔗糖(4 %)的L-肉汤 (Sambrook，J?和Russell，D.W.(2001)"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press)的20X200-mm试管中在32°C培养 18小时。接 着，使用0.2mL种子培养物（10 % )接种发酵培养基。在20 X 200-mm试管中2mL的基本发酵培 养基中进行发酵。在32°C在以250rpm振荡下培养细胞48-72小时。通过纸色谱法使用由丁-1-醇：乙酸:水=4:1: l(v/v)组成的流动相确定培养基中积累的L-亮氨酸的量。
[0191] 发酵培养基的组成(g/L)如下： 葡萄糖 60.0 (M-L〇2S〇4 25.0 kh,po4 a.o
[0192] ' MgS04-7H20 1.0 硫胺素-HCl 0.01 CaC03 25.0
[0193] 葡萄糖单独灭菌。CaC03在180 °C干热灭菌2小时。将pH调节到7.2。
[0194] 实施例9.通过大肠杆菌AJ11442Ptac7-yajL的L-赖氨酸的生产
[0195] 为了测试yajL基因的过表达对L-赖氨酸生产的影响，通过P1转导将来自上述的大 肠杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产L-赖氨酸的大肠杆菌AJ11442菌 株以获得AJ11442P tac7_yajL菌株。该AJ11442菌株在1981年5月1日以保藏号FERM P-5084保 藏于生物科学和人类技术研究所，工业科学和技术机构（National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology)(目前，Incorporated Administrative Agency Rational Institute of Technology and Evaluation，International Patent Organism Depositary(NITE-IPOD，#120，2-5_8Kazusakamatari，Kisarazu_shi，日本292-0818，千叶县（Chiba-ken 292-0818，JAPAN))。然后其于1987年10月29日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏物，接受 保藏号FERM BP-1543WCABD2质粒包括编码具有脱敏L-赖氨酸反馈抑制的突变的二氢吡啶 二羧酸合成酶的dapA基因，编码具有脱敏L-赖氨酸反馈抑制的突变的天冬氨酸激酶III的 lysC基因，编码二氢吡啶二羧酸还原酶的dapB基因，和编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因 (美国专利No.6,040,160)。
[0196] 将大肠杆菌AJ11442和AJ11442Ptac7-yajL菌株分别在含有链霉素（20mg/L)的L-培 养基中在37 °C培养，并将0.3mL获得的培养物接种到500-mL烧瓶中20mL含有需要的药物的 发酵培养基中。通过使用往复振荡器(reciprocal shaker)以115rpm的搅拌速度在37°C进 行培养16小时。培养后，通过已知的方法(Biotech-analyzer ?AS210，Sakura Seiki Co.) 确定培养基中的L-赖氨酸和残留的葡萄糖的量。接着，对于每个菌株，相对于消耗的葡萄糖 计算L-赖氨酸的产率。
[0197] 发酵培养基的组成(g/L)如下： 葡萄糖 40.0 (NH4)2S〇4 24,0 K.2HP〇4 1.0
[0198] MgS04-7H20 10 FeS04-7H20 0.01 MnS〇r5H20 0.01 酵母提取物 2.0
[0199] 通过K0H将pH调节至7.0,且该培养基在115°C高压灭菌处理10分钟。葡萄糖和硫酸 镁单独灭菌。CaC0 3在180°C干热灭菌2小时并添加到培养基至终浓度为30g/L。
[0200] 实施例10.通过大肠杆菌702ilvA Ptw-yajL的L-脯氨酸的生产
[0201]为了测试yajL基因的过表达对L-脯氨酸生产的影响，通过P1转导将来自上述的大 肠杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA菌 株以获得702ilvA Ptac7_yajL菌株。该702ilvA菌株在2000年7月18日以保藏号VKPM B-8012 保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM)FGUP GosNII Genetika(lDorozhny proezd，俄罗斯，邮政编码113545，莫斯科（IMoscow 117545，Russian Federation))，然后 其于2001年5月18日转为依据布达佩斯条约的规定的保藏物。
[0202] 将大肠杆菌702ilvA和702ilvA Ptw-yajL菌株分别在L-琼脂平板上在37°C培养 18-24小时。接着，这些菌株在与实施例7(L-谷氨酸的生产)相同的条件下培养。
[0203]实施例11.通过大肠杆菌B-3996Ptac7-yajL的L-苏氨酸的生产
[0204]为了测试yajL基因的过表达对L-苏氨酸生产的影响，通过P1转导将来自上述大肠 杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产L-苏氨酸的大肠杆菌VKPM B-3996 菌株以获得B-3996Ptac7-yajL菌株。该VKPM B-3996菌株在1987年11月19日以保藏号RIA 1867保藏于 A11-Union Scientific Center of Antibiotics (Russian Federation, 117105Moscow,Nagatinskaya Street, 3_A)。该菌株也于1987年4月 7 日以保藏号VKPM B-3996保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心（VKPM)FGUP GosNII Genetika(lDorozhny proezd,俄罗斯，邮政编码113545，莫斯科（IMoscow 117545,Russian Federation)) 〇 [0205] 将大肠杆菌VKPM B-3996和B-3996Ptac7-yajL菌株分别在L-琼脂平板上在37°C培 养18-24小时。为了获得种子培养物，菌株在旋转振荡器上（250rpm)在含有2mL补充有蔗糖 (4% )的L-肉汤（Sambrook，J?和Russell，D.W. (2001) "Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，3rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press)的20X200_mm试管中在32°C培 养18小时。接着，使用0.2mL( 10 % )种子培养物接种发酵培养基。在20 X 200-mm试管中的2mL 的基本发酵培养基中进行发酵。细胞在32 °C使用250rpm振荡培养65小时。
[0206] 培养后，通过纸色谱法使用由丁-1-醇：乙酸：水= 4:1: l(v/v)组成的流动相确定 培养基中积累的L-苏氨酸的量。溶于丙酮中的茚三酮溶液(2%)用作可视化试剂。将含有L-苏氨酸的点切出，使用CdCl 2的0.5%水溶液洗脱L-苏氨酸，且L-苏氨酸的量在540nm用分光 光度法评估。
[0207] 发酵培养基的组成(g/L)如下： 葡萄糖 80.0 (NH4)2S04 22.0 NaCl 0.8 KH2P〇4 2 0
[0208] MgS04-7H20 0,8 FeS(_V7H20 0,02 MnS04-5H20 0,02 硫胺素 -HC1 0,0002 酵母提取物 1.0
[0209] CaC03 30.0
[0210] 葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaC〇3在180°C干热灭菌2小时。将pH调节到7.0。灭菌后 将抗生素引入培养基中。
[0211] 实施例12.通过大肠杆菌SV164(pGH5)Ptac7-yajL的L-色氨酸的生产
[0212] 为了测试yajL基因的过表达对L-色氨酸生产的影响，通过P1转导将来自上述大肠 杆菌MG1655P tac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产L-色氨酸的大肠杆菌SV164(pGH5) 菌株以获得SV164(pGH5)P tac7-yajL菌株。SV164菌株具有trpE等位基因，其编码免于色氨酸 反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶。质粒PGH5含有突变体serA基因，编码免于丝氨酸反馈抑制 的磷酸甘油酸脱氢酶。SV164菌株(pGH5)详细描述于美国专利N〇.6，180,373SEP0662143 Bl〇
[0213] 将大肠杆菌SV164(pGH5)和SV164(pGH5)Ptac7-yajL菌株分别在补充有四环素 (20mg/L，pGH5质粒的标志物）的3mL营养肉汤中在37 °C振荡培养18小时。然后，将获得的培 养物(各0.3mL)接种到20 X 200-mm试管中的含有四环素(20mg/L)的3mL发酵培养基中，并在 旋转振荡器上以250rpm在37 °C培养48小时。培养后，通过TLC确定培养基中积累的L-色氨酸 的量。使用含非焚光指示剂的Sorbfi硅胶（Stock Company Sorbpolymer，Krasnodar， Russian Federation)的0? 11-mm层包被的10 X 15-cm TLC平板。该Sorbfil平板使用流动相 显色，所述流动相由丙-2-醇：乙酸乙酯：25 %氨水:水=40:40:7:16 (v/v)组成。溶于丙酮的 茚三酮溶液(2%)用作可视化试剂。发酵培养基组分列于表3中，但应当以分开的组(A，B，C， D，E，F，G，和H)灭菌，如所显示的，以避免灭菌期间的不利相互作用。
[0214]表3
[0216]
[0217] 使用NH40H将溶液A的pH调节至7 ? 1。
[0218] *Mameno?是大豆粉水解物(Ajinomoto Co, Inc.)
[0219] 实施例13.通过大肠杆菌382AargG Ptac7_yajL的L-瓜氨酸的生产
[0220] 为了测试yajL基因的过表达对L-瓜氨酸生产的影响，通过P1转导将来自上述大肠 杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产瓜氨酸的大肠杆菌382 A argG菌株 以获得菌株382 AargG Ptw-yajL。该382 AargG菌株是通过在382菌株(VKPM B-7926)的染 色体上删除argG基因获得的，通过最初由Datsenko K.A.和Wanner B.L.开发的称为"ARed/ ET介导的整合"的方法（Datsenko K.A?和Wanner B.L.，Proc .Natl ? Acad. Sci .USA,2000,97 (12): 6640-6645)进行。根据该方法，构建了PCR引物，它们与argG基因临近的区域和与模板 质粒中赋予抗生素抗性的基因临近的区域两者同源。质粒pMW118-AattL_cat-AattR(W0 05/010175)在PCR反应中用作模板。
[0221] 将大肠杆菌382 A argG和382 A argG Ptac7-yajL菌株分别在3mL营养肉汤中在37°C 振荡培养18小时，并将0.3mL获得的培养物接种到20 X 200-mm试管中的2mL发酵培养基中并 在旋转振荡器上在32 °C培养48小时。
[0222] 培养后，通过纸色谱法使用由丁-1-醇：乙酸：水=4:1:1 (v/v)组成的流动相确定 培养基中积累的L-瓜氨酸的量。溶于丙酮中的茚三酮溶液(2%)用作可视化试剂。将含有L- 瓜氨酸的点切出，使用CdCl2的0.5 %水溶液洗脱L-瓜氨酸，且L-瓜氨酸的量在540nm用分光 光度法测定。
[0223] 发酵培养基的组分(g/L)如下： 葡萄糖 48.0 (NH4)2S〇4 35.0 KII2P〇4 2.0 MgS〇4-7H20 1.0
[0224] 硫胺素-HCI 0.0002 酵母提取物 1.0 L-异亮氨酸 0,1 L-精氨酸 0,1 CaCO, 5,0
[0225] 葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaC03在180 °C干热灭菌2小时。将pH调节到7.0。
[0226] 实施例14.通过大肠杆菌A argF A argl Ptac7-yajL的L-鸟氨酸的生产
[0227] 为了测试yajL基因的过表达对L-鸟氨酸生产的影响，通过P1转导将来自上述大肠 杆菌MG1655Ptac7-yajL菌株的染色体的DNA片段转移到产鸟氨酸的大肠杆菌382 A argF A argl菌株以获得382 A argF A argl Ptac^yajL菌株。382 A argF A argl菌株是通过382菌株 (VKPM B-7926)染色体上的argF和argl基因的连续缺失得到的，其通过最初由Datsenko K. A.和Wanner B. L.开发的称为"ARed/ET介导的整合"的方法(Datsenko K. A.和Wanner B.L.，Proc.Natl .Acad. Sci .USA,2000,97(12):6640-6645)进行。根据该方法，构建了两对 PCR产物，其与临近argF或argl基因以及模板质粒中赋予抗生素抗性的基因的区域两者同 源。质粒pMW118-AattL-cat-AattR(W0 05/010175)在PCR反应中用作模板。
[0228] 将大肠杆菌382 A argF A argl和A argF A argl Ptac7-ya jL菌株分别在3mL营养肉 汤中在37°C振荡培养18小时，并将0.3mL获得的培养物接种到20 X 200-mm试管中的2mL发酵 培养基中，并在旋转振荡器上在32°C培养48小时。
[0229] 培养后，通过纸色谱法使用由丁-1-醇：乙酸：水= 4:1: l(v/v)组成的流动相确定 培养基中积累的L-鸟氨酸的量。溶于丙酮中的茚三酮溶液(2%，w/v)用作可视化试剂。将含 有L-鸟氨酸的点切出，使用CdCl 2的0.5%水溶液洗脱1-鸟氨酸，且1-鸟氨酸的量在54〇11111用 分光光度法评估。
[0230] 发酵培养基的组分(g/L)如下： 葡萄糖 48.0 (NH，4)2S〇4 35.0 KH；)P〇4 2,0 MgS04-7H20 1,0
[0231] 硫胺素 -HCI 0,0002 酵母提取物 1. L-异亮氨酸 0.1 L-精氨酸 0.1 CaC〇3 5.0
[0232] 葡萄糖和硫酸镁单独灭菌。CaC03在180 °C干热灭菌2小时。将pH调节到7.0。
[0233]虽然本发明已经参考其优选的实施方案详细描述，但是对于本领域技术人员明显 的是，可以在不偏离本发明范围的前提下进行各种变化以及采用等同方案。本文中所有引 用的参考文献通过提述并入作为本申请的一部分。
【主权项】
1. 用于生产L-氨基酸的方法，其包括： (i)在培养基中培养肠杆菌科的产L-氨基酸的细菌以在所述细菌中，或在所述培养基 中，或在所述细菌和所述培养基中产生所述L-氨基酸;及 (i i)从所述细菌或所述培养基，或从所述细菌和所述培养基收集所述L-氨基酸， 其中所述细菌已经以对yajL基因进行过表达的方式进行了修饰。2. 根据权利要求1的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属。3. 根据权利要求2的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。4. 根据权利要求1至3中任一项的方法，其中通过增加 yajL基因的拷贝数，或修饰yajL 基因的表达控制序列，使得与未修饰的细菌相比所述基因的表达增强对所述yajL基因进行 过表达。5. 根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述L-氨基酸选自L-苯丙氨酸，L-色氨酸， L-酪氨酸，L-丙氨酸，L-精氨酸，L-天冬酰胺，L-天冬氨酸，L-瓜氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨 酸，L-谷氨酰胺，甘氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸，L-甲硫氨酸，L-鸟氨 酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸，L-苏氨酸，和L-缬氨酸。6. 根据权利要求5的方法，其中所述L-氨基酸选自L-丙氨酸，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-缬氨酸和L-苯丙氨酸。7. 根据权利要求5的方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。8. 根据权利要求5的方法，其中所述L-氨基酸是L-缬氨酸。
【文档编号】C12P13/14GK106029894SQ201580008147
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年2月12日
【发明人】V.V.萨姆索诺夫, N.S.厄瑞米娜, N.V.斯托诺瓦, V.G.多罗申科
【申请人】味之素株式会社