新型抗人pai-1抗体的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供通过与活性型人PAI?1结合、抑制活性型人PAI?1介导的作用来预防或治疗肺纤维化的抗人PAI?1抗体。本发明人们对抗PAI?1抗体进行了研究，提供包含由序列号2的氨基酸序号1～118的氨基酸序列构成的重链可变区、和由序列号4的氨基酸序号1～108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI?1抗体。
【专利说明】
新型抗人PA 1-1抗体
技术领域
[0001 ]本发明涉及新型抗人PAI-1抗体。
【背景技术】
[0002] 纤溶酶原激活物抑制剂-1 (plasminogen activator inhibitor-l ;PAI_1)是由血 管内皮等产生的丝氨酸蛋白酶抑制剂之一。PAI-1与作为丝氨酸蛋白酶的纤溶酶原激活物 (plasminogen activator ;PA)结合，使PA的酶活性失活（Mol ? Cell ? Endocrinol ?、1990、 Vol. 68、p. 1-19) 1AI-1中存在活性型PAI-1、潜在型PAI-1、以及与PA结合而形成了复合物 的 PAI-1，仅活性型 PAI-1 具有抑制该 PA 的 PAI-1 的特性(Blood、1987、Vol. 70、p. 1090-1098) JA中存在组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator; tPA)和尿激酶型 纤溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator;uPA。也称为尿激酶)这两种， 均使纤溶酶原活化而转化为纤溶酶，由此催化溶解血液凝固中生成的纤维蛋白的反应（以 下称为纤溶系统）。活性型PAI-1与tPA和uPA结合，形成复合物。使PA失活的生物学特性已充 分阐明，活性型PAI-1与PA结合的结果是，抑制纤溶系统，促进血栓形成。
[0003] 活性型PAI-1的立体结构的特征在于，作为与PA的结合部位的活性中心环伸展并 露出于蛋白的外侧(J. Biol. Chem.、2001、Vol. 276、p. 44912-44918)。在循环血液中，活性型 PAI-1可以与作为其辅助因子的玻连蛋白结合而形成复合物（J. Biol. Chem.、1988、 Vol .263、p. 15454-15461)。玻连蛋白抑制PAI-1从活性型向潜在型的立体结构变化 (J.Biol.Chem.、1990、V〇1.265、p. 18490-18498)。潜在型PAI-1是活性中心环向内部折叠的 稳定的立体结构，一旦形成潜在型，则PAI-1变得无法与PA结合（J. Biol. Chem.、2008、 ￥〇1.2834.18147-18157。恥加代、1992、￥〇1.3554.270-273)。另外，与七？厶或诎厶形成了复 合物的PA I -1分别与t PA或uPA结合，因此，该PA I -1无法与其他PA进行新的结合。即，活性型 PAI-1中存在以单体的形式存在的活性型PAI-1和以与玻连蛋白的复合物的形式存在的活 性型PAI-1，它们具有与PA结合而使PA失活的功能。
[0004] 血浆中活性型PAI-1的增加暗示通过抑制PA参与组织的纤维化、血栓形成，作为结 果，认为与下述疾病相关:特发性肺纤维化等肺纤维化、间质性肺炎、系统性红斑狼疮、硬皮 病、糖尿病性肾病、狼疮性肾炎、移植物抗宿主病、肾小球肾炎、肾病综合征、肾纤维化、慢性 阻塞性肺疾病、急性肾功能障碍、急性肺功能障碍、急性呼吸衰竭、老年性黄斑变性、弥散性 血管内凝血综合征、术后粘连、症状性玻璃体黄斑粘连、糖尿病视网膜病、动脉硬化、心肌梗 塞、脑梗塞、肺梗塞、青光眼手术后的结膜的瘢痕化等伴有眼纤维化的疾病、腹膜硬化症等。
[0005] 作为与肺纤维化的联系，报告了在特发性肺纤维化患者的肺活检来源的成纤维细 胞中PAI-1的表达和分泌增加（J.Biol .Chem.、2010、V〇1.285、N〇.11、p.8196-8206)。此外， 在使用博来霉素诱发性的肺纤维化病态模型小鼠的试验中，在PAI-1的遗传缺陷小鼠中确 认到肺的纤维化得到抑制(J? Clin ? Invest ?、1996、Vol ? 97、No ? 1、p ? 232-237)。另外，在对上 述病态模型小鼠给药低分子PAI-1抑制剂和PAI-1的siRNA的情况下，也确认到通过PAI-1抑 制使肺的纤维化得到抑制(Arterioscler ? Thromb.Vase ? Biol ?、2008、Vol ? 28、p? 672-677。 Thorax、2010、Vol?65、p?334-340)。
[0006] 因此，只要能够开发出具有与活性型PAI-1特异性地结合而抑制活性型PAI-1所产 生的作用的活性的单克隆抗体，则可以期待对于活性型PAI-1参与病态形成的各种疾病的 预防和治疗有用。
[0007] 作为对活性型人PAI-1显示出功能抑制作用的抗体，报告了小鼠单克隆抗体MA-33B8(专利文献 1)、MA-33H1F7(非专利文献 1)、MA-55F4C12(非专利文献 1)、MA-56A7C10(专 利文献2)、以及MA-33B8的人源化抗体CT140(专利文献1)、利用噬菌体制作的完全人型抗体 MEDI-579(也称为CAT-1001 或PICK167_A01-fgl IgGl。专利文献3)等。其中，MA-56A7C10和 MEDI-579对于活性型人PAI-1分别显示出与对于活性型以外的立体结构的人PAI-1相比约 4.0倍和约20倍高的结合活性(专利文献2和专利文献3)。另外，MEDI-579对小鼠PAI-1也显 示出抑制作用，根据使用狼疮性肾炎、硬皮病、糖尿病性肾病和血栓病的病态模型小鼠的实 验结果，可以期待对于这些疾病的药效(专利文献3)。
[0008] 在将抗人PAI-1抗体作为抗体药物使用的情况下，作为规定其有效给药量的主要 因素，可以列举抗体所具有的抑制活性型PAI-1与PA结合的活性和对活性型PAI-1的选择 性、以及体内存在的活性型PAI-1和其他立体结构的PAI-1的量。在此，其他立体结构的PAI-1是指潜在型PAI-1和与tPA或uPA形成了复合物的PAI-1。
[0009] 人血浆中的总P AI -1的9 0 %以上储存在血小板中。在除去血小板后的血浆中，总 PAI-1 的约三分之二为活性型（Br. J.Haematol.、1988、7〇1.70、？.327-333。81〇〇(1、1988、 Vol. 71、p. 220-225)。不仅是血浆中的PAI-1活性（以与tPA的结合能表示的活性型PAI-1活 性），血浆中的总PAI-1量(利用检测全部PAI-1的抗PAI-1抗体检测到的PAI-1的总量）、血浆 中的PAI-1与tPA的复合物的量(利用抗PAI-1抗体与抗tPA抗体的组合检测到的复合物的 量）在各种人疾病中也升高（Thromb.Res.、2008、Vol. 122、p.466-472。 Arterioscler ? Thromb ? Vase ? Biol ?、2000、V〇1 ? 20、p ? 2019_2023。似1: .Med?、1996、Vol ? 2、 p.800-803)。在除去血小板的血浆中，也存在约为活性型PAI-1量的三分之一的tPA-PAI-1 复合物(81〇〇(1、1990、￥〇1.764.930-937)。另外，在组织中，不仅存在七?4，也存在1^4，还存 在PAI-1与uPA的复合物。作为结论，活性型PAI-1以外的其他PAI-1以在PAI-1总量中无法忽 视的比例存在于人体内。
[0010] 现有技术文献
[0011] 专利文献
[0012] 专利文献1:美国专利申请公开第2010/0254979号
[0013] 专利文献2:国际公开第2002/034776号
[0014] 专利文献3:国际公开第2011/139973号
[0015]非专利文献
[0016]非专利文献 1 : "The Journal of Biological Chemi stry"、（美国）、2000、 Vol.275、p.6375-6380
【发明内容】
[0017]发明所要解决的问题
[0018]本发明的课题在于提供通过与现有的抗人PAI-1抗体相比更加选择性地抑制活性 型人PAI-1来预防或治疗肺纤维化的抗人PAI-1抗体。
[0019]用于解决问题的方法
[0020] 本发明人们在对活性型人PAI-1的选择性高的抗人PAI-1抗体的制作中反复进行 了大量独创性研究，结果，制作出包含由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构成的 重链可变区、和由序列号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人 PAI-1抗体(实施例1~3)，并且发现，该抗人PAI-1抗体抑制血浆中的活性型人PAI-1 (实施 例5)、并且对与玻连蛋白形成复合物的活性型人PAI-1具有高选择性(实施例6)。其结果，提 供上述抗人PAI-1抗体，从而完成了本发明。
[0021] 即，本发明包含作为医学上或产业上有用的物质或方法的下述发明。
[0022] (1) 一种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片 段包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由序列号2的氨基酸序号31~35的 氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸序号50~66的氨基酸序列构成的CDR2、和由序 列号2的氨基酸序号99~107的氨基酸序列构成的CDR3,所述轻链可变区包含由序列号4的 氨基酸序号24~34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号50~56的氨基酸序 列构成的CDR2、和由序列号4的氨基酸序号89~97的氨基酸序列构成的CDR3。
[0023] (2)如（1)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原 结合片段选自下述1)~2)中的任一个：
[0024] 1)包含由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构成的重链可变区、和由序 列号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结 合片段；以及
[0025] 2)上述1)的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原 结合片段。
[0026] (3)如(2)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原 结合片段包含由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构成的重链可变区、和由序列 号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区。
[0027] (4)如(2)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原 结合片段为包含由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列 号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合 片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段。
[0028] (5)如（2)或(4)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，其中，翻译后修饰为重 链可变区N末端的焦谷氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。
[0029] (6)如（1)~(5)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含作为重链恒定区的人Ig T 1恒定区。
[0030] (7)如（1)~(5)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含作为轻链恒定区的人IgK恒定区。
[0031] (8)如（1)~(5)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI- 1抗体或其抗原结合片段包含作为重链恒定区的人Ig Y 1恒定区，并且包含作为轻链恒定区 的人IgK恒定区。
[0032] (9)如(3)所述的抗人PAI-1抗体，其包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链 和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。
[0033] (10)如（1)~（8)中任一项所述的抗原结合片段，其为单链可变区片段、Fab、Fab' 或F(ab，）2。
[0034] (11)-种抗人PAI-1抗体，其为(9)所述的抗人PAI-1抗体经翻译后修饰生成的抗 体。
[0035] (12)如（11)所述的抗人PAI-1抗体，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷 氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。
[0036] (13)如（11)所述的抗人PAI-1抗体，其包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨基 酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。
[0037] (14) -种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片 段抑制（9)或（13)所述的抗人PAI-1抗体与活性型人PAI-1的结合，与同玻连蛋白形成了复 合物的活性型人PAI-1结合，并且，既不与潜在型人PAI-1结合也不与同纤溶酶原激活物形 成了复合物的人PAI-1结合。
[0038] (15) -种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片 段与(9)或（13)所述的抗人PAI-1抗体结合相同的人PAI-1表位。
[0039] (16)-种多核苷酸，其包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重 链可变区的碱基序列。
[0040] (17)-种多核苷酸，其包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻 链可变区的碱基序列。
[0041] (18)-种表达载体，其包含(16)和/或（17)所述的多核苷酸。
[0042] (19)利用（18)所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自由下述 (a)~(d)组成的组：
[0043] (a)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的 多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0044] (b)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变 区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0045] (c)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;和
[0046] (d)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0047] (20)利用（18)所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自由下述 (a)~(d)组成的组：
[0048] (a)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、 和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0049] (b)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的 宿主细胞；
[0050] (c)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体进行了转化的宿主细胞;和
[0051] (d)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0052] (21)-种生产抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法，包括对选自由下述(a)~ (c)组成的组中的宿主细胞进行培养而使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤，
[0053] (a)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的 多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0054] (b)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变 区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;以及
[0055] (c)利用含有包含编码(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗体或 其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0056] (22)-种生产抗人PAI-1抗体的方法，包括对选自由下述(a)~（c)组成的组中的 宿主细胞进行培养而使其表达抗人PAI-1抗体的步骤：
[0057] (a)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、 和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0058] (b)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的 宿主细胞；以及
[0059] (c)利用含有包含编码(9)所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序 列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0060] (23)通过(21)中记载的方法生产的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
[0061 ] (24)通过(22)中记载的方法生产的抗人PAI-1抗体。
[0062] (25)-种药物组合物，其包含（1)~（15)、（23)和(24)中任一项所述的抗人PAI-1 抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
[0063] (26)-种药物组合物，其包含(3)所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段、（4)所 述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。
[0064] (27)-种药物组合物，其包含(9)所述的抗人PAI-1抗体、（13)所述的抗人PAI-1抗 体和药学上可接受的赋形剂。
[0065] (28)如(25)~(27)中任一项所述的药物组合物，其为肺纤维化的预防或治疗用药 物组合物。
[0066] (29)如(28)所述的药物组合物，其中，肺纤维化为特发性肺纤维化。
[0067] (30)-种预防或治疗肺纤维化的方法，其包括以治疗有效量给药(1)~（15)、（23) 和(24)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤。
[0068] (31)如(30)中记载的方法，其中，肺纤维化为特发性肺纤维化。
[0069] (32)用于在肺纤维化的预防或治疗中使用的（1)~（15)、（23)和(24)中任一项所 述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
[0070] (33)如(32)所述的使用，其中，肺纤维化为特发性肺纤维化。
[0071] (34)(1)~（15)、（23)和(24)中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段在 制造肺纤维化的预防或治疗用药物组合物中的应用。
[0072] (35)如(34)所述的应用，其中，肺纤维化为特发性肺纤维化。
[0073]上述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段还包括与其他肽和蛋白质的融合抗体、结 合修饰剂而得到的修饰抗体。
[0074]发明效果
[0075] 本发明的抗人PAI-1抗体通过抑制活性型人PAI-1的功能，能够用作活性型人PAI-1参与病态形成的疾病、例如特发性肺纤维化等肺纤维化的预防或治疗剂。
【附图说明】
[0076] 图1示出完全人型H0T-1的猴血中活性型PAI-1抑制作用。纵轴表示血浆中活性型 PAI-1浓度。
【具体实施方式】
[0077]以下，对本发明进行详述。
[0078]抗体存在186、以11、184、18〇和18￡这5个类型。抗体分子的基本结构在各类型中是 共通的，由分子量5万~7万的重链与分子量2万~3万的轻链构成。重链通常由包含约440个 氨基酸的多肽链构成，每种类型具有特征性的结构，与IgG、IgM、IgA、IgD、IgE相对应地称为 Ig y、]^、18(：1、185、18￡;。186中进一步存在]^1、]^2、]^3、]^4的亚类，各自所对应的重 链称为Ig yl、Igy2、Igy3、Ig y 4。轻链通常由包含约220个氨基酸的多肽链构成，已知有L 型和K型这2种，分别称为IgA、IgK。抗体分子的基本结构的肽构成是将各自相同的2条重链 和2条轻链通过二硫键(S-S键)和非共价键进行结合，分子量为15万~19万。2种轻链与任一 种重链均能够配对。各个抗体分子总是由相同的2条轻链和相同的2条重链形成。
[0079] 链内S-S键在重链中有四个（Igy、Ige中有五个）、在轻链中有二个，每100~110个 氨基酸残基形成一个环，该立体结构在各环间类似，称为结构单元或结构域。对于重链、轻 链中均位于N末端的结构域，即使是来自于同种动物的同一类型(亚类)的样品，其氨基酸序 列也不恒定，被称为可变区，各结构域分别被称为重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)。比可 变区更靠近C末端侧的氨基酸序列在各类型或亚类中大致恒定，被称为恒定区（各结构域分 别表示为CHI、CH2、CH3或CL)。
[0080 ]抗体的抗原决定部位由VH和VL构成，结合的特异性由该部位的氨基酸序列决定。 另一方面，与补体、各种Fc受体表达细胞结合这样的生物学活性反映出各类型Ig的恒定区 的结构的差异。已知轻链和重链的可变区的可变性基本受限于在任一种链中均存在的3个 小的超变区，将这些区域称为互补决定区(CDR;自N末端侧起分别为⑶R1、⑶R2、⑶R3)。可变 区的其余部分被称为框架区(FR)，较为恒定。
[0081]抗体的包含VH和VL的各种抗原结合片段也具有抗原结合活性，作为这样的代表性 的抗原结合片段，可以列举单链可变区片段(scFv)、Fab、Fab'、F(ab' hjab是由轻链与包 含VH、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成的一价抗体片段。Fab'是由轻链与包含 VH、CH1结构域和铰链区的一部分的重链片段构成的一价抗体片段，该铰链区的部分包含构 成重链间S-S键的半胱氨酸残基。F(ab'） 2片段是2个Fab'片段通过铰链区中的重链间S-S键 结合而成的二价抗体片段。scFv是通过连接肽（1 inker)连接的由VH与VL构成的一价抗体片 段。
[0082]〈本发明的抗人PAI-1抗体〉
[0083]本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含具有下述特征的抗人PAI-1抗体。
[0084] 包含由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构成的重链可变区、和由序列 号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合 片段。
[0085] 本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段优选为具有上述特征且进一步包含重 链恒定区和轻链恒定区的抗体。作为恒定区，可以选择任一亚类的恒定区（例如，作为重链， 为Ig y l、Ig y 2、Ig y 3或Ig y 4的恒定区，作为轻链，为IgA或igK的恒定区），但优选人Ig y 1 恒定区作为重链恒定区。
[0086]作为人Igy 1恒定区，可以列举例如由序列号2的氨基酸序号119~448的氨基酸序 列构成的人igy 1恒定区。
[0087]作为轻链恒定区，优选人IgK恒定区。
[0088] 作为人IgK恒定区，可以列举例如由序列号4的氨基酸序号109~214的氨基酸序列 构成的人IgK恒定区。
[0089] 作为本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，更优选为包含上述重链可变区 和轻链可变区、重链恒定区为人Igy 1恒定区、轻链恒定区为人IgK恒定区的抗人PAI-1抗 体。
[0090] 在一个实施方式中，本发明的抗原结合片段为scFv、Fab、Fab'或F(ab'）2。
[0091] 在一个实施方式中，本发明的抗人PAI-1抗体为包含由序列号2所示的氨基酸序列 构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
[0092] 使抗体在细胞中表达的情况下，已知抗体会在翻译后受到修饰。作为翻译后修饰 的示例，可以列举重链C末端的赖氨酸基于羧肽酶的切断、重链和轻链N末端的谷氨酰胺或 谷氨酸通过焦谷氨酸化向焦谷氨酸的修饰、糖基化、氧化、脱酰胺化、糖化等，已知在各种抗 体中都发生这样的翻译后修饰（Journal of Pharmaceutical Sciences、2008、Vol .97、 p.2426-2447)。
[0093] 本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段还包括受到翻译后修饰的抗人PAI-1 抗体或其抗原结合片段。作为受到翻译后修饰的本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片 段的示例，可以列举受到重链可变区N末端的焦谷氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失的 抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。本领域公知，这样的基于N末端的焦谷氨酸化或C末端赖 氨酸缺失的翻译后修饰不会给抗体的活性带来影响(Analytical Biochemistry、2006、 Vol.348、p.24-39)。
[0094] 在一个实施方式中，本发明的抗人PAI-1抗体为具有下述特征的抗人PAI-1抗体。
[0095] 包含下述重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体，所述 重链为由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链，其中，序列号2的氨基酸序号1的谷氨酸被 修饰为焦谷氨酸和/或缺失序列号2的氨基酸序号448的赖氨酸。
[0096] 在又一个实施方式中，本发明的抗人PAI-1抗体为具有下述特征的抗人PAI-1抗 体。
[0097] 包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示 的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
[0098] 本发明还包括具有下述特征的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
[0099] 包含下述重链可变区和下述轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所 述重链可变区包含由序列号2的氨基酸序号31~35的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号2的 氨基酸序号50~66的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号2的氨基酸序号99~107的氨基酸 序列构成的CDR3,所述轻链可变区包含由序列号4的氨基酸序号24~34的氨基酸序列构成 的CDR1、由序列号4的氨基酸序号50~56的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号4的氨基酸 序号89~97的氨基酸序列构成的⑶R3。
[0100] 本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段为与同玻连蛋白形成了复合物的活性 型人PAI-1(也称为VTN-PAI-1复合物)结合的抗体。作为在生物体内存在的活性型人PAI-1， 有以单体形式存在的活性型人PAI-1和VTN-PAI-1复合物。其中，关于VTN-PAI-1复合物，通 过与玻连蛋白结合抑制了人PAI-1从活性型向潜在型的立体结构变化，与以单体形式存在 的活性型人PAI-1相比，活性型人PAI-1的结构保持得更稳定。另外，VTN-PAI-1复合物中，活 性型人PAI-1 的活性中心环结构不受影响(Nat ? Struct ? Biol ?、2003、V〇1 ? 10、p ? 541-544)。 因此，通过评价抗人PAI-1抗体对VTN-PAI-1复合物的结合活性，能够更准确地评价抗体对 活性型人PAI-1的选择性。
[0101] 另外，本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段还包括不仅与VTN-PAI-1复合物 结合、还与以单体形式存在的活性型人PAI-1结合的抗体。
[0102] 对于是否与VTN-PAI-1复合物或以单体形式存在的活性型PAI-1结合，可以使用公 知的结合活性测定方法进行确认。作为测定结合活性的方法，可以列举例如酶联免疫吸附 检测(ELISA)、表面等离子体共振(SPR)等方法。使用ELISA的情况下，在例示性的方法中，使 玻连蛋白（BD Biosciences公司、354238)固相化，封闭之后使重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)固相化，由此使VTN-PAI-1复合物固相化。向其中添加 受试抗体进行反应。反应后，使由辣根过氧化物酶(HRP)等标记的抗IgG抗体等二次抗体进 行反应，清洗后，使用检测其活性的试剂(例如，在HRP标记的情况下为过氧化物酶用显色试 剂盒(住友电木公司））等进行活性测定，由此能够确认受试抗体是否与VTN-PAI-1复合物结 合。使用SPR的情况下，可以使用例如Biacore(注册商标)T200(GE healthcare日本公司）。 在例示性的方法中，使受试抗体固相化于传感芯片的表面，向流路中添加重组活性型人 PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)。对抗体与活性型人PAI-1的结合速率常数 (ka)、解离速率常数(kd)和解离常数(KD)进行分析，由此能够确认受试抗体是否与以单体 形式存在的活性型人PAI-1结合。
[0103] 本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段优选为与VTN-PAI-1复合物结合、且对 血浆中的活性型人PAI-1具有抑制活性的抗体。本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段 更优选为与VTN-PAI-1复合物结合、对血浆中的活性型人PAI-1具有抑制活性、且既不与潜 在型人PAI-1结合也不与同PA形成了复合物的人PAI-1结合的抗体。作为具体地评价对血浆 中的活性型人PAI-1的抑制活性的方法，可以使用如后述实施例5中记载的方法。
[0104] "不与潜在型人PAI-1结合"是指，在评价抗体对潜在型人PAI-1的结合活性的情况 下￡050值(即/1^)>10000 4050值(即/11^)>10000是指显示出最大活性的50%时的抗体浓度 大于10000ng/mL。该评价中使用的方法如下所示。
[0105](对潜在型人PAI-1的结合活性评价）
[0106] 将重组潜在型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-L)用磷酸缓冲生理盐水 (PBS)稀释至1000ng/mL，以每1孔lOOuL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司）中，将板 在4°C静置一晚，由此使潜在型人PAI-1固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200yL添 加封闭剂(Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。用清洗液(含有0.05% 吐温-20的Tris缓冲生理盐水(TBS))进行清洗，以每1孔100此添加用含有0.1%牛血清来源 白蛋白（BSA)的roS稀释为从100000ng/mL至0.01ng/mL的8个梯度的受试抗体，在室温下静 置30分钟。作为比较抗体，在受试抗体具有人Fc段的情况下，将MEDI-579(专利文献3)用含 有0.1%BSA的roS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，在受试抗体具有小鼠Fc段 的情况下，将MA-56A7C10(Hycult Biotech公司、HM2182)用含有0.1%BSA的PBS稀释为从 10000ng/mL至0 ? 01ng/mL的7个梯度，并添加到孔中。作为对照，准备添加了含有0 ? 1 %BSA的 PBS代替受试抗体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔100此添加使用以PBS稀释至20倍的封 闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍的检测抗体，使其反应。作为检测 抗体，具有小鼠抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记山羊抗小鼠Ig抗体(Southern Biotech公司、1010-05)，具有人抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记兔抗人Ig抗 体(Southern Biotech公司、6145-05)。在室温下孵育30分钟后，用清洗液清洗3次。以每1孔 100此添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司）中含有的显色液，在室温下静置约15 分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液1〇〇此，使用EnVision计数仪(珀金埃尔 默公司）测定其0D450值。计算受试抗体的各浓度下的PAI-1结合率时，将添加了含有0.1 % BSA的PBS代替受试抗体的孔的测定值设定为0%，将受试抗体的最大浓度下的测定值设定 为100%。其中，在受试抗体具有人Fc段的情况下，在即使添加最大浓度（100000ng/mL)的受 试抗体也达不到MEDI-579的评价系统中的最大浓度（10000ng/mL)的测定值时，将MEDI-579 的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100%。在受试抗体具有小鼠Fc段的情况下，在即 使添加最大浓度（l〇〇〇〇〇ng/mL)的受试抗体也达不到MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度 (10000ng/mL)的测定值时，将MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100%。 对算出的PAI-1结合率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出受试抗体的EC50值。
[0107] "不与同纤溶酶原激活物形成了复合物的人PAI-1结合"是指，在评价抗体对于与 作为纤溶酶原激活物(PA)的uPA或tPA形成了复合物的人PAI-1 (分别也称为uPA-PAI-1复合 物和tPA-PAI-1复合物）的结合活性的情况下，对各复合物的EC50值(ng/mL)>10000，EC50值 (ng/mL)>10000是指显示出最大活性的50%时的抗体浓度大于10000ng/mL。该评价中使用 的方法如下所示。
[0108] (对uPA-PAI-1复合物的结合活性评价）
[0109]用PBS将uPA(尿激酶静注用6万单位（注册商标)"；田边三菱制药株式会 社)稀释至100单位/mL，以每1孔lOOuL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司）中，将板 在4°C静置一晚，由此使uPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200yL添加封闭剂 (Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔lOOyL添加用含有0.1 % BSA的PBS稀释至1000ng/mL的重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)，使 uPA捕获重组活性型人PAI-1。用清洗液(含有0.05%吐温-20的183)进行清洗，以每1孔10011 L添加用含有0.1 %BSA的roS稀释为从100000ng/mL至0.01ng/mL的8个梯度的受试抗体，在 室温下静置30分钟。作为比较抗体，在受试抗体具有人Fc段的情况下，将MEDI-579(专利文 献3)用含有0.1 %BSA的roS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，在受试抗体具有 小鼠Fc段的情况下，将MA-56A7C10(Hycult Biotech公司、HM2182)用含有0.1%BSA的PBS稀 释为从l〇〇〇〇ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，并添加到孔中。作为对照，准备添加了含有 0.1%BSA的PBS代替受试抗体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔100yL添加使用以PBS稀释 至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍的检测抗体，使其反 应。作为检测抗体，具有小鼠抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记山羊抗小鼠Ig抗 体(Southern Biotech公司、1010-05)，具有人抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标 记兔抗人Ig抗体(Southern Biotech公司、6145-05)。在室温下孵育30分钟后，用清洗液清 洗3次。以每1孔lOOiiL添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司）中含有的显色液，在室 温下静置约15分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液100此，使用EnVision计数 仪(珀金埃尔默公司）测定其0D450值。计算受试抗体的各浓度下的PAI-1结合率时，将添加 了含有0.1 %BSA的roS代替受试抗体的孔的测定值设定为0%，将受试抗体的最大浓度下的 测定值设定为100 %。其中，在受试抗体具有人Fc段的情况下，在即使添加最大浓度 (100000ng/mL)的受试抗体也达不到MEDI-579的评价系统中的最大浓度（10000ng/mL)的测 定值时，将MEDI-579的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100%。在受试抗体具有小鼠 Fc段的情况下，在即使添加最大浓度（100000ng/mL)的受试抗体也达不到MA-56A7C10的评 价系统中的最大浓度（l〇〇〇〇ng/mL)的测定值时，将MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度的 测定值设定为100%。对算出的PAI-1结合率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出受试 抗体的EC50值。
[0110](对tPA-PAI-1复合物的结合活性评价）
[0111] 将tPA(アクテパシレ（注册商标)注600万；协和发酵麒麟株式会社）用PBS稀释至 1000单位/mL，以每1孔lOOuL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司）中，将板在4°C静置 一晚，由此使tPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200iiL添加封闭剂（Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔100yL添加用含有0.1 %BSA的PBS 稀释至1000ng/mL的重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)，使tPA捕获 重组活性型人PAI-1。用清洗液(含有0.05 %吐温-20的TBS)进行清洗，以每1孔100yL添加用 含有0.1%BSA的roS稀释为从100000ng/mL至0.01ng/mL的8个梯度的受试抗体，在室温下静 置30分钟。作为比较抗体，在受试抗体具有人Fc段的情况下，将MEDI-579(专利文献3)用含 有0.1%BSA的roS稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度，在受试抗体具有小鼠Fc段 的情况下，将MA-56A7C10(Hycult Biotech公司、HM2182)用含有0.1%BSA的PBS稀释为从 10000ng/mL至0 ? 01ng/mL的7个梯度，并添加到孔中。作为对照，准备添加了含有0 ? 1 %BSA的 PBS代替受试抗体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔100此添加使用以PBS稀释至20倍的封 闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍的检测抗体，使其反应。作为检测 抗体，具有小鼠抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记山羊抗小鼠Ig抗体(Southern Biotech公司、1010-05)，具有人抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记兔抗人Ig抗 体(Southern Biotech公司、6145-05)。在室温下孵育30分钟后，用清洗液清洗3次。以每1孔 100此添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司）中含有的显色液，在室温下静置约15 分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液1〇〇此，使用EnVision计数仪(珀金埃尔 默公司）测定其0D450值。计算受试抗体的各浓度下的PAI-1结合率时，将添加了含有0.1 % BSA的PBS代替受试抗体的孔的测定值设定为0%，将受试抗体的最大浓度下的测定值设定 为100%。其中，在受试抗体具有人Fc段的情况下，在即使添加最大浓度（100000ng/mL)的受 试抗体也达不到MEDI-579的评价系统中的最大浓度（10000ng/mL)的测定值时，将MEDI-579 的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100%。在受试抗体具有小鼠Fc段的情况下，在即 使添加最大浓度（l〇〇〇〇〇ng/mL)的受试抗体也达不到MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度 的测定值时，将MA-56A7C10的评价系统中的最大浓度(10000ng/mL)的测定值设定为100 %。 对算出的PAI-1结合率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出受试抗体的EC50值。
[0112] 本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段中也包括下述的抗人PAI-1抗体或其 抗原结合片段:其抑制包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨 基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体、或包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序 列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体与活性型人 PAI-1的结合，与同玻连蛋白形成了复合物的活性型人PAI-1结合，并且，既不与潜在型人 PAI-1结合也不与同纤溶酶原激活物形成了复合物的人PAI-1结合。
[0113] 对于受试抗体是否抑制包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号 4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1~447的 氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体与活 性型人PAI-1的结合，可以使用下述方法进行确认。使玻连蛋白（BD Biosciences公司、 354238)固相化，封闭之后使活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)固相化， 由此使VTN-PAI-1复合物固相化。向其中添加受试抗体，使其反应。反应后，使利用HRP等进 行了标记的包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列 构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序列构成的 重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体作为二次抗体进行反应， 清洗后，使用检测其活性的试剂(例如，在HRP标记的情况下为过氧化物酶用显色试剂盒(住 友电木公司））等进行活性测定。在由于受试抗体的添加而导致包含由序列号2所示的氨基 酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由 序列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构 成的轻链的抗人PAI-1抗体的结合活性显著降低的情况下，可以判断为受试抗体抑制包含 由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗 人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4 所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体与活性型人PAI-1的结合。
[0114] 本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段中也包括下述的抗人PAI-1抗体或其 抗原结合片段:其与包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基 酸序列构成的轻链的抗人PAI -1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序列 构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人P AI -1抗体结合相同的人 PAI-1表位。在此，表位是指抗体所识别的抗原部位。
[0115] 对于受试抗体是否与包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4 所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的氨基酸序号1~447的 氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体结合 相同的人PAI-1表位，可以使用公知的表位确定方法进行确认。作为确定表位的方法，可以 列举例如X射线晶体结构分析、ELISA等方法。使用ELISA的情况下，在例示性的方法中，使人 PAI-1部分肽固相化，向其中添加受试抗体，使其反应。反应后，使利用HRP等进行了标记的 抗IgG抗体等二次抗体进行反应，清洗后，使用检测其活性的试剂(例如，在HRP标记的情况 下为过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司））等进行活性测定，由此能够确认受试抗体 是否与该人PAI-1部分肽结合。通过评价对于具有各种氨基酸序列的人PAI-1部分肽的结合 活性，能够确定受试抗体的表位。在受试抗体的表位与包含由序列号2所示的氨基酸序列构 成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体或包含由序列号2的 氨基酸序号1~447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的 抗人PAI-1抗体的表位相同的情况下，可以判断为受试抗体与包含由序列号2所示的氨基酸 序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI -1抗体或包含由序 列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成 的轻链的抗人PAI-1抗体结合相同的人PAI-1表位。
[0116] 另外，对于本发明的抗人PAI-1抗体而言，如果是与VTN-PAI-1复合物结合的抗体， 也包括除了与VTN-PAI-1复合物结合、也与同玻连蛋白形成了复合物的其他动物来源的活 性型PAI-1(例如，同玻连蛋白形成了复合物的活性型猴PAI-1)结合的抗体。
[0117] 本发明的抗人PAI-1抗体可以由本领域技术人员基于本说明书中公开的本发明的 抗体的重链可变区和轻链可变区的序列信息使用本领域中公知的方法容易地制作。本发明 的抗人PAI-1抗体没有特别限定，可以按照例如后述的〈生产本发明的抗人PAI-1抗体的方 法和利用该方法生产的抗人PAI-1抗体〉中记载的方法进行制造。
[0118] 本发明的抗人PAI-1抗体根据需要进一步纯化后，按照常规方法制剂化，能够用于 特发性肺纤维化等肺纤维化、间质性肺炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、糖尿病性肾病、狼疮性 肾炎、移植物抗宿主病、肾小球肾炎、肾病综合征、肾纤维化、慢性阻塞性肺疾病、急性肾功 能障碍、急性肺功能障碍、急性呼吸衰竭、老年性黄斑变性、弥散性血管内凝血综合征、术后 粘连、症状性玻璃体黄斑粘连、糖尿病视网膜病、动脉硬化、心肌梗塞、脑梗塞、肺梗塞、青光 眼手术后结膜的瘢痕化等伴有眼纤维化的疾病、腹膜硬化症等、活性型PAI-1参与病态形成 的疾病的预防或治疗。
[0119] 〈本发明的多核苷酸〉
[0120] 本发明的多核苷酸包括:包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的 重链可变区的碱基序列的多核苷酸、以及包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合 片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。
[0121] 在一个实施方式中，包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链 可变区的碱基序列的多核苷酸为包含编码由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构 成的重链可变区的碱基序列的多核苷酸。
[0122] 作为包含编码序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列所示的重链可变区的碱 基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号1的碱基序号1~354的碱基序列的多核苷酸。
[0123] 在优选的实施方式中，包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链可变区的碱基序 列的多核苷酸为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷 酸。
[0124] 作为包含编码由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链的碱基序列的多核苷酸， 可以列举例如包含序列号1所示的碱基序列的多核苷酸。
[0125] 在一个实施方式中，包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链 可变区的碱基序列的多核苷酸为包含编码由序列号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构 成的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸。
[0126] 作为包含编码由序列号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区的 碱基序列的多核苷酸，可以列举例如包含序列号3的碱基序号1~324的碱基序列的多核苷 酸。
[0127] 在优选的实施方式中，包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的轻链可变区的碱基序 列的多核苷酸为包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷 酸。
[0128] 作为包含编码由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的碱基序列的多核苷酸， 可以列举例如包含序列号3所示的碱基序列的多核苷酸。
[0129] 本发明的多核苷酸可以由本领域技术人员基于其碱基序列使用本领域中公知的 方法容易地制作。例如，本发明的多核苷酸可以利用本领域中公知的基因合成方法进行合 成。作为这样的基因合成方法，可以使用W090/07861中记载的抗体基因的合成方法等本领 域技术人员公知的各种方法。
[0130]〈本发明的表达载体〉
[0131] 本发明的表达载体包括:含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片 段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸和/或包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原 结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
[0132] 作为优选的本发明的表达载体，可以列举含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体 的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体、含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的轻链 的碱基序列的多核苷酸的表达载体、或者含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的 碱基序列的多核苷酸和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体。
[0133] 作为用于表达本发明的多核苷酸所使用的表达载体，只要在真核细胞(例如动物 细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母)和/或原核细胞(例如大肠杆菌）的各种宿主细胞中表达包 含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区的碱基序列的多核苷酸 和/或包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多 核苷酸且能够产生由这些多核苷酸编码的多肽，则没有特别限制。作为这样的表达载体，可 以列举例如质粒载体、病毒载体（例如腺病毒、逆转录病毒）等，可以优选使用PEE6.4、 pEE12.4(龙沙公司）。另外，也可以将可变区基因片段导入到AG-y1、AG-k(例如参考W094/ 20632)等预先具有人Ig恒定区基因的表达载体中来表达抗体基因。
[0134] 本发明的表达载体可以包含以能够发挥功能的方式与本发明的多核苷酸连接的 启动子。作为用于在动物细胞中表达本发明的多核苷酸的启动子，可以列举例如CMV、RSV、 SV40等病毒来源启动子、肌动蛋白启动子、EF(elongation factor，延伸因子）la启动子、热 休克启动子等。作为用于在细菌(例如埃希氏菌属菌）中表达的启动子，可以列举例如trp启 动子、lac启动子、APL启动子、tac启动子等。另外，作为用于在酵母中表达的启动子，可以列 举例如GAL1启动子、GAL10启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子等。
[0135] 在使用动物细胞、昆虫细胞或酵母作为宿主细胞的情况下，本发明的表达载体可 以包含起始密码子和终止密码子。这种情况下，本发明的表达载体可以包含增强子序列、编 码本发明的抗体或其重链可变区或轻链可变区的基因的5'侧和3'侧的非翻译区域、分泌信 号序列、剪切接合部、多聚腺苷酸化部位或可复制单元等。在使用大肠杆菌作为宿主细胞的 情况下，本发明的表达载体可以包含起始密码子、终止密码子、终止子区域和可复制单元。 这种情况下，本发明的表达载体可以根据目的包含通常使用的选择标记(例如四环素耐性 基因、氨苄青霉素耐性基因、卡那霉素耐性基因、新霉素耐性基因、二氢叶酸还原酶基因）。
[0136] 〈本发明的进行了转化的宿主细胞〉
[0137] 本发明的进行了转化的宿主细胞包括选自由下述(a)~（d)组成的组中的利用本 发明的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0138] (a)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的 多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0139] (b)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变 区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0140] (c)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;和
[0141] (d)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0142] 在一个实施方式中，本发明的进行了转化的宿主细胞为选自由下述(a)~(d)组成 的组中的利用本发明的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0143] (a)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、和 包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0144] (b)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的 宿主细胞；
[0145] (c)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体进行了转化的宿主细胞;和
[0146] (d)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0147] 作为优选的本发明的进行了转化的宿主细胞，可以列举利用含有包含编码本发明 的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多 核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、以及利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗 体的重链的碱基序列的多核苷酸的表达载体和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的 多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0148] 作为进行转化的宿主细胞，只要适合于所使用的表达载体、能够被该表达载体转 化且表达抗体，则没有特别限定。作为进行转化的宿主细胞，可以列举例如本发明的技术领 域中通常使用的天然细胞或人工建立的细胞等各种细胞(例如，动物细胞(例如CH0-K1SV细 胞）、昆虫细胞(例如Sf9)、细菌(埃希氏菌属菌等）、酵母(酵母菌属、毕赤酵母属等)等），可 以优选使用CH0细胞(CH0-K1SV细胞、CH0-DG44细胞等）、293细胞、NS0细胞等培养细胞。
[0149] 对宿主细胞进行转化的方法没有特别限定，可以使用例如磷酸钙法、电穿孔法等。
[0150] 〈生产本发明的抗人PAI-1抗体的方法和利用该方法生产的抗人PAI-1抗体〉
[0151] 生产本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法包括:包含对选自由下述 (a)~(c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的 步骤的生产抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法。
[0152] (a)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的 多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0153] (b)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变 区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;以及
[0154] (c)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变区 的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗体或 其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0155] 在一个实施方式中，生产本发明的抗人PAI-1抗体的方法包括:包含对选自由下述 (a)~（c)组成的组中的宿主细胞进行培养、使其表达抗人PAI-1抗体的步骤的生产抗人 PAI-1抗体的方法。
[0156] (a)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸、和 包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞；
[0157] (b)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的 宿主细胞；以及
[0158] (c)利用含有包含编码本发明的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸的 表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷 酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。
[0159] 生产本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法只要包括对本发明的进行 了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤，则没有特 别限定。作为该方法中使用的优选的宿主细胞，可以列举上述优选的本发明的进行了转化 的宿主细胞。
[0160]进行了转化的宿主细胞的培养可以利用公知的方法进行。培养条件例如温度、培 养基的pH、和培养时间可适当选择。在宿主细胞为动物细胞的情况下，作为培养基，可以使 用例如含有约5 %~约20 %的胎牛血清的MEM培养基（Science、1959、Vol. 130、No. 3373、 p ? 432-7 )、DMEM 培养基（Virology、1959、Vol.8、p.396)、RPMI 1640培养基 (J.Am.Med.Assoc.、1967、Vol. 199、p. 519)、199培养基（Exp.Biol .Med.、1950、Vol.73、p」_ 8)等。培养基的pH优选为约6~约8,培养中根据需要进行通气、搅拌，通常在约30°C~约40 °(：下进行约15小时~约72小时。在宿主细胞为昆虫细胞的情况下，作为培养基，可以使用例 如含有胎牛血清的Grace's培养基（Proc.Natl .Acad. Sci.USA、1985、Vol.82、p.8404)等。培 养基的pH优选为约5~约8,培养中根据需要进行通气、搅拌，通常在约20°C~约40°C下进行 约15小时~约100小时。在宿主为胞为大肠杆菌或酵母的情况下，作为培养基，例如含有营 养源的液体培养基是适当的。营养培养基优选含有进行了转化的宿主细胞的生长所需的碳 源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，可以列举例如葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等，作 为无机氮源或有机氮源，可以列举例如铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、 肉提取物、豆柏、马铃薯提取液等。可以根据期望含有其他营养素（例如，无机盐(例如氯化 钙、磷酸二氢钠、氯化镁）、维生素类等）、抗生物质（例如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那 霉素等）。培养基的pH优选为约5~约8。在宿主细胞为大肠杆菌的情况下，作为优选的培养 基，可以使用例如LB培养基、M9培养基(Mol.Clo.、冷泉港实验室、2001、￥〇1.3^2.2)等。培 养中根据需要进行通气、搅拌，通常在约14°C~约39°C下进行约3小时~约24小时。在宿主 细胞为酵母的情况下，作为培养基，可以使用例如Burkholder基本培养基 (Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1980、Vol.77、p.4505)等。培养中根据需要进行通气、搅拌，通 常在约20°C~约35°C下进行约14小时~约144小时。通过如上所述的培养，能够表达本发明 的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
[0161] 生产本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法中，除了对本发明的进行 了转化的宿主细胞进行培养、使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤之外，可以 进一步包括从该进行了转化的宿主细胞中回收、优选分离或纯化抗人PAI-1抗体或其抗原 结合片段的步骤。作为分离或纯化方法，可以列举例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方 法;透析、超滤、凝胶过滤等利用分子量差异的方法;离子交换色谱、羟基磷灰石层析等利用 带电的方法;亲和层析等利用特异亲和性的方法;反相高效液相色谱等利用疏水性差异的 方法;等电点电泳等利用等电点差异的方法等。蓄积在培养上清中的抗体可以优选通过各 种层析、例如使用蛋白A柱或蛋白G柱的柱层析进行纯化。
[0162] 本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段也包含通过生产本发明的抗人PAI-1 抗体或其抗原结合片段的方法生产的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。
[0163] 〈本发明的药物组合物〉
[0164] 本发明的药物组合物包括:包含本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段和药 学上可接受的赋形剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以使用该领域中通常使用的赋 形剂、即药剂用赋形剂、药剂用载体等利用通常使用的方法进行制备。作为这些药物组合物 的剂型的示例，可以列举例如注射剂、点滴用剂等非□服剂，可以通过静脉内给药、皮下给 药等进行给药。制剂化时，可以在药学上可接受的范围内使用与剂型相应的赋形剂、载体、 添加剂等。
[0165] 本发明的药物组合物可以包含多种本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。 例如，含有未受到翻译后修饰的抗体或其抗原结合片段、以及该抗体或其抗原结合片段经 翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段的药物组合物也包含在本发明中。
[0166] 在一个实施方式中，含有抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的本发明的药物组合 物也包括如下所述的药物组合物。
[0167] 含有包含由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序 列号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结 合片段、以及该抗体或其抗原结合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段的药物 组合物。
[0168] 本发明的药物组合物也包括:含有重链C末端赖氨酸缺失的抗体、受到N末端翻译 后修饰的抗体或其抗原结合片段、重链C末端赖氨酸缺失且受到N末端翻译后修饰的抗体、 和/或具有重链C末端赖氨酸且未受到N末端翻译后修饰的抗体的药物组合物。
[0169] 在一个实施方式中，含有抗人PAI-1抗体的本发明的药物组合物也包括含有下述 (1)~(4)中的2种以上的抗人PAI-1抗体的药物组合物。
[0170] (1)包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所 示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
[0171 ] (2)包含由序列号2所示的氨基酸序列构成且氨基酸序号1的谷氨酸被修饰为焦谷 氨酸的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
[0172] (3)包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序列构成且氨基酸序号1的谷氨 酸被修饰为焦谷氨酸的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
[0173] (4)包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列 构成的轻链的抗人PAI-1抗体。
[0174] 在又一个实施方式中，含有抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的本发明的药物组 合物也包括如下所述的药物组合物。
[0175] 含有包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序 列构成的轻链的抗人PAI-1抗体、包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨基酸序列构成的 重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链的抗人PAI-1抗体、以及药学上可接受的赋 形剂的药物组合物。
[0176] 上述制剂化时的本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的添加量根据患者的 症状的程度和年龄、所使用的制剂的剂型或抗体的结合效价等而有所不同，例如可以使用 约0 ? 001mg/kg ~约 100mg/kg。
[0177] 本发明的药物组合物能够用作活性型人PAI-1参与病态形成的疾病、例如特发性 肺纤维化等肺纤维化的预防或治疗剂。
[0178] 本发明中包括含有本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的特发性肺纤维化 等肺纤维化的预防或治疗用药物组合物。另外，本发明包括包含以治疗有效量给药本发明 的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤的、治疗或预防特发性肺纤维化等肺纤维化的 方法。另外，本发明包括用于在特发性肺纤维化等肺纤维化的预防或治疗中使用的本发明 的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。此外，本发明包括本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原 结合片段在制造特发性肺纤维化等肺纤维化的预防或治疗用药物组合物中的应用。
[0179] 〈融合抗体和修饰抗体〉
[0180] 本领域技术人员也可以使用本领域中公知的方法，以融合有其他肽或蛋白质的融 合抗体的形式制作抗体或其抗原结合片段，或者以结合有修饰剂的修饰抗体的形式制作抗 体或其抗原结合片段。本发明的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段也包括这样的融合体、修 饰体的形态的抗体或抗原结合片段。例如，也包括在包含由序列号2的氨基酸序号1~118的 氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链 可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段上融合其他肽或蛋白质而得到的抗人PAI-1抗 体或其抗原结合片段、或者结合修饰剂而得到的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。只要本 发明的抗体或其抗原结合片段作为融合抗体具有与VTN-PAI-1复合物结合的活性，则融合 中使用的其他肽或蛋白质没有特别限定，可以列举例如人血清白蛋白、各种标签肽、人工螺 旋基序肽、麦芽糖结合蛋白质、谷胱甘肽S转移酶、各种毒素、其他能够促进多聚体化的肽或 蛋白质等。只要本发明的抗体或其抗原结合片段作为修饰抗体具有与VTN-PAI-1复合物结 合的活性，则修饰中使用的修饰剂没有特别限定，可以列举例如聚乙二醇、糖链、磷脂、核糖 体、低分子化合物等。
[0181] 为了对本发明获得进一步理解，在此提供参考的特定实施例，但这些实施例的目 的在于例示，并不限定本发明。
[0182] 实施例
[0183] 关于使用市售的试剂盒或试剂等的部分，只要没有特别说明，则按照附带的操作 程序进行实验。另外，为了方便起见，将浓度mol/L以M表示。例如，1M羟化钠水溶液表示为 lmol/L的羟化钠水溶液。
[0184] (实施例1:免疫抗原的研究和产生抗人PAI-1抗体的杂交瘤的制作）
[0185] 为了获取对活性型人PAI-1的选择性高的抗体，对最佳的人PAI-1肽抗原进行了研 究。对肽的长度和氨基酸序列进行研究的结果表明，在利用在人PAI-1中的16个氨基酸残基 的肽抗原STAVIVSARMATOEII(序列号5)的C末端连接有多抗原肽8(Multiple Antigen Peptide 8，MAP8)(J.Biol.Chem.、1988、Vol.263、No.4、p. 1719-1725)的肽进行免疫的情况 下，能够获取中和血浆中的活性型人PAI-1的抗体。进一步对与抗原连接的蛋白质、免疫方 法等进行独创性研究的结果表明，在将在该肽抗原的C末端连接有钥孔血蓝蛋白（Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)蛋白质的肽与重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、 PAI-A)混合后同时进行免疫的情况下，能够获取强力地中和血浆中的活性型人PAI-1、且对 与玻连蛋白形成了复合物的活性型人PAI-1 (VTN-PAI-1复合物)的选择性高的抗体。
[0186] 使用人单克隆抗体开发技术 "Ve 1 〇c Immune"（ Ve 1 〇c Immune an t i body technology :Regeneron公司（美国专利6596541号））小鼠来制作抗体。具体而言，将在人 PAI-1中的16个氨基酸残基的肽抗原STAVIVSARMAPEEIK序列号5)的C末端连接有KLH蛋白 质的肽抗原和重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)与引起免疫反应的 佐剂一同对Ve loclmmune小鼠进行免疫。对小鼠进行多次免疫，确认到血衆中抗体效价的升 高。最后进行7次免疫，按照常规方法摘取免疫后的小鼠的淋巴结，回收淋巴细胞，将其与小 鼠来源骨髓瘤细胞SP2/0(ATCC:CRL-1581)进行细胞融合，由此制作杂交瘤。制作杂交瘤的 有限稀释样品，进行单克隆化。对各克隆进行扩大培养后，将培养基变更为作为无血清培养 基的⑶杂交瘤培养基（Invitrogen公司），培养约1周。使用蛋白G柱(GE healthcare公司）从 所得到的培养上清中纯化出抗体。在Ve locImmune技术中，使用内源性免疫球蛋白重链和轻 链的可变区被相应的人可变区置换的转基因小鼠，因此，所得到的抗体为具有人抗体的可 变区和小鼠抗体的恒定区的抗体(也称为嵌合抗体）。
[0187] (实施例2:ELISA检测）
[0188] 为了测定抗体的抗原特异的结合活性，使用ELISA检测。在此，为了评价对活性型 人PAI-1的选择性，使用使玻连蛋白固相化并添加活性型人PAI-1而制作的板、和添加潜在 型人PAI-1代替活性型人PAI-1而制作的板来进行试验。
[0189] 将玻连蛋白（BD Biosciences公司、354238)用磷酸缓冲生理盐水(PBS)稀释至 1000ng/mL，以每1孔lOOuL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司）中，将板在4°C静置一 晚，由此使玻连蛋白固相化。通过反向离心除去玻连蛋白固相液，以每1孔l〇〇yL添加用PBS 稀释至1000ng/mL的浓度的重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)或重 组潜在型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-L)，在4°C静置1小时。通过反向离心除 去溶液，以每1孔200此添加用roS稀释至3倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶 液。在室温下静置1小时后，通过反向离心除去封闭剂。使用以PBS稀释至20倍的封闭剂 (Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液，对于添加有活性型人PAI-1的板，将纯化抗体样品 稀释为从l〇〇〇ng/mL至0.1 ng/mL的7个梯度，对于添加有潜在型人PAI-1的板，将纯化抗体样 品稀释为从3000ng/mL至0.3ng/mL的7个梯度，每1孔添加100此。作为对照，准备添加了用 PBS稀释至20倍的封闭剂溶液来代替抗体的孔。在室温下孵育1小时后，用清洗液（含有 0.05%吐温-20的Tris缓冲生理盐水(TBS))清洗3次，添加用以PBS稀释至20倍的封闭剂溶 液稀释至2000倍的HRP标记兔抗小鼠I g抗体(DAK0公司、P260) 100yL。在室温下孵育30分钟 后，用清洗液清洗3次。添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司）中含有的显色液lOOii L，在室温下静置约15分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液lOOiiL，利用 EnVi s i on计数仪(珀金埃尔默公司）测定其0D450值。
[0190]计算各抗体的各浓度下的PAI-1结合率时，将添加了用PBS稀释至20倍的封闭剂 (Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液来代替抗体的孔的测定值设定为0%，将各抗体的测 定值的最大值设定为1〇〇%。对由测定值算出的PAI-1结合率进行分析，通过四参数逻辑曲 线回归算出抗体的EC50值。
[0191] 结果表明，命名为H0T-1的抗体(嵌合抗体)对VTN-PAI-1复合物具有选择性的、比 对潜在型PAI-1高的结合活性。
[0192] (实施例3:完全人型抗体的制作）
[0193] 上述抗体是可变区为人来源、恒定区为小鼠来源的抗体。因此，本发明人使用作为 哺乳细胞表达用载体的GS载体(Lonza公司），构建包含重链和轻链这两者的基因的表达载 体，制作出完全人型抗体。具体而言，对于实施例2中鉴定的H0T-1，从杂交瘤中提取RNA，使 用cDNA扩增试剂盒（SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒;Clontech公司）制作cDNA。接着，利用 聚合酶链式反应(PCR)对重链和轻链的可变区进行延伸和扩增。在H0T-1的重链可变区基因 的5 ' 侧连接编码信号序列（Nigel Whit tie等、Protein Engineering、1987、Vol.l、No .6、 p.499-505)的基因，然后在3'侧连接人Ig 丫 1的恒定区基因（由序列号1的碱基序号355~ 1344的碱基序列构成），将该重链基因插入到GS载体pEE6.4中。另外，在H0T-1的轻链可变区 基因的5'侧连接编码信号序列(NigelWhittle等、同前）的基因，然后在3'侧连接人k链的恒 定区基因（由序列号3的氨基酸序号325~642的碱基序列构成），将该轻链基因插入到GS载 体 PEE12.4中。
[0194] 利用测序仪对插入到pEE6.4中的抗体的重链基因序列、插入到pEEl 2.4中的抗体 的轻链基因序列进行分析，根据由该结果得到的氨基酸序列，参考Kabat等的数据库 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest"、美国卫生和公众服务部、美国 政府印刷办公室)来确定CDR序列。
[0195] 将所制作的H0T-1的完全人型抗体(完全人型H0T-1)的重链的碱基序列示于序列 号1，将由其编码的氨基酸序列示于序列号2,将该抗体的轻链的碱基序列示于序列号3,将 由其编码的氨基酸序列示于序列号4。序列号2所示的重链的可变区由序列号2的氨基酸序 号1~118的氨基酸序列构成，重链的⑶R1、CDR2、⑶R3分别由序列号2的氨基酸序号31~35、 50~66、99~107的氨基酸序列构成。序列号4所示的轻链的可变区由序列号4的氨基酸序号 1~108的氨基酸序列构成，轻链的⑶R1、⑶R2、⑶R3分别由序列号4的氨基酸序号24~34、50 ~56、89~97的氨基酸序列构成。
[0196] 将分别插入有完全人型H0T-1的重链和轻链的基因的上述GS载体用Notl和Pvul进 行限制酶切割，使用DNA连接试剂盒(宝生物公司）进行连接，构建插入有重链和轻链这两者 的基因的GS载体。使用该GS载体，利用瞬时性表达和永久性表达这两种方法进行抗体表达。 关于瞬时性表达，针对使用FreeStyle 293表达培养基（Invitrogen公司）培养至约100万 个/1111^的？1663七716 293细胞（111￥；[1：1'08611公司），使用基因导入试剂？166 8七716]\1八父 (Invitrogen公司）转染该GS载体，培养7天。使用蛋白G柱(GKfealthcare公司）从其培养上 清中得到完全人型抗体的纯化抗体。关于永久性表达，使用电穿孔法将该GS载体转染到 CH0-K1SV细胞(Lonza公司）中，由此使其表达抗体。使用蛋白A柱(GE Healthcare公司）从其 培养上清中纯化出完全人型抗体。
[0197] (实施例4:完全人型抗体的氨基酸修饰分析）
[0198] 对纯化的完全人型H0T-1的氨基酸修饰进行分析，结果，在大部分纯化抗体中发生 了重链C末端的赖氨酸缺失。
[0199] (实施例5:人血浆中活性型PAI-1抑制活性测定）
[0200]为了针对实施例2中鉴定的H0T-1 (嵌合抗体)和实施例3中制作的完全人型H0T-1 进行人血浆中的活性型PAI-1抑制活性的评价，使用肥胖症患者的血浆，实施了活性型PAI-1抑制检测。在使用正常人的血浆的情况下，活性型PAI-1的浓度低，难以构建检测系统，因 此，使用已知血浆中活性型PAI-1浓度高的肥胖症患者的血浆(Nature Medicine、1996、 Vol.2、p.800-803)〇
[0201]将uPA(尿激酶静注用6万单位注册商标）；田边三菱制药株式会社）用 PBS稀释至50单位/mL，以每1孔lOOuL添加到作为检测板的Nunc Maxisorp白色96板(Nunc公 司）中，将板在4°C静置一晚，由此使uPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200yL添 加用PBS稀释至3倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液，在室温下静置1小时。
[0202]在此期间，制备肥胖症患者血浆与抗体样品的混合液(血浆-抗体混合液）。具体而 言，使用含有〇. 1 %牛血清来源白蛋白（BSA)的PBS，在制备血浆-抗体混合液时，以将肥胖症 患者血浆稀释至35倍的方式对血浆进行稀释(血浆-抗体混合液中含有的人血浆来源活性 型PAI-1的浓度为约360pg/mL)。另外，使用含有0.1%BSA的PBS，以抗体的终浓度为从 1000ng/mL至Ing/mL的7个梯度的稀释系列的方式对抗体样品进行稀释。然后，将上述血浆 和抗体样品混合，制备血楽 -抗体混合液。作为标准曲线用样品，制备用含有〇. 1 %BSA的PBS 稀释为从l〇〇〇〇pg/mL至10pg/mL的7个梯度的重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation 公司、PAI-A)。作为对照样品，准备将含有0.1 %BSA的PBS代替抗体与肥胖症患者血浆进行 混合的样品。将这些血浆-抗体混合液、标准曲线样品和对照样品在室温下静置30分钟，进 行预孵育。
[0203] 通过反向离心除去上述检测板中的封闭剂后，以每1孔100yL在检测板中添加上述 预孵育后的血浆-抗体混合液、标准曲线用样品和对照样品，在室温下静置30分钟。将板用 清洗液(含有〇.〇5%吐温_20的185)清洗3次，以每1孔100此添加用以1^5稀释至20倍的封闭 剂（Nacalai Tesque 公司、03953-95)溶液稀释至 3000 倍的抗PAI-1 抗体（Progen Biotechnik公司、MA-33H1F7)。在室温下静置30分钟后，将板用清洗液清洗3次，以每1孔100 此添加用以roS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍 的生物素化抗小鼠Ig抗体(Ancell公司、234010)。在室温下静置30分钟后，将板用清洗液清 洗3次，以每1孔100yL添加用以roS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95) 溶液稀释至1000倍的碱性磷酸酶标记链霉亲和素(Thermo SCIENTIFIC公司）。在室温下孵 育30分钟后，用清洗液清洗3次。以每1孔100此添加用含有2mM Tris(pH9.8)的0.1 mM氯化 儀水溶液稀释5倍的喊性磷酸酶底物(Chemiluminescent AP; SurModics公司、100-01)，使用EnVision计数仪(珀金埃尔默公司）测定其信号值。
[0204]使用标准曲线算出活性型人PAI-1浓度。以复孔对各抗体进行试验，算出平均值。 添加了将含有〇.l%BSA的PBS代替抗体与肥胖症患者血浆进行混合的样品的孔的活性型人 PAI-1浓度设定为100%，将抗体1000ng/mL与肥胖症患者血浆混合的孔的活性型人PAI-1浓 度设定为0%。对算出的活性型人PAI-1抑制率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出抗 体的IC50值。
[0205] 结果，H0T-1 (嵌合抗体）的IC50值为11.3ng/mL，完全人型H0T-1的IC50为6.0ng/ mL，表明任一种抗体均抑制人血浆中的活性型PAI-1的uPA结合活性。
[0206](实施例6:对VTN-PAI-1复合物的结合选择性评价）
[0207]利用ELISA检测，评价实施例3中制作的完全人型H0T-1对VTN-PAI-1复合物的结合 选择性。制作下述(1)~(4)的四种人PAI-1固相化板，使用各板进行试验。
[0208] (l)VTN-PAI-l复合物固相化板
[0209] 将玻连蛋白（BD Biosciences公司、354238)用PBS稀释至 1000ng/mL，以每 1 孔 100y L添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司）中，将板在4°C静置一晚，由此使玻连蛋白固相 化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200yL添加封闭剂（Thermo SCIENTIFIC公司、 37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔100yL添加用含有0.1 %BSA的roS稀释至1000ng/mL 的重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)，使玻连蛋白捕获重组活性型 人PAI-1。通过利用该板进行的试验，评价抗体对VTN-PAI-1的结合活性。
[0210] ⑵潜在型人PAI-1固相化板
[0211] 将重组潜在型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-L)用PBS稀释至 1000ng/ mL，以每1孔lOOyL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司）中，将板在4°C静置一晚，由此 使潜在型人PAI-1固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200此添加封闭剂（Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。通过利用该板进行的试验，评价抗体对潜 在型人PAI-1的结合活性。
[0212] (3)uPA-PAI-l复合物固相化板
[0213]将uPA(尿激酶静注用6万单位注册商标）；田边三菱制药株式会社）用 PBS稀释至100单位/mL，以每1孔lOOuL添加NuncMaxisorp透明96板(Nunc公司），将板在4°C 静置一晚，由此使uPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200yL添加封闭剂(Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔100yL添加用含有0.1 %BSA的PBS 稀释至1000ng/mL的重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)，使uPA捕获 重组活性型人PAI-1。通过利用该板进行的试验，评价抗体对uPA-PAI-1复合物的结合活性。 [0214] ⑷tPA-PAI-1复合物固相化板
[0215] 将tPA(アクテパシレ（注册商标）注600万；协和发酵麒麟株式会社）用PBS稀释至 1000单位/mL，以每1孔lOOuL添加到Nunc Maxisorp透明96板(Nunc公司）中，将板在4°C静置 一晚，由此使tPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200iiL添加封闭剂（Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置30分钟。以每1孔100yL添加用含有0.1 %BSA的PBS 稀释至1000ng/mL的重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)，使tPA捕获 重组活性型人PAI-1。通过利用该板进行的试验，评价抗体对tPA-PAI-1复合物的结合活性。 [0 216]将所制作的各人PAI-1固相化板用清洗液(含有0.05%吐温-20的TBS)进行清洗， 以每1孔100yL添加用含有0.1 %BSA的roS稀释为从100000ng/mL至0.01ng/mL的8个梯度的 完全人型H0T-1，在室温下静置30分钟。作为比较抗体，将作为完全人型抗人PAI-1抗体的 MEDI-579(专利文献3)、作为小鼠抗人PAI-1 抗体的MA-33B8(Progen Biotechnik公司）、MA-33H1F7 (Progen Biotechnik公司）、MA-55F4C12(Hycult Biotech公司、HM2180)和MA-56A7C10(Hycult Biotech公司、HM2182)用含有0? 1%BSA的PBS稀释为从lOOOOng/mL至 0.0 lng/mL的7个梯度，每1孔添加100yL，在室温下静置30分钟。另外，作为对照，制作添加了 含有0.1%BSA的PBS来代替抗体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔100此添加使用以PBS稀 释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至2000倍的检测抗体，使其 反应。作为检测抗体，具有小鼠抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP标记山羊抗小鼠Ig 抗体(Southern Biotech公司、1010-05)，具有人抗体的Fc段的受试抗体的检测中使用HRP 标记兔抗人Ig抗体(Southern Biotech公司、6145-05)。在室温下孵育30分钟后，用清洗液 清洗3次。以每1孔100此添加过氧化物酶用显色试剂盒(住友电木公司）中含有的显色液，在 室温下静置约15分钟后，添加上述显色试剂盒中含有的反应终止液100yL，利用EnVision计 数仪(珀金埃尔默公司）测定其0D450值。
[0217]在各板中以复孔进行各抗体的试验，算出平均值。计算各抗体的各浓度下的PAI-1 结合率时，将添加了含有〇. 1 %BSA的PBS来代替抗体的孔的测定值设定为0%，将各抗体的 最大浓度的测定值设定为100%。其中，关于完全人型H0T-1，在对潜在型人PAI-l、uPA-PAI-1复合物和tPA-PAI-1复合物的结合活性评价系统中，即使添加最大浓度也达不到具有相同 的人Fc段的MEDI-579的最大浓度的测定值，因此，将MEDI-579的各评价系统中的最大浓度 的测定值设定为1 〇〇 %。另外，关于MA33-B8，在对VTN-PAI-1复合物的结合活性评价系统中， 即使添加最大浓度也达不到具有相同的小鼠Fc段的MA56-A7C10的最大浓度的测定值，因 此，将MA56-A7C10的评价系统中的最大浓度的测定值设定为100%。对算出的PAI-1结合率 进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出抗体的EC50值。
[0218]表1:抗人PAI-1抗体对各种人PAI-1的结合活性
[0220] >100000是指，显示出MEDI-579的各评价系统中的最大浓度的测定值的50%的抗 体浓度大于l〇〇〇〇〇ng/mL。
[0221] 结果表明，完全人型H0T-1对VTN-PAI-1复合物显示出强结合活性，并且具有极高 的选择性结合活性。
[0222]与各比较抗体相比，完全人型H0T-1对VTN-PAI-1复合物具有极高的选择性结合活 性，由此暗示出，完全人型H0T-1与PAI-1的结合部位不同于现有已知的抗人PAI-1抗体与 PAI-1的结合部位，其结合更接近于人PAI-1的活性中心或其周围的部位。
[0223] (实施例7:对单体活性型人PAI-1的结合评价）
[0224] 为了测定完全人型H0T-1对单体活性型人PAI-1的结合活性，进行了 SPR分析。SPR 分析中，使用Biacore(注册商标）T200(GE Healthcare日本）和重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)进行分析。结果表明，完全人型H0T-1与以单体形式存 在的活性型人PAI-1结合。
[0225] (实施例8:对猴PAI-1的结合选择性评价）
[0226] 利用ELISA检测，评价完全人型H0T-1对同玻连蛋白形成了复合物的活性型猴PAI-1 (也称为VTN-猴PAI-1复合物)的结合选择性。制作下述(1)~(4)的四种猴PAI-1固相化板， 使用各板进行试验。作为比较抗体，使用MEDI-579。
[0227] (l)VTN-猴PAI-1复合物固相化板
[0228] 按照实施例6 (1)中记载的方法，评价抗体对VTN-猴PAI -1的结合活性。其中，使用 重组活性型猴PAI-1 (Molecular Innovation公司、CYPAI)代替重组活性型人PAI-1。另外， 将完全人型H0T-1和MEDI-579稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度来使用。
[0229] (2)潜在型猴PAI-1固相化板
[0230] 按照实施例6(2)中记载的方法，评价抗体对潜在型猴PAI-1的结合活性。其中，使 用重组潜在型猴PAI-1 (Molecular Innovation公司、CYPAI-L)来代替重组潜在型人PAI-1。 另外，将完全人型H0T-1和MEDI-579稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度来使用。 [0231] (3)uPA_猴PAI-1复合物固相化板
[0232]按照实施例6 (3)中记载的方法，评价抗体对uPA-猴PAI-1复合物的结合活性。其 中，使用重组活性型猴PAI-1 (Molecular Innovation公司、CYPAI)来代替重组活性型人 PAI-1。另外，将完全人型H0T-1和MEDI-579稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度来 使用。
[0233] (4)tPA_猴PAI-1复合物固相化板
[0234] 按照实施例6 (4)中记载的方法，评价抗体对tPA-猴PAI-1复合物的结合活性。其 中，使用重组活性型猴PAI-1 (Molecular Innovation公司、CYPAI)来代替重组活性型人 PAI-1。另外，将完全人型H0T-1和MEDI-579稀释为从10000ng/mL至0.01ng/mL的7个梯度来 使用。
[0235] 使用所制作的各猴PAI-1固相化板，按照实施例6中记载的方法，计算各抗体的 EC50值。其中，关于完全人型H0T-1，在对潜在型猴PAI-l、uPA-猴PAI-1复合物和tPA-猴PAI-1复合物的结合活性评价系统中，即使添加最大浓度也达不到具有相同的人Fc段的MEDI-579 的最大浓度的测定值 ，因此 ，将 MEDI-579 的各评价系统中 的最大浓度的测定值设定为 100%〇
[0236] 表2:抗PAI-1抗体对各种猴PAI-1的结合活性
[0238] >10000是指，显示出MEDI-579的各评价系统中的最大浓度的测定值的50%的抗体 浓度大于l〇〇〇〇ng/mL。
[0239] 结果表明，完全人型H0T-1抗体对VTN-猴PAI-1复合物显示出强结合活性，并且具 有极高的选择性结合活性。
[0240](实施例9:人和猴血浆中活性型PAI-1抑制活性测定）
[0241] 实施了完全人型H0T-1和MEDI-579的人和猴血浆中的活性型PAI-1抑制活性的评 价。关于人血浆，与实施例5同样地使用肥胖症患者的血浆。关于猴血浆，使用对食蟹猴静脉 内给药LPS并采集的血浆。
[0242] 关于人血浆中的活性型PAI-1抑制活性的评价，按照实施例5的方法进行。关于猴 血浆中的活性型PAI-1抑制活性的评价，在实施例5记载的方法中，使用猴血浆来代替人血 浆。对于猴血浆，使用含有0.1 %BSA的roS，在制备血浆-抗体混合液时，以将猴血浆稀释120 倍的方式对血衆进行稀释。两个评价系统均以各抗体的终浓度为300ng/mL至0.3ng/mL(7个 梯度稀释）的条件实施。作为标准曲线用样品，使用以含有〇.l%BSA的PBS稀释为从3000pg/ mL至3pg/mL的7个梯度的重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A) 〇
[0243] 使用标准曲线算出各活性型PAI-1浓度。以复孔对各抗体进行试验，算出平均值。 将添加了将含有0.1%BSA的PBS代替抗体与肥胖症患者血浆或猴血浆进行混合的样品的孔 的活性型PAI-1浓度设定为100%，将MEDI-579抗体300ng/mL与肥胖症患者血浆或猴血浆混 合的孔的各活性型PAI-1浓度设定为0%。对算出的各活性型PAI-1抑制率进行分析，通过四 参数逻辑曲线回归算出抗体的IC50值。
[0244] 结果，完全人型H0T-1对人血浆中活性型PAI-1的uPA结合活性的IC50值为4.2ng/ mL，MEDI-579对人血浆中活性型PAI-1的uPA结合活性的IC50值为0.73ng/mL。完全人型H0T-1对猴血浆中活性型PAI-1的uPA结合活性的IC50值为37ng/mL，MEDI-579对猴血浆中活性型 PAI-1的uPA结合活性的IC50值为0.83ng/mL。
[0245] 表明完全人型H0T-1和MEDI-579抑制人和猴血浆中的活性型PAI-1的uPA结合活 性。
[0246] (实施例10:利用体外血管内重现系统的PAI-1抑制活性测定）
[0247] 已知在血管壁中uPA和tPA由血管内皮产生，并且结合在血管内皮上(Baillieres Clin.Haematol. ^1993^Vol.6^No.3^p.559-576〇Blood^201UVol.ll8^No.lUp.3182-3185)。即，uPA和tPA不仅存在于血中，也存在于血管壁。在实施例9中，测定了抗PAI-1抗体 对血浆中的活性型PAI-1的抑制活性，但该实验系统仅提取了血浆中成分，未考虑血管壁的 影响。因此，认为很难说其反映了实际的血管中的生物反应。因此，作为模拟实际的血管内 状态的系统，使用在固相化有uPA-PAI-1复合物的检测板中将活性型PAI-l、uPA和uPA底物 肽混合的评价系统，以uPA的活性作为指标对完全人型H0T-1和MEDI-579的活性进行了测 定。
[0248] 将重组活性型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)用PBS稀释至lOyg/ mL，以每1孔100yL添加到Nunc Maxisorp白色96板(Nunc公司）中，在室温下将板静置20分 钟，由此使活性型PAI-1固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200yL添加封闭剂 (Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液，在室温下静置15分钟。通过反向离心除去溶液后， 用以PBS稀释至3倍的封闭剂将uPA(尿激酶静注用6万单位"夂氺シス"（注册商标）；田边三 菱制药株式会社)稀释至50单位/mL，每1孔添加100iiL。在室温下静置20分钟后，以每1孔200 yL添加重碳酸盐缓冲液(西格玛公司、C3041-50CAP)，在37°C下静置一晚。
[0249] 使用含有0.1 %BSA的roS对各抗体进行稀释，使各抗体的终浓度为从500ng/mL至 0.015ng/mL的10个梯度的稀释系列。在各抗体溶液中混合用PBS稀释至终浓度为0.0025yg/ mL的重组人活性型PAI-1、用roS稀释至终浓度为0.0025yg/mL的玻连蛋白、用PBS稀释至终 浓度为65ng/mL的作为uPA的底物肽的甘氨酰甘氨酰-L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 (Glutarylglycyl-L-arginine 4-methylcoumaryl-7_amide)(肽研究所、3097-v)、用PBS稀 释至终浓度为1.25mg/mL的BSA、以及用roS稀释至终浓度为0.05单位/mL的uPA。另外，作为 对照，制作添加了含有〇. 1 %BSA的roS来代替抗体的孔、以及混合了含有0.1 %BSA的roS和 PBS来代替抗体和重组人活性型PAI-1的孔。
[0250] 将板用清洗液(含有0.05 %吐温-20的TBS)清洗3次后，以每1孔50yL添加上述混合 液，在室温下静置24小时，由此进行uPA将底物肽切断的酶反应。底物肽被切断时，作为荧光 物质的氨基_4_甲基-香素从肽主体上被切去。将各孔的样品每1孔各米集20iiL，移至 Nunc黑色384板(Nunc公司）中，使用EnVision计数仪(泊金埃尔默公司）测定激发波长400nm 和荧光波长505nm的荧光信号值。
[0251]以复孔进行各抗体的试验，算出平均值。计算各抗体的各浓度下的uPA活性率时， 将添加了含有〇. 1 %BSA的PBS来代替抗体的孔的测定值的平均值设定为0%，将添加了含有 0.1%BSA的PBS和PBS来代替抗体和重组人活性型PAI-1的孔的测定值的平均值设定为 100%。对算出的uPA活性率进行分析，通过四参数逻辑曲线回归算出抗体的EC50值。由于 PAI-1抑制uPA活性，因此抗体的人PAI-1抑制活性越高，uPA活性就越高。
[0252]结果，以该评价系统中的uPA的活性作为指标的、完全人型H0T-1的EC50值为 12 ? 7ng/mL，MEDI-579的EC50值为42 ? Ing/mL。表明完全人型H0T-1具有更高的uPA活化能力。 因此表明，该评价系统中，完全人型H0T-1具有更高的PAI-1抑制活性。
[0253] (实施例11:猴血浆中抗体浓度测定）
[0254] 由实施例6的结果表明，完全人型H0T-1对VTN-PAI-1复合物显示出强结合活性，并 且具有极高的选择性结合活性。通常已知，血中的抗体除了直接被代谢以外，还与抗原结合 而以抗原-抗体复合物的形式被代谢（Journal of Pharmaceutical Sciences、2012、 Vol .101、No. 12、p4367-4382)。血浆中的PAI-1 除了 VTN-PAI-1 以外，还以潜在型PAI-1 和 tPA-PAI-1复合物等各种复合物的状态存在(Blood、1990、V〇1.76、p.930-937)，因此，选择 性低的抗PAI-1抗体与各种PAI-1形成抗原-抗体复合物而被代谢。另一方面，完全人型H0T-1选择性地结合VTN-PAI-1，因此，不易以与潜在型PAI-1、PA-PAI-1的复合物的形式被代谢， 因此，认为其能够长期间维持血中的浓度。已知实际的抗体的血中浓度的持续大大依赖于 该抗原-抗体复合物的代谢速度(Bioanalysis、2011、Vol. 3、No. 6、p. 659-675)。根据实施例 8的结果，完全人型H0T-1对VTN-猴PAI-1复合物显示出高选择性的结合活性，因此，测定了 对猴给药抗体时的血浆中抗体浓度。作为比较抗体，使用MED I -579。
[0255] 对食蟹猴静脉给药以PBS稀释的完全人型H0T-1或MEDI-579。处置组如下设定。
[0256] [处置组]
[0257] H0T-1给药组（3只）：
[0258] 给药完全人型H0T-1的组（2.0mg/kg)
[0259] MEDI-579给药组（2只）：
[0260] 给药 MEDI-579 的组（2.0mg/kg)
[0261] 在抗体给药前、以及抗体给药0.25小时、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小 时、96小时、168小时、336小时、504小时后进行采血，得到血浆。关于完全人型H0T-1，在672 小时、936小时、1200小时、1440小时后也追加进行采血，得到血浆。
[0262] 通过电化学发光(ECL)检测对血浆中的各抗体浓度进行测定。
[0263] 完全人型H0T-1的ECL检测如下所示。将玻连蛋白用TBS稀释至100ng/mL，使用 Multi-array 96孔板(Meso Scale Discovery公司、L15XA-1)，每 1 孔添加25yL。将板在4°C 静置一晚，由此使玻连蛋白固相化在板上。通过反向离心除去玻连蛋白固相液，用清洗液 (含有0.05%吐温-20的TBS)清洗3次，以每1孔25yL添加用TBS稀释至100ng/mL的重组活性 型人PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)，在4°C下静置1小时，由此固相化。通过反 向离心除去固相液，用清洗液清洗3次，以每1孔150yL添加封闭剂1 (Thermo SCIENTIFIC公 司、37532)。在室温下静置1小时后，通过反向离心除去封闭剂1，用清洗液清洗3次。将给药 了抗体的猴血浆用含有0.05%吐温-20的封闭剂1溶液稀释至100倍，进一步，使用含有1% 的未给药抗体的猴血浆且含有0.05%吐温-20的封闭剂1溶液（以下称为含有血浆-吐温的 封闭剂1溶液)稀释至标准曲线的范围内，每1孔添加25此。标准曲线制作中，准备添加了使 用含有血浆-吐温的封闭剂1溶液稀释为从100ng/mL至0.0017ng/mL的11个梯度的完全人型 H0T-1的孔。作为对照，准备添加了含有血浆-吐温的封闭剂1溶液来代替抗体的孔。在室温 下孵育1小时后，通过反向离心除去溶液，用清洗液清洗3次。添加使用含有0.05%吐温-20 的封闭剂1溶液稀释至80ng/mL的猴免疫球蛋白吸收抗人IgG轻链生物素(免疫生物研究所、 17249) 25yL。在室温下孵育1小时后，通过反向离心除去溶液，用清洗液清洗3次。添加使用 含有0.05%吐温-20的封闭剂1溶液稀释至20叫/11^的1^0 31]1^0-了46链霉亲和素（1^8〇 Scale Discovery公司、R32AD-l)25yL。在室温下孵育1小时后，通过反向离心除去溶液，用 清洗液清洗3次。添加用超纯水(MilliQ(注册商标）、默克公司）稀释至2倍的含表面活性剂 的MSD读取缓冲液T(4X)(MSD Read Buffer T(4x)with Surfactant)(Meso Scale Discovery公司、R92TC_2)150iiL，利用SECTOR Imager 6000(Meso Scale Discovery公司） 测定其电化学发光。
[0264] 按照完全人型H0T-1的ECL检测的方法，测定MEDI-579的血浆中浓度。其中，玻连蛋 白和重组活性型人PAI-1的浓度以75ng/mL使用。另外，作为使重组活性型PAI-1固相化后的 封闭步骤，进行下述封闭处理来代替封闭剂1处理。以每1孔150yL添加用TBS以5w/v%溶解 的封闭剂2(Meso Scale Discovery公司、R93BA-1)，在室温下静置1小时。除去封闭剂，用清 洗液清洗3次后，以每1孔50yL添加用封闭剂1稀释4倍的封闭剂3(Meso Scale Discovery公 司、R51BB-3)。
[0265] 计算抗体浓度时，制作标准曲线。回归式利用5-参数逻辑模型进行分析。权重设定 为l/y2。由标准曲线算出各采血点的抗体浓度。以三复孔进行各血浆的试验，求出所算出的 浓度的平均值。利用Bi 〇B〇〇k(IDBS公司）按照各受试物质、各受试猴对所得到的抗体浓度进 行分析，将纵轴设定为抗体浓度的对数值、将横轴设定为采血时间，由绘出的图的0层的斜 率算出半衰期。
[0266] 结果，MEDI-579的半衰期为52.6小时，与此相对，完全人型H0T-1的半衰期为255小 时。表明完全人型H0T-1在血中维持更长的时间。
[0267] (实施例12:猴血中活性型PAI-1抑制活性测定）
[0268] 对于肺纤维化等PAI-1参与病态的疾病的预防或治疗，期望在猴的血中长期间且 强力地抑制PAI-1活性。因此，对完全人型H0T-1在猴血中的活性型PAI-1抑制活性进行评 价。作为比较抗体，使用MED I -579。
[0269] 使用从实施例11中给药了完全人型H0T-1或MEDI-579的猴得到的血浆，测定血中 活性型PAI-1的抑制活性。
[0270]将uPA(尿激酶静注用6万单位（注册商标)"；田边三菱制药株式会社）用 PBS稀释至50单位/mL，以每1孔lOOuL添加到Nunc Maxisorp白色96板(Nunc公司）中，将板在 4°C静置一晚，由此使uPA固相化。通过反向离心除去固相液，以每1孔200yL添加封闭剂 (Thermo SCIENTIFIC公司、37532)，在室温下静置1小时。用清洗液(含有0.05%吐温-20的 TBS)进行清洗，以每1孔100yL添加用含有0.1%BSA的PBS稀释至10倍的血浆，在室温下静置 30分钟。此时，作为标准曲线用，使用含有0.1 %BSA的PBS将人活性型PAI-1 (Molecular Innovation公司、PAI-A)稀释为从300ng/mL至0.003ng/mL的7个梯度，每1孔添加lOOuL，与 血浆同时在室温下静置30分钟。另外，作为对照，制作添加了含有0.1%BSA的PBS来代替抗 体的孔。用清洗液清洗3次后，以每1孔1 OOyL添加使用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacala i Tesque公司、03953-95)溶液稀释至10000倍的生物素化（同仁化学研究所、LK03)抗PAI-1抗 体(Progen Biotechnik公司、MA-33H1F7)，使其反应。在此，根据实施例6的结果，作为识别 板上的uPA-PAI-1复合物的抗PAI-1抗体，使用MA-33H1F7。另外，生物素化使用同仁化学研 究所的试剂盒指定的方法进行。在室温下孵育1小时后，用清洗液清洗3次，以每1孔100此添 加使用以PBS稀释至20倍的封闭剂(Nacalai Tesque公司、03953-95)溶液稀释至1000倍的 链霉亲和素-AL(Thermo SCIENTIFIC公司、21324)。在室温下孵育1小时后，用清洗液清洗3 次，以每1孔l〇〇yL添加用含有2mMTris(pH9.8)的0.1 mM氯化镁水溶液稀释5倍的碱性磷酸酶 底物(Chemiluminescent AP; SurModics公司、APU4-0100-01)。在室温静置30分钟后，使用 EnVi s i on计数仪(I自金埃尔默公司）测定信号值。
[0271] 使用标准曲线算出活性型PAI-1浓度。将各抗体的猴血浆中活性型PAI-1抑制作用 的结果示于图1。以复孔对各血浆进行试验，算出平均值。在此基础上，对试验中使用的各组 猴血浆的值进行平均。将抗体给药前的活性型PAI-1浓度设为100%，将标准曲线用活性型 PAI-1浓度Ong/mL设为0%，由各血浆中的活性型PAI-1浓度算出抑制比例，求出与给药前相 比能够将抗体给药后的血浆中活性型PAI-1浓度抑制50 %以上的天数。
[0272] 结果，在给药了完全人型H0T-1的组中为28天，在MEDI-579给药组中为7天。表明与 MEDI-579相比，完全人型H0T-1更长期且强力地抑制血浆中的活性型PAI-1。
[0273] 产业上的可利用性
[0274] 本发明的抗人PAI-1抗体对于活性型人PAI-1参与病态形成的各种疾病的预防或 治疗有用。另外，本发明的多核苷酸、表达载体、进行了转化的宿主细胞和生产抗体的方法 对于生产上述抗人PAI-1抗体有用。
[0275] 序列表自由文本
[0276] 下述序列表的数字标题〈223>中记载了 "Artificial Sequence"的说明。具体而 言，序列表的序列号1和3所表示的碱基序列分别为完全人型H0T-1的重链和轻链的碱基序 列，序列号2和4所表示的氨基酸序列分别为由序列号1和3编码的重链和轻链的氨基酸序 列。
【主权项】
1. 一种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段包含 重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由序列号2的氨基酸序号31~35的氨基酸 序列构成的CDR1、由序列号2的氨基酸序号50~66的氨基酸序列构成的CDR2、和由序列号2 的氨基酸序号99~107的氨基酸序列构成的CDR3,所述轻链可变区包含由序列号4的氨基酸 序号24~34的氨基酸序列构成的CDR1、由序列号4的氨基酸序号50~56的氨基酸序列构成 的⑶R2、和由序列号4的氨基酸序号89~97的氨基酸序列构成的⑶R3。2. 如权利要求1所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗 原结合片段选自下述(1)~(2)中的任一个： (1) 包含由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列号4 的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片 段；以及 (2) 上述（1)的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结 合片段。3. 如权利要求2所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗 原结合片段包含由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列 号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区。4. 如权利要求2所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗 原结合片段为包含由序列号2的氨基酸序号1~118的氨基酸序列构成的重链可变区和由序 列号4的氨基酸序号1~108的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗人PAI-1抗体或其抗原结 合片段经翻译后修饰生成的抗体或其抗原结合片段。5. 如权利要求2或4所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，其中，翻译后修饰为重链 可变区N末端的焦谷氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。6. 如权利要求1~5中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1 抗体或其抗原结合片段包含作为重链恒定区的人Ig γ 1恒定区。7. 如权利要求1~5中任一项所述的抗人ΡΑΙ-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人ΡΑΙ-1 抗体或其抗原结合片段包含作为轻链恒定区的人IgK恒定区。8. 如权利要求1~5中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1 抗体或其抗原结合片段包含作为重链恒定区的人Ig γ 1恒定区，并且包含作为轻链恒定区 的人IgK恒定区。9. 如权利要求3所述的抗人PAI-1抗体，其包含由序列号2所示的氨基酸序列构成的重 链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。10. 如权利要求1~8中任一项所述的抗原结合片段，其为单链可变区片段、Fab、Fab'或 F(ab'）2〇11. 一种抗人PAI-1抗体，其为权利要求9所述的抗人PAI-1抗体经翻译后修饰生成的抗 体。12. 如权利要求11所述的抗人PAI-1抗体，其中，翻译后修饰为重链可变区N末端的焦谷 氨酸化和/或重链C末端的赖氨酸缺失。13. 如权利要求11所述的抗人PAI-1抗体，其包含由序列号2的氨基酸序号1~447的氨 基酸序列构成的重链和由序列号4所示的氨基酸序列构成的轻链。14. 一种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段抑 制权利要求9或13所述的抗人PAI-1抗体与活性型人PAI-1的结合，与同玻连蛋白形成了复 合物的活性型人PAI-1结合，并且，既不与潜在型人PAI-1结合也不与同纤溶酶原激活物形 成了复合物的人PAI-1结合。15. -种抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段，所述抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段与 权利要求9或13所述的抗人PAI -1抗体结合相同的人PAI -1表位。16. -种多核苷酸，其包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的 重链可变区的碱基序列。17. -种多核苷酸，其包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的 轻链可变区的碱基序列。18. -种表达载体，其包含权利要求16和/或17所述的多核苷酸。19. 利用权利要求18所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自由下 述(a)~(d)组成的组： (a) 利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变 区的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列 的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (b) 利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变 区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可 变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (c) 利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变 区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;和 (d) 利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变 区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。20. 利用权利要求18所述的表达载体进行了转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自由下 述(a)~(d)组成的组： (a) 利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷 酸、和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (b) 利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸 的表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化 的宿主细胞； (c) 利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸 的表达载体进行了转化的宿主细胞;和 (d) 利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸 的表达载体进行了转化的宿主细胞。21. -种生产抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的方法，包括对选自由下述(a)~(c)组 成的组中的宿主细胞进行培养而使其表达抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤， (a)利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变 区的碱基序列的多核苷酸、和包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列 的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (b) 利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变 区的碱基序列的多核苷酸的表达载体、和含有包含编码该抗体或其抗原结合片段的轻链可 变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞;以及 (c) 利用含有包含编码权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的重链可变 区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗体 或其抗原结合片段的轻链可变区的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细 胞。22. -种生产抗人PAI-1抗体的方法，包括对选自由下述(a)~（c)组成的组中的宿主细 胞进行培养而使其表达抗人PAI-1抗体的步骤， (a) 利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷 酸、和包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞； (b) 利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸 的表达载体、和含有包含编码该抗体的轻链的碱基序列的多核苷酸的表达载体进行了转化 的宿主细胞；以及 (c) 利用含有包含编码权利要求9所述的抗人PAI-1抗体的重链的碱基序列的多核苷酸 的表达载体进行了转化的宿主细胞、和利用含有包含编码该抗人PAI-1抗体的轻链的碱基 序列的多核苷酸的表达载体进行了转化的宿主细胞。23. 通过权利要求21所述的方法生产的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段。24. 通过权利要求22所述的方法生产的抗人PAI-1抗体。25. -种药物组合物，其包含权利要求1~15、23和24中任一项所述的抗人PAI-1抗体或 其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。26. -种药物组合物，其包含权利要求3所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段、权利 要求4所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的赋形剂。27. -种药物组合物，其包含权利要求9所述的抗人PAI-1抗体、权利要求13所述的抗人 PAI-1抗体和药学上可接受的赋形剂。28. 如权利要求25~27中任一项所述的药物组合物，其为肺纤维化的预防或治疗用药 物组合物。29. -种预防或治疗肺纤维化的方法，其包括以治疗有效量给药权利要求1~15、23和 24中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段的步骤。30. 用于在肺纤维化的预防或治疗中使用的权利要求1~15、23和24中任一项所述的抗 人PAI-1抗体或其抗原结合片段。31. 权利要求1~15、23和24中任一项所述的抗人PAI-1抗体或其抗原结合片段在制造 肺纤维化的预防或治疗用药物组合物中的应用。
【文档编号】A61P11/00GK106029884SQ201580009780
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年2月20日
【发明人】田中祐嗣, 吉野正康
【申请人】安斯泰来制药株式会社