位于大豆第3号染色体上的耐盐性调控基因qNaCl3及其使用方法
【专利摘要】本发明提供大豆耐盐性基因qNaCl3、该基因的cDNA和该基因所编码的蛋白。该基因是调控植物的耐盐胁迫、且编码具有Na+/H+反向转运蛋白活性的蛋白的qNaCl3基因。
【专利说明】
位于大豆第3号染色体上的耐盐性调控基因 qNaC 13及其使用 方法
技术领域
[0001] 本发明涉及在大豆中调控耐盐性的基因及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 大豆是世界上重要的豆科作物之一，作为主要的蛋白和油脂原料，其应用广泛。但 是，大豆的产率比水稻或玉米等稻科作物低，因各种环境胁迫（ス卜レス， StreSS)的影响而 不稳定。据报道，盐害会影响到大豆的发芽和生长以及根粒生成，导致产量减少。目前，世界 上灌溉耕地面积的约1/3受到了土壤盐性化的影响。另外，随着全球变暖，因水不足和不良 灌溉导致盐类聚集地正在扩大。即使在日本，也报道了因2011年3月11日发生的东日本大地 震的影响导致海水流入而引起盐害。作为对策，培育耐盐性大豆品种是有效的手段，尝试着 利用栽培种内的基因突变来改良大豆的耐盐性。目前，有人报道了与大豆耐盐性有关的多 个数量的基因座(QTL)，正在确定可用于大豆育种的与这些QTL有关的DNA标志物(参照非专 利文献1~4)。但是，目前耐盐性QTL的原因基因的鉴定或功能分析还尚未充分进行，尚未形 成可有效用于育种的状况。
[0003] 现有技术文献 非专利文献 非专利文献l:Lee, G. J?等人?，（2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1610-1619.; 非专利文献2:Hamwieh, A?和Xu, D. H. (2008) Breed. Sci. 58: 355-359.; 非专利文献3:Chen, H. T?等人?，（2008) Aust. J. Agr. Res. 59: 1086-1091; 非专利文献4:Hamwieh A等人?，（2011) Euphytica, 179: 451-459。
【发明内容】
[0004] 本发明提供大豆耐盐性基因qNaC13、和该基因所编码的蛋白。而且，本发明还以提 供耐盐性植物的制作等的基因应用技术为课题。通过解决这些课题，不仅可以促进阐明大 豆耐盐性的表达机制，还非常有助于利用所分离的基因确立新的耐盐性品种培育等。
[0005] 本发明人发现了来自大豆的qNaC13基因是大豆耐盐性的原因基因，还发现了通过 使qNaC13基因在盐敏感型的大豆品种中过剩地强烈表达，大豆的耐盐性提高，可以期待开 发耐盐性比现有的耐盐性大豆品种高的耐盐品种。另外，还可以根据所分离的qNaC13基因 的DNA信息开发耐盐性的DNA标志物，并将其用作耐盐性大豆的育种的DNA标志物。而且，通 过利用该基因及其类似基因，不仅在大豆中还在其他豆类作物或谷类作物中制作出耐盐性 有所提高的转化体，可以开发与增产有关的品种。
[0006] 即，本
【发明内容】
如下。
[0007] [1]基因，该基因包含下述(a)~(f)中的任一种DNA; (a) 包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的DNA; (b) 在严格条件下和包含与包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的DNA互补的核苷 酸序列的DNA杂交、并且编码具有Na+/H+反向转运蛋白活性的蛋白的DNA; (c) 包含与SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列具有90%以上的序列同源性的核苷酸序 列、并且编码具有Na+/H+反向转运蛋白活性的蛋白的DNA; (d) 包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的缩聚异构体的DNA; (e) 编码包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白的DNA;以及 (f) 作为包含对SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列有1个或多个氨基酸被取代、缺失和/或 添加了的氨基酸序列的蛋白、并且编码具有Na+/H+反向转运蛋白活性的蛋白的DNA。
[0008] [2] [1]的基因，该基因是调控植物的耐盐胁迫、且编码具有Na+/H+反向转运蛋白 活性的蛋白的qNaC13基因。
[0009] [3]植物转化用载体，该载体含有[1]或[2]的基因。
[0010] [4]转化植物，其是通过[3]的植物转化用载体进行了转化的耐盐胁迫有所提高 的转化植物。
[0011] [5] [4]的转化植物，该转化植物为双子叶植物。
[0012] [6] [4]的转化植物，该转化植物为大豆。
[0013] [7]通过向植物中导入[1]或[2]的基因来提高该植物的耐盐胁迫的方法。
[0014] [8] [7]的提高植物的耐盐胁迫的方法，其中，植物为双子叶植物。
[0015] [9] [7]的提高植物的耐盐胁迫的方法，其中，植物为大豆。
[0016] [10]培育具有耐盐性的植物的方法，该方法包括：以位于qNaC13基因内或其附近 的DNA标志物的存在为指标，筛选具有耐盐性的植物。
[0017] [ 11 ] [ 10]的方法，其中，作为DNA标志物，使用作为SSR标志物的SSR25.8和/或 SSR55.5。
[0018] [12] [11]的方法，其中，使用包含SEQ ID N0: 5的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID N0: 6的核苷酸序列的引物的引物对来检测SSR25.8,使用包含SEQ ID N0: 7的核苷酸 序列的引物和包含SEQ ID N0: 8的核苷酸序列的引物的引物对来检测SSR55.5。
[0019] [13]用于检测qNaC13基因的下述的任一种SSR标志物引物对： (i) 包含SEQ ID N0: 5的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID N0: 6的核苷酸序列的引 物的引物对;以及 (ii) 包含SEQ ID N0: 7的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID N0: 8的核苷酸序列的引 物的引物对。
[0020] [14]培育具有耐盐性的植物的方法，其中，筛选不具有约3.8kb的插入片段的植 物作为具有耐盐性的植物进行培育，所述插入片段包含qNaC13基因的外显子3下游的SEQ ID N0: 9所示核苷酸序列。
[0021] [15]弓丨物对，该引物对用于检测qNaC13基因的外显子3下游的约3.8kb的插入片 段。
[0022] [16] [15]的引物对，该引物对包含:包含SEQ ID N0: 10所示核苷酸序列的引物 和包含SEQ ID N0: 11所示核苷酸序列的引物。
[0023]本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2014-027979号的说明 书和/或附图中记载的内容。
【附图说明】
[0024]图1是显示通过大豆耐盐性的高精度QTL分析在第3号染色体上显示QTL (数量性 状基因座）的位置的物理地图（图1A)的图。显示大豆第3号染色体上的物理位置(Mb)。 [0025]图2是显示使用RT-PCR法分析耐盐性系统NILsl8-T和敏感性系统NILsl8-S中的耐 盐性候选基因qNaC13表达的结果的图。
[0026] 图3A是显示通过RACE法由耐盐性系统NILsl8_T合成的qNaC13基因的全长cDNA的 核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)的图。
[0027]图3B是显示由qNaC13基因编码的蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)的图。
[0028]图4A-1是显示耐盐性系统NILsl8_T中的耐盐性基因qNaC13的基因组核苷酸序列 (SEQ ID N0: 3)的图（持续至图4A-2)。
[0029]图4A-2是显示耐盐性系统NILsl8_T中的耐盐性基因qNaC13的基因组核苷酸序列 (SEQ ID N0: 3)的图（图4A-1的持续）。
[0030]图4B-1是显示敏感性系统NILS18-S中的耐盐性基因qNaC13的基因组核苷酸序列 (SEQ ID N0: 4)的图（持续至图4B-2)。
[0031]图4B-2是显示敏感性系统NILsl8_S中的耐盐性基因qNaC13的基因组核苷酸序列 (SEQ ID N0: 4)的图（图4B-1的持续）。
[0032]图4B-3是显示敏感性系统NILsl8_S中的耐盐性基因qNaC13的基因组核苷酸序列 (SEQ ID N0: 4)的图（图4B-2的持续）。
[0033]图5是显示大豆耐盐性系统NILsl8-T (图5A)和敏感性系统NILsl8-S (图5B)的 qNaC13基因结构的图。
[0034]图6是显示来自世界各国的126个大豆品种、系统(包括野生大豆）中的大豆耐盐性 基因 qNaC13的实时定量PCR表达量与耐盐性的关系的图。耐盐性评价通过包含100mM NaCl 的水耕培养液来进行。耐盐指数分为1 (耐盐性弱）~5 (耐盐性强)这5个等级。
[0035]图7是显示在Na/H+反向转运蛋白缺损的酵母突变体(B31)中导入有qNaC13基因的 转化体(qNaCl 3 1 -5株)在含有NaCl的培养基中的生长的图。图中，Nhal显示酵母的Na+/H+反 向转运蛋白基因。
[0036] 图8是显示导入qNaC13基因的转化大豆系统（54-1-1、34-2-7、20-1-4、16-1_8)在 盐胁迫处理（100mM NaCl、24小时）后的靶基因表达分析的结果的图。图8A显示通过RT-PCR 进行的表达分析的结果，图8B是通过实时PCR以相对表达水平显示表达量的分析结果。 "Kariyutaka"显示野生型品种，"GFP"显示Kariyutaka的35S : GFP基因转化大豆系统， "NILsl8-T"和"NILsl8-S"显示大豆耐盐性拟同质系统的耐盐性系统和敏感性系统。
[0037] 图9是显示导入耐盐性基因9恥(：13的转化大豆系统（54-1-1、34-2-7、20-1-4、16- 1 -8)在100mM NaCl处理14天后表现出叶身的黄化程度的叶的SPAD值的图。显示与野生 型品种Kariyutaka存在显著差异(P〈0.01，t_检验）。"Kariyutaka"显示野生型，"GFP"显示 Kariyutaka的35S:GFP基因转化大豆系统，"NILsl8-T"和"NILsl8-S"显示大豆耐盐性拟同 质系统的耐盐性系统和敏感性系统。
[0038]图10是显示表现出高耐盐性的T2世代的35S:qNaC13转化大豆系统20-1-4的生长 状况的图。图10的右半部分显示导入了靶基因的35S:qNaC13转化大豆系统个体的生长，图 10的左半部分显示不具有靶基因的个体(无效的）的生长。
[0039] 图11是显示由DNA标志物筛选培育的耐盐性基因qNaCl 3的拟同质系统中的耐盐性 系统(NILs25-T)和敏感性系统(NILs25-S)在盐害田地中的生育状况(2009)的图。图11的右 半部分的大豆是耐盐性系统(NILs25-T)，左半部分的大豆是敏感性系统(NILs25-S)。
[0040] 图12是显示由DNA标志物筛选培育的耐盐性拟同质系统的耐盐性系统(NILS18-T、 NILs25-T、NILs72-T)和敏感性系统（NILsl8-S、NILs25-S、NILs72-S)在盐害田地中的地上 部分总干燥物重的比较的图。纵向柱形图显示标准偏差(反复3次）。另外，"Tachiyutaka"和 "C01"是对照品种。"**"显示与敏感性系统存在显著差异(P〈0.01)。
【具体实施方式】
[0041] 以下，对本发明进行详细说明。
[0042] 1.本发明的基因 本发明涉及大豆(Glycine max)的位于第3染色体上的调控耐盐胁迫的基因qNaCl3。 qNaC13基因产物起到Na+/H+反向转运蛋白的作用。Na+/H+反向转运蛋白是经由生物体膜进 行Na+和H+的相向输送的输送体，其参与细胞内的Na+水平、pH、细胞容量等的调节，在植物中 其参与将盐胁迫时流入细胞内的Na+向细胞外排放或者与液胞隔离。
[0043] 盐胁迫是指植物暴露在盐中，耐盐胁迫是指即使在暴露于盐中的状态下也能生长 的能力，也称作耐盐性。不具有耐盐胁迫的盐敏感性植物通过暴露于盐中而显示出叶子发 黄或枯死等盐害症状。
[0044] qNaC13基因可通过定位克隆(map-based cloning，基于作图的克隆）由夹入耐盐 性大豆品种的第3染色体的BARCS0YSSR_03_1338和BARCS0YSSR_03_1341中的约58.8kb的基 因组区进行鉴定、分离。
[0045]在具有耐盐性的大豆系统中qNaC13基因有5个外显子，但在失去了耐盐性而呈盐 敏感性的大豆系统中，通过在外显子3的下游部分插入约3.8kb的片段而丧失基因的功能， qNaC13基因突变成由3个外显子组成。
[0046] qNaC13基因并不是在暴露于盐中时被诱导表达，而是经常维持表达。qNaC13基因 的表达越强，则耐盐胁迫越强。
[0047] qNaC13基因的cDNA核苷酸序列见SEQ ID NO: 1和图3A，qNaC13基因所编码的蛋白 的氨基酸序列见SEQ ID N0: 2和图3B。
[0048] 而且，qNaC13基因的基因组核苷酸序列见SEQ ID NO: 3以及图4A-1和图4A-2。图 4A-2的序列是持续图4A-1的序列。
[0049]在本发明中，上述SEQ ID NO: 1或3的核苷酸序列所表示的DNA只要具有各自的 DNA所具有的活性或各自的DNA编码的蛋白所具有的活性、即耐盐胁迫或Na+/H+反向转运蛋 白活性即可，核苷酸序列中可以具有突变。例如，本发明的DNA还包含下述DNA:在严格条件 下和具有与SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交的DNA;在利用 SEQ ID NO: 1 或3所不核苷酸序列和BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (美国国立生物学信息中心的基本 局部比对检索工具））等(例如利用缺省即初期设定的参数)进行计算时具有至少85%以上、 优选90%以上、进一步优选95%以上、特别优选97%以上的序列同源性的DNA;或编码包含对由 上述DNA编码的蛋白的氨基酸序列有1个或多个（1~10个、优选1~5个、进一步优选1个或2 个)氨基酸被取代、缺失和/或添加了的氨基酸序列的蛋白的DNA。这里，"严格条件"例如是 "1 X SSC、0 ? 1%的SDS、37°C"程度的条件，更严格的条件是"0 ? 5 X SSC、0 ? 1%的SDS、42°C"程度 的条件，进一步严格的条件是"〇. 2 X SSC、0.1%的SDS、65°C"程度的条件。这样，杂交的条件 变得越严格，就越能够期待分离与探针序列具有高度同源性的DNA。但是，上述的SSC、SDS和 温度的条件组合仅是例示，通过将DNA的浓度、DNA的长度、杂交的反应时间等适当组合，可 以实现必要的严格性。而且，还包含在SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列中含有基于遗传暗 号的缩聚的序列(缩聚序列）的DNA。
[0050] 向本发明的qNaC13基因中导入突变时，可以通过Kunkel法或Gapped duplex法等 公知的方法或以其为基础的方法，例如使用采用了位点定向诱变法(位点特异性诱变法)的 突变导入用试剂盒(例如Mutant-K (TAKARA公司制造)或Mutant-G (TAKARA公司制造)等）、 或者使用TAKARA公司的LA PCR体外诱变系列试剂盒来进行。
[0051] 根据本发明的大豆qNaC13基因的序列信息，可以在其他种类的植物中探索序列同 源性高且具有相同功能的同源基因。本发明还包含作为大豆qNaC13基因的同源基因的其他 植物种的基因。例如，上述的由核苷酸中具有突变的核苷酸序列组成的qNaC13基因中包含 与大豆qNaC13基因的核苷酸序列同源性高的其他种的同源基因。
[0052] 还包含本发明的qNaC13基因的cDNA。
[0053]另外，还包含上述基因所编码的、具有Na+/H+反向转运蛋白活性的蛋白。
[0054] 2.导入了本发明的qNaC13基因的转化植物的制作 通过利用基因工程学方法将本发明的qNaC13基因DNA导入植物宿主中，可以制作出具 有耐盐胁迫的转化植物。作为将本发明的qNaC13基因导入植物宿主中的方法，可以列举:土 壤杆菌感染法等间接导入法;或电穿孔法、基因枪法、聚乙二醇法、脂质体法、微量注射法等 直接导入法等。本领域技术人员可以适当选择适当的导入方法。
[0055]例如，在采用土壤杆菌感染法时，如下操作，可以制作出导入了本发明的qNaC13基 因的转化植物。
[0056]最初，制作转化用重组载体，然后通过土壤杆菌进行转化。
[0057]转化用重组载体可如下获得：用适当的限制酶剪切包含本发明的qNaC13基因的 DNA，之后根据需要连接适当的接头，再插入植物细胞用的克隆载体中即得。作为克隆用载 体，可以使用 口8￡21131*^48121131*^481211348110148112146厶48246厶114816等双元 (13；[1^50载体系质粒，或口1^23如041'01'410'1200等中间载体系质粒。
[0058] 使用双元载体系质粒时，在上述双元载体的边界序列(LB、RB)间插入qNaC13基因， 在大肠杆菌中扩增该重组载体。然后，通过电穿孔法等将所扩增的重组载体导入根癌土壤 杆菌t腫e/aciaoce) ￡说105、〇58、1^^4404、￡撤101、〇58(]11^;1^等中，再将 导入了 qNaC13基因的土壤杆菌用于植物的转化即可。此外，还可以通过三者接合法 (Nucleic Acids Research, 12:8711 (1984))调制包含本发明的qNaC13基因的用于转化 的土壤杆菌。即，将保有包含本发明的qNaC13基因的质粒的大肠杆菌或保有辅助质粒(例如 PRK2013)的大肠杆菌和土壤杆菌混合培养，之后在包含利福平和卡那霉素的培养基上进行 培养，从而可以获得转化用的接合体土壤杆菌。
[0059]为了使作为外来基因的本发明的qNaC13基因在植物体内表达，优选在qNaC13基因 的前后连接植物用的启动子、增强子、终止子等。作为在本发明中可利用的启动子，例如可 以列举：来自花椰菜花叶病毒（CaMV)的35S启动子、玉米的泛素启动子、胭脂氨酸合成酶 (NOS)基因启动子、章鱼碱(OCT)合成酶基因启动子等。作为增强子，可以使用病毒起源的翻 译增强子或植物起源的翻译增强子。作为病毒起源的翻译增强子，例如可以列举:烟草花叶 病毒、苜蓿花叶病毒RNA4、雀麦花叶病毒RNA3、马铃薯病毒X、烟草蚀纹病毒等的序列。另外， 作为植物起源的翻译增强子，可以列举:来自大豆的jS-1，3-葡聚糖酶(Glu)的序列、来自烟 草的铁氧化还原蛋白结合性亚单位(PsaDb)的序列等。作为终止子，例如可以使用来自花椰 菜花叶病毒或来自胭脂氨酸合成酶基因的终止子等。但是，启动子、增强子、终止子并不限 于上述的这些，只要是已知在植物体内起作用的启动子、增强子、终止子均可使用。连接这 些启动子、增强子、终止子，使得想要表达的本发明的qNaC13基因能够起作用。
[0060] 而且，为了有效选择目标转化植物，优选使用选择标志物基因。作为选择标志物， 可以列举卡那霉素耐性基因（NPTII )、对植物赋予抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶 (htp)基因和赋予双丙氨磷(bialaphos)抗性的草铵膦乙酰转移酶(bar)基因等。本发明的 基因和选择标志物基因可以一起插入单一载体中，也可以使用将这两种基因分别插入单个 的载体中而获得的两种重组DNA。
[0061] 导入本发明的qNaC13基因的宿主植物可以是植物培养细胞、栽培植物的植物体整 体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、根茎、种子等）、或植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组 织、木质部、维管束等)的任一种。
[0062] 对植物种没有限定，可以列举不具有耐盐胁迫的盐敏感性大豆、大豆以外的豆类 植物或谷类植物。对大豆以外的豆类植物没有限定，可以列举:赤豆、菜豆、鹰嘴豆、花生、豌 豆、蚕豆等。对谷类植物没有限定，可以列举:水稻、玉米、小麦、大麦、黑麦、燕麦、薏苡、野燕 麦、荞麦、稗子、小米、黄米等。另外，双子叶植物、单子叶植物均可使用。通过向盐敏感性的 大豆中导入qNaC13基因使其过度表达，使盐敏感性大豆对盐胁迫具有耐性，可以开发耐盐 性比现有的耐盐性大豆品种强的品种。另外，通过向大豆以外的豆类植物或谷类植物中导 入大豆的qNaC13基因或作为大豆qNaC13基因的同源基因的其他种植物的qNaC13基因，可获 得耐盐胁迫有所提高的转化体。
[0063]当以植物培养细胞、植物体、植物器官或植物组织作为宿主时，通过土壤杆菌感染 法、基因枪法或聚乙二醇法等将载体导入所采集的植物切片中，本发明的基因可以转化植 物宿主。或者，还可以通过电穿孔法导入原生质体中制作出转化植物。
[0064]向植物细胞中导入qNaC13基因时，可以通过公知的组织培养法由所得的转化细胞 再生转化体。例如，可以依照"植物細胞培養^二二(植物细胞培养手册)"山田康之编 著，講談社1984等文献，由植物细胞再生植物体。
[0065]关于在导入了本发明的qNaC13基因的转化植物及其下一代中插入有qNaC13基因， 可如下进行确认:按照常规方法从这些细胞和组织中提取DNA，采用公知的PCR法或DNA印迹 分析检测所导入的qNaC13基因，由此即可确认。
[0066]本发明的转化植物体除了包含进行转化而再分化了的当代即"T1世代"以外，还包 含由该植物的自体繁殖或异体繁殖的种子获得的后代等、以T1世代为起点的所有通过栽培 或育种的方法能够获得的世代或个体。
[0067] 3.转化植物对盐胁迫的耐性评价 关于导入了本发明的qNaC13基因的转化植物对盐胁迫的耐性，例如可以如下进行评 价:将转化植物种在装有水耕培养液或包含蛭石、珍珠岩等的培养土的容器中，研究在施加 盐胁迫使其生长时的存活或生长状况，由此进行评价。例如，可以使用包含100~200mM、优 选100~150mM NaCl的水耕培养液，在20~35°C下每隔1小时~30天、优选10~20天、进一步 优选14天进行盐处理，之后研究存活率或生长状况，由此进行评价。此时，可以研究耐盐指 数(STR)或叶绿素含量(SPAD值）。耐盐指数可以通过目视观察植物体来进行，分为5个等级 (1~5)。另外，叶绿素含量(SPAD值)可以通过SPAD值计测器来测定。叶绿素含量是显示叶子 的黄化程度的值。另外，当为大豆等豆类植物或谷类植物等形成谷粒(子実）的植物时，使植 物生长形成谷粒，根据谷粒的形成情况进行评价。
[0068]导入了本发明的qNaC13基因的植物的耐盐胁迫有所提高。
[0069] 即，例如使用包含100~150mM NaCl的水耕培养液，将导入了本发明的qNaC13基因 的植物和不具有耐盐胁迫的盐敏感性系统在20~35°C下培养2~3周时，相对于盐敏感性系 统而言，导入了本发明的qNaC13基因的植物存活率提高，耐盐指数提高，可以维持叶的叶绿 素含量。而且，相对于盐敏感性系统而言，导入了本发明的qNaC13基因的植物，谷粒的形成 变好，田地的每单位面积的产量提高。
[0070] 4.耐盐性植物筛选和用于筛选的标志物 本发明还包含：用于筛选耐盐性植物的标志物、和使用了该标志物的耐盐性植物的筛 选或育种方法。
[0071] 在对选自至少包含大豆的植物组的植物进行的耐盐性检测、具有与参与耐盐性的 Na+/H+反向转运蛋白基因（qNaC13基因）类似的功能的新基因的探索、大豆育种上的DNA标志 物的筛选等中可以使用这些标志物。
[0072]具有本发明的qNaC13基因且具有耐盐性的植物可以通过将具有qNaC13基因的植 物和其他植物杂交、再筛选具有qNaC13基因的杂种来进行育种。作为具体的筛选育种方法， 例如可以列举下述方法:使任意的植物系统X与具有qNaC13基因的植物系统Y杂交得到杂 种，将所得的杂种和植物系统X回交，筛选具有qNaC13基因的杂种，再进行回交。优选回交和 筛选反复进行数次、优选2~10次。通过这种方法，可以获得具有qNaC13基因的拟同质基因 系统。此时，具有qNaCl 3基因的植物系统可以利用标志物进行筛选。
[0073]用于耐盐性植物的筛选或育种的标志物是包含作为本发明qNaC13基因存在位置 的标记的DNA序列的DNA标志物，只要使用存在于qNaC13基因内、或者与qNaC13基因相邻、或 者存在于其附近的DNA标志物即可。例如，可以使用微卫星标志物作为这样的DNA标志物，作 为微卫星标志物，可以列举SSR (单纯反复序列)标志物等。以这些标志物的存在为指标进 行筛选的植物个体具有qNaC13基因，具有耐盐性这种性状。作为位于qNaC13基因附近的DNA 标志物，例如可以列举:作为大豆第3染色体上的SSR标志物的Satt339、Satt237、Satt255、 Sat_091 和Sat_304 (公知大豆标志物、参照Song等人?（2004) Theor. Appl. Genet., 109: 122-128)等。这些标志物例如可以使用标志物特异性引物对来进行检测。
[0074]另外，qNaCl 3基因存在于夹入 BARCS0YSSR_03_1338 和BARCS0YSSR_03_1341 中的约 58.8kb的基因组区（图 1)。因此，BARCS0YSSR_03_1338和BARCS0YSSR_03_1341也可用作耐盐 性基因的筛选标志物。
[0075] 另外，还可以利用新开发的SSR标志物SSR25.8和SSR55.5，只要使用以下的SSR标 志物引物组（引物对)即可。
[0076] (1)在qNaC13基因的上游5.2kb处开发的微卫星（单纯反复序列、SSR)标志物 (SSR25.8)的引物组：5'-TTAAGCACCAGCAAATAGTTC-3'（SEQ ID N0: 5)和5'_ CGACCAACTATTCCCATATAC-3' （SEQ ID NO: 6); (2)在qNaC13基因的下游13kb处开发的微卫星(单纯反复序列、SSR)标志物(SSR55.5) 的引 物组：5 '-TTGGATAGTAATGTTGTCTTCG-3 ' ( SEQ ID NO: 7)和5'- AAGAAAAGTGATGTGACTTGA-3， (SEQ ID NO: 8)〇
[0077]使用上述引物组，对根据大豆的耐盐性和敏感性提取的DNA进行PCR使其扩增，确 认明确的多态性。通过检测这2个或1个SSR标志物，可以识别是否存在标志物耐盐性基因 qNaC13基因。
[0078]通过筛选DNA标志物来进行的耐盐性大豆系统的育种例如可以按照Hamwieh等人. (2011) Euphytica, 179: 451-459的记载来进行。
[0079]而且，在盐敏感性系统中，qNaC13基因在外显子3的下游具有约3.8kb的插入片段， 失去了基因的功能（图5)。约3.8kb的插入片段的核苷酸序列见SEQ ID N0: 9。因此，以是否 存在该插入片段为指标，可以检测大豆系统是否具有耐盐性，以不具有该插入片段为指标， 可以筛选培育具有qNaC13基因的耐盐性大豆。是否存在插入片段可以使用作为插入片段的 一部分片段的寡核苷酸或其互补序列、或者包含在严格条件下能够与这些序列杂交的序列 的寡核苷酸来检测。这里，严格条件如上所述。
[0080] 该寡核苷酸是探针或引物，可以根据SEQ ID N0: 9的约3.8kb的插入序列的序列 信息来设计。具体而言，根据上述插入片段两侧的核苷酸序列设计引物，根据PCR产物的长 度检测是否存在3.8kb的插入片段。
[0081]探针包含qNaC13基因的插入片段的核苷酸序列或与该核苷酸序列互补的核苷酸 序列、或者包含由在严格条件下能够与这些序列杂交的序列构成的核苷酸片段(优选DNA片 段），核苷酸数为5~50、优选10~30、进一步优选为10~25。通过使用该探针与由作为被检 体的植物获得的核酸样品杂交，可以检测是否存在插入片段。
[0082] 引物是可以检测存在qNaC13基因的插入片段的引物，例如是可以扩增具有包含一 部分qNaC13基因的序列的区的序列。引物是正向引物和反向引物的引物对。引物包含 qNaC13基因的插入片段的核苷酸序列或与该核苷酸序列互补的核苷酸序列、或者由在严格 条件下能够与这些序列杂交的序列构成的核苷酸片段(优选DNA片段），核苷酸数为5~50、 优选10~30、进一步优选为15~25。使用引物通过PCR可以检测是否存在插入片段。
[0083] 作为这样的引物，例如有5'-CTCGCAAGTGTTCTCACGAA-3'（SEQ ID N0: 10)和5'-TTAGCTCCACCAACCCTTTG-3'（SEQ ID NO: 11)的引物组。
[0084] 本发明包含用于检测qNaC13基因的插入片段的探针和引物(优选至少一对引物 组）。另外，还包含固定有探针的DNA芯片。而且，还包含用于检测qNaC13基因的插入片段的 包含探针、DNA芯片、引物等的试剂盒。
[0085] 通过以下的实施例来具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。 [0086] 实施例1通过定位克隆(map-based cloning，基于作图的克隆）鉴定位于大豆第 3号染色体上的调控耐盐胁迫的基因qNaC13 图1是通过大豆耐盐性的高精度数量基因座(QTL)分析在第3号染色体上显示QTL的位 置的物理地图。大豆耐盐性的QTL存在于图1的58.8kb的QTL区，通过定位克隆从该58.8kb的 区域中选定与大豆耐盐性有关的候选基因。
[0087] 迄今为止，对将大豆品种FT-Abayara (耐盐性)和C01 (敏感性)交配而得到的F7 分离集团（ri=97)进行数量性状基因座(QTL)分析，明确了在大豆第3染色体上耐盐性QTL位 于SSR标志物Satt255和Sat_091 的附近（Hamwieh等人?（2011) Euphytica, 179: 451-459)。然后，使用大规模的分离集团，通过定位克隆进行了耐盐性QTL区的详细连锁分析。具 体而言，在耐盐性QTL位于第3染色体的区上SSR标志物Satt255和Sat_091显示出异源性的 Fs世代的个体自体繁殖，从1，053个体的分离集团中筛选了 SSR标志物Satt255与Sat_091间 的染色体重组个体。其结果，得到了在Satt255与Sat_091之间产生的14个体的重组个体。使 这些重组个体再一次自体繁殖，获得了 14个重组固定系统。然后，利用Satt255和Sat_091间 的15个新的SSR标志物，将所得的14重组固定系统整列化，根据各系统的耐盐性评价结果， 明确了耐盐性 QTL 存在于夹入 BARCS0YSSR_03_1338 和 BARCS0YSSR_03_1341 中的约58.8kb的 基因组区（图1)。对该候选基因组区的核苷酸序列进行基因预测以及类似性研究时，明确了 在该区存在7个推测基因（Nature (2010) 463: 178-183)。特别是，在推测基因 Glyma03g32890和Glyma03g32900中发现了具有与钠/氢交换蛋白家族类似的结构的区，认 为是耐盐性QTL的原因基因。接着，进行基因表达的分析，其结果，Glyma03g32900在大豆耐 盐性系统和敏感性系统间显示出明确的差别，选定该基因作为大豆耐盐性的候选基因，命 名为 qNaC13。
[0088] 实施例2 qNaC13基因的分析 关于大豆耐盐性系统NILsl8-T和敏感性系统NILsl8-S，提取总RNA，通过RT-PCR进行耐 盐性候选基因qNaC13基因的表达分析。
[0089] 大豆耐盐性系统NILsl8-T和敏感性系统NILsl8-S分别是通过DNA标志物筛选培育 的（Hamwieh等人?（2011) Euphytica, 179: 451-459) dNILsIS-T和NILsl8-S在昼温25±2 °C、夜温20±2°C、日长14小时的条件下通过水耕法（1/2浓度Hoagland和Arnon营养液、pH= 6.0-6.5)进行了栽培。关于盐处理，从大豆的第一片叶展开期(VI期)起用100mM NaCl进行 了盐处理。关于提取总RNA，利用经100mM NaCl进行了 1天和3天的盐处理的大豆和对照(OmM NaCl)的大豆，使用Trizol (Invitrogen公司）从大豆根部进行了提取。
[0090] RT-PCR (逆转录-PCR)使用PrimeScriptTM RT-PCR试剂盒（TAKARA BIO INC)来进 行。使用的引物是5'-CCACCAACATGTCACGACTC-3' （SEQ ID N0: 12)和5'- ACCCCACGATTGACTAGCAC-3'（SEQ ID NO: 13)。以作为持家基因的肌动蛋白基因作为对照， 使用的引 物是 5 '-GAGCTATGAATTGCCTGATGG-3 ' ( SEQ ID NO: 14)和5'- CGTTTCATGAATTCCAGTAGC-3'（SEQ ID NO: 15) JCR程序（PTC-100? programmable Thermal controller MJ-Research Inc)是在95°C/30秒、56°C/30秒、72°C/30秒下反应25 个循环后通过72°C/7分钟的伸长反应来进行的。反应结束后，通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳 确认了扩增片段。
[0091] 结果见图2。图2的上半部分的画面显示qNaC13基因的表达，下半部分的画面显示 作为持家基因的肌动蛋白基因的表达。如图2所示，在耐盐性系统中，与敏感性系统相比， qNaC13基因显示出高度表达的趋势。另外，关于耐性系统中的qNaC13基因的表达量，在 100mM NaCl盐处理和对照（100mM NaCl)之间没有确认到明确的差异，暗示了耐性系统的 qNaC13基因不是盐胁迫的诱导性基因，而经常维持高度表达。
[0092]利用RACE (cDNA末端快速扩增)法从作为耐盐性系统的NILsl8-T系统中分离鉴定 qNaC13基因，确定了cDNA的核苷酸序列和qNaC13基因所编码的蛋白的氨基酸序。3' Full RACE使用3'-Full RACE Core Set (TAKARA BIO INC)来进行，5' Full RACE-PCR使用5'-Full RACE Core Set (TAKARA BIO INC)来进行。cDNA序列见图3A和图3B以及SEQ ID NO: 1和2。核苷酸序列的长度为2670bp (SEQ ID NO: 1)，氨基酸序列的长度为811个氨基酸 (SEQ ID NO: 2)〇
[0093]另外，确定了耐盐性系统NILsl8_T和敏感性系统中的qNaC13基因区的基因组核苷 酸序列。图4A和图4B中显示的是各自的核苷酸序列（SEQ ID N0: 3和SEQ ID N0: 4)。需要 说明的是，图4A-1和图4A-2以及图4B-1~图4B-3的序列分别是一系列的连续序列，图4A-2 的序列是图4A-1的序列的持续，而图4B-3的序列是图4B-2的序列的持续、图4B-2的序列是 图4B-1的序列的持续。
[0094]根据上述的核苷酸序列信息分析了qNaC13基因的结构。图5显示了耐盐性系统 NILsl8_T和敏感性系统中的qNaC13基因的结构图。如图5所示，耐盐性系统NILsl8_T中的 qNaC13基因有5个外显子，相对于此，在敏感性系统NILsl8_S中保有3个外显子。明确了其原 因在于:在敏感性系统NILsl8-S中通过在外显子3的下游部分插入约3.8kb的片段而产生了 聚腺苷酸化现象，失去了基因的功能。
[0095]实施例3 126个大豆品种、系统中的大豆耐盐性基因qNaC13基因的表达分析 获取了来自世界各国的包括野生品种在内的126个大豆品种、系统。126个大豆品种、系 统从美国USDA National Plant Germplasm System (http://www.ars-grin.gov/npgs/)、 日本的农业生物资源GeneBank (http: //www. gene ? affrc ? go ? jp/index_j ? php)和国立生 物资源项目（National Bio Resource Project) (http:// www.legumebase.brc.miyazaki_u.ac. jp/)获取。
[0096]对这126个品种、系统的大豆进行了耐盐性评价和qNaC13的表达量测定。
[0097] 供试的126个大豆品种、系统在昼温25 ± 2°C、夜温20 ± 2°C、日长14小时的条件下 通过水耕法（1/2浓度Hoagland和Arnon营养液、pH = 6.0-6.5)进行了栽培。关于盐处理，从 大豆的第一片叶展开期（VI期）起使用100mM NaCl进行了盐处理。关于提取总RNA，利用经 100mM NaCl进行了 1天的盐处理的大豆，使用Trizol (Invitrogen公司）从大豆的根部进行 提取，进行大豆耐性基因qNaC13基因的实时定量PCR，测定了表达量。在盐处理约3周后，研 究了各系统的耐盐指数和叶绿素含量（SPAD值）。通过目视将耐盐指数(STR)分为5个等级 (1-5)。耐盐指数1表示耐盐性最弱，耐盐指数5表示耐盐性最强。叶绿素含量通过以SPAD值 的形式表示的计测器SPAD-502 (Konica Minolta社)来测定。
[0098]耐盐性评价的结果，供试的126个大豆品种、系统的耐盐性显示出大的变异。图6显 示了 126个品种、系统中的qNaC13通过实时定量PCR测定的表达量与耐盐指数(STR)的关系。 qNaC 13的实时定量PCR表达量以qNaC13基因与肌动蛋白基因的表达量之比表示。
[0099]如图6所示，大豆的qNaCl3的表达量越大，耐盐指数越高，明确了qNaCl3基因的表 达量调控大豆的耐盐性。
[0100]实施例4导入了qNaC13基因的酵母转化体的制作和评价 向缺损了Na+/H+反向转运蛋白基因的酵母突变体(B31)中导入qNaCl3基因，制作了转 化体(qNaC13 1-5株）。
[0101] 用含有0~l，〇〇〇mM NaCl、10mM KC1的pH3.5的培养基培养了该转化体。另外，用含 有500mM NaCl、10mM KC1的pH3.5~6.5的培养基培养了该转化体。另外，使用经不含qNaC13 的载体转化了的酵母突变体作为对照。而且，还对经作为酵母的Na+/H+反向转运蛋白基因的 Nha 1基因转化了的转化体进行了培养。
[0102] 结果见图7。图7A显示因NaCl浓度引起的生长差异，图7B显示因pH引起的生长差 异。qNaC13的1~5显示5个系统的转化体各自的结果。Vector显示用载体转化了的对照的结 果，Nhal显示经作为酵母的Na+/H+反向转运蛋白基因的Nhal基因转化了的转化体的结果。图 7是根据培养皿上的生长状况显示各培养的结果。图中，看起来白的部分显示已生长的酵母 集落的集合，白的部分越大，表示生长越好。
[0103] 如图7所示，即使培养基的NaCl浓度为750mM，qNaC13基因转化体也可以生长。关于 其生长情况，在培养基的pH低时与对照(Vector)的差别明显，但在接近中性时没有确认到 差别。其结果显示:qNaC13基因起到Na+/H+反向转运蛋白的作用。
[0104] 在实施例4中，转化体按照http: //genetic ? eng? yamaguchi-u.ac ? jp/KoboHome/ KoboKobo.html和Kitagawa, T., Hoshida, H. and Akada, R. : Infect. Immun., 75 (3)，1393 (2007).中记载的方法进行。
[0105] 具体而言，按照下述步骤进行。
[0106] 1 ?制作一步缓冲液(One-Step Buffer)。
[0107] 60%PEG 667 //L 4M LiAc 50#L 1M DTT 100//L D.ff. 183//L 2.在1.5mL的微型管中分别注入50 的一步缓冲液。
[0108] 3.取20#L左右的在YH)板培养基中进行了o/n培养的酵母B31系统加入到微型管 的缓冲液中，充分混合，之后通过离心除去上清，分别加入50 -步缓冲液、5 载体RNA、 5 质粒DNA (pYES2、qNaC13-pYES2、Nhal-pYES2等）充分混合。
[0109] 4.在42°C下培养1.5小时。
[0110] 5.加入100//L的D.W.进行混合，接种在SD板培养基(-URA的选择培养基)上。
[0111] 6.通过30°C、2-3天的培养出现转化集落。
[0112] 另外，转化体的培养通过以下的方法来进行。
[0113] 稀释用SD (-URA)液体培养基进行了o/n培养的转化酵母使0D 600达到1.0,在各 种盐浓度、或pH条件的SD (-URA)板培养基中分别滴加2.5 # L，在30°C下培养，1周后拍摄照 片。
[0114] 实施例5导入qNaC13基因的转化大豆的盐胁迫处理 1.对qNaC13基因表达的影响 制作了导入qNaC13基因的转化大豆T2世代4个系统(54-1-1、34-2-7、20-1-4、16-1-8)。
[0115] 利用下述方法制作了导入qNaC13基因的转化大豆T2世代系统。
[0116] 使用国内大豆品种"力!；二夕力"作为转化体材料。即使在大豆品种中该品种的培 养品种也特别优异(Plant Biotechnology 24: 533-536)，因此将其用于供试材料。另外， 关于转化的方法，使用现有(Plant Biotechnology 27: 217-220)的方法进行转化。首先， 将种子在保湿了 1周左右的密闭容器中调湿(提高吸水含量）。将该种子浸泡一夜，使其吸 水。之后，除去种皮，用刀剪断，准备了外植片。特别是，在可以诱导不定芽的胚轴基部，使用 刀制造小的伤口，促进土壤杆菌的感染。作为基因表达载体，构建了将耐盐性基因qNaC13与 35S启动子(花椰菜花叶病毒35S启动子)连接、还包含bar (草铵膦耐性)基因作为筛选标志 物的表达质粒载体。将该载体导入土壤杆菌EHA105株中。用土壤杆菌EHA105株感染外植片， 所述土壤杆菌EHA105株保有使qNaC13基因恒定地过剩表达的双元载体。在5天的共存培养 后，清洗土壤杆菌，用含有6mg/L草铵膦的黄麻诱导培养基培养了 2周X 2次。之后，用含有相 同浓度的草铵膦的黄麻伸长培养基培养2周X4次，在此期间将充分伸长了的黄麻移植到生 根培养基中。生根后，移植到培养土中，培育约3个月后收获了种子。播种这些种子，在幼植 物体的叶上涂抹稀释至1，〇〇〇倍的除草剂"パス夕，BASTA"，筛选了保有导入基因的个体。使 用所筛选的个体及其后代作为各分析对象的材料。
[0117] 对所得的导入qNaC13基因的转化大豆系统(54-1-1、34-2-7、20-1_4、16-1-8)进行 盐胁迫处理（l〇〇mM NaCl、24小时），之后从大豆的根中提取总RNA，通过RT-PCR进行qNaC13 基因的表达分析，再通过实时PCR分析了qNaC13基因的表达量。此时，对于作为野生型品种 的Kariyutaka、经Kariyutaka的35S:GFP基因转化的大豆系统、以及大豆耐盐性拟同质系统 的耐性系统即NI Ls 18-T和敏感性系统即NI Ls 18-S也进行了分析，作为对照。
[0118] 结果见图8。图8中，"Kariyutaka"表示野生型品种，"GFP"表示Kariyutaka的35S: GFP基因转化大豆系统，"NILsl8-T"和"NILsl8-S"表示大豆耐盐性拟同质系统的耐性系统 和敏感性系统。图8A显示RT-PCR的表达分析结果，图8B是通过实时PCR以相对表达水平显示 表达量的分析结果。如图8A所示，在导入qNaC13基因的转化大豆系统和作为耐性系统的 NILs 18-T系统中，确认到了qNaCl3基因的表达。另外，如图8B所示，实时PCR的分析结果，转 化20-1-4系统的平均表达量为耐性系统NILsl8-T的4.72倍。
[0119] 该结果表明：通过使用以使目标基因过剩表达的方式构建的该载体，与直接使用 以自然变异的方式存在的遗传资源相比，可以有意地使目标基因更强地表达。而且，通过加 强基因的表达，可以期待进一步增强对盐胁迫的耐性。
[0120] 2.对转化大豆系统的耐盐性的影响 关于转化大豆系统，利用与实施例3相同的方法评价耐盐性，还测定了 SPAD。
[0121] 图9显示：导入耐盐基因 qNaC13的转化大豆系统(54-1-1、34-2-7、20-1-4、16-1_8) 在100mM NaCl处理14天后表现出叶身的黄化程度的叶的SPAD值。图中，#显示与野生型品 种Kariyutaka存在显著差异（P〈0.01，t_检验）。另外，"Kariyutaka"显示野生型品种， "GFP"显示Kariyutaka的35S (花椰菜花叶病毒35S启动子）：GFP基因转化大豆系统， "NI Ls 18-T"和"NI Ls 18-S"显示大豆耐盐性拟同质系统的耐性系统和敏感性系统。
[0122] 图10显示14天后的生长状态。图10的右半部分显示导入了靶基因的q35S:qNaC13 转化大豆系统个体的生长，图10的左半部分显示不具有靶基因的个体(无效的）的生长。如 图10所示，在导入了靶基因的q35S:qNaC13转化大豆系统个体中确认到了良好的生长。
[0123] 实施例6耐盐性基因qNaC13的拟同质系统在盐害田地(圃場)中的栽培 对于迄今为止本发明人培育的大豆耐盐性基因拟同质基因系统（Near isogenic 1 ines，NILs)，通过含有NaCl的培养液的水耕法进行苗期的耐盐性评价，确认了耐性基因 效果(Hamwieh等人?（2011) Euphytica, 179: 451-459)。但是，关于这些系统在其他生长 期(开花期、成熟期）的耐盐性尚不明确，另外，关于在实际的盐胁迫田地条件下对产量的影 响也不明确。本研究中，在2009-2010年这两年间在盐胁迫田地栽培了 3组大豆的耐盐性拟 同质基因系统011^18、见1^25、见1^72)，研究了耐盐性基因的效果。
[0124] 评价了 3组大豆耐盐性拟同质基因系统的各自的耐盐性系统和敏感性系统共计6 个系统01118^1118-1'川1125-5川1125-1'川1172-5川1172-1')和盐敏感性对照品种 (Tachiyutaka)。田地试验区的设计按照随机区组设计法反复进行了3次。栽培密度是株间 为0.2m、行距为0.8!11。2009年6月1日进行了播种。盐处理则是在7月7日通过盐水灌溉进行了 盐胁迫。灌溉盐水的浓度为海水浓度的约1/4 (120mM NaCl)。2010年6月4日进行播种，7月 27日进行了盐处理。收割后，对于每10个系统研究了地上部分干燥物和粒重等性状。
[0125] 通过盐水处理，所有的盐敏感性系统均显示出叶子发黄和枯死等严重的盐害症 状。在评价的3组耐盐性拟同质基因系统中，具有耐盐性对立基因的系统(NIL18-T、NIL25-T、NIL72-T)的地上部分干燥物重和谷粒重均显示出高于不具有耐盐性对立基因的系统 (NIL18-S、NIL25-S、NIL72-S)的值。耐盐性系统的谷粒重以两年平均值计为敏感性系统的 谷粒重的4.2倍，在盐害田地中可以确认到耐盐性基因的效果。
[0126] 图11显示通过DNA标志物筛选培育的耐盐性基因qNaCl 3的拟同质系统中的耐性系 统(NILs25-T)和敏感性系统(NIL25-S)在盐害田地中的生长状况。
[0127] 图12显示通过DNA标志物筛选培育的耐盐性拟同质系统中的耐盐性系统011^18_ T、NILs25-T、NILs72-T)和敏感系统(NILsl8-S、NILs25-S、NILs72-S)在盐害田地中的谷粒 重的比较结果。结果显示了在不同年份进行了 2次试验的结果(分别见图12A和图12B)。纵向 柱形图显示标准偏差（反复3次），**显示与敏感性系统存在显著差异（P〈0.01)。 Tachiyutaka和C01是对照品种。
[0128] 实施例7利用标志物制作耐盐性大豆系统 1. SSR标志物的利用 为了检测qNaC13基因，制作了下述SSR标志物的引物组。
[0129] (1)在qNaC13基因的上游5.2kb处开发的微卫星（单纯反复序列、SSR)标志物 (SSR25.8)的引物组：5'-TTAAGCACCAGCAAATAGTTC-3'（SEQ ID N0: 5)和5'_ CGACCAACTATTCCCATATAC-3' （SEQ ID NO: 6) (2)在qNaC13基因的下游13kb处开发的微卫星(单纯反复序列、SSR)标志物(SSR55.5) 的引 物组：5 '-TTGGATAGTAATGTTGTCTTCG-3 ' ( SEQ ID NO: 7)和5'- AAGAAAAGTGATGTGACTTGA-3， (SEQ ID NO: 8)〇
[0130] 使用这2个SSR标志物，通过对根据大豆的耐盐性和敏感性提取的DNA进行PCR而使 其扩增，确认了明确的多态性。通过使用上述引物组检测这两个SSR标志物中的1个或2个， 可以识别是否存在标志物耐盐性基因qNaCl 3基因。
[0131] 2.检测约3.8kb的插入片段的标志物的利用 根据本发明中获得的耐盐性和敏感性系统的qNaC13基因的核苷酸序列，在盐敏感性系 统中，qNaC13基因在外显子3的下游具有约3.8kb的插入片段，丧失了基因的功能（图5)。为 了检测是否存在该突变，设计引物组5'-CTCGCAAGTGTTCTCACGAA-3'（SEQ ID N0: 10)和 5'-ITAGCTCCACCAACCCTTTG-3'（SEQ ID NO: 11)，进行了是否存在3.81cb的插入片段的检 测。使用该引物在3组耐盐性拟同质系统以及亲本品种FT-Abayara (耐盐性品种）和CO 1 (敏感性品种）中进行验证时，所有的耐盐性系统均不具有该约3.8kb的插入片段。相对于 此，显示出所有的敏感性系统均具有该插入片段。因此，利用这次分离的qNaC13基因的核苷 酸序列信息，可以制作出大豆耐盐性的筛选标志物。引物组5 ' -CTCGCAAGTGTTCTCACGAA-3 ' (SEQ ID NO: 10)和5'-TTAGCTCCACCAACCCTTTG-3'（SEQ ID NO: 11)是用于识别是否存在 qNaC13基因的标志物之一例，通过使用标志物，可以制作出强耐盐性大豆系统。
[0132] 产业实用性 本发明的来自大豆的qNaC13基因调控植物的耐盐胁迫(耐盐性）。通过向不具有耐盐胁 迫的大豆品种中导入qNaC13基因，可获得耐盐胁迫有所提高的大豆品种，即使在盐浓度高 的环境下也可以获得高产量的大豆。另外，通过向大豆以外的植物中导入qNaC13基因，可获 得耐盐胁迫有所提高的植物。而且，根据qNaC13基因的DNA信息开发与耐盐胁迫有关的DNA 标志物，通过DNA标志物的筛选育种，可以培育耐盐胁迫有所提高的大豆。
[0133] 序列表自由文本 SEQ ID N0: 5~8、10~15 引物 本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书中。
【主权项】
1. 基因，该基因包含下述(a)~(f)中的任一种DNA: (a) 包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的DNA; (b) 在严格条件下和包含与包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的DNA互补的核苷 酸序列的DNA杂交、并且编码具有Na+/H+反向转运蛋白活性的蛋白的DNA; (c) 包含与SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列具有90%以上的序列同源性的核苷酸序 列、并且编码具有Na+/H+反向转运蛋白活性的蛋白的DNA; (d) 包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的缩聚异构体的DNA; (e) 编码包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白的DNA;以及 (f) 作为包含对SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列有1个或多个氨基酸被取代、缺失和/或 添加了的氨基酸序列的蛋白、并且编码具有Na+/H+反向转运蛋白活性的蛋白的DNA。2. 权利要求1所述的基因，该基因是调控植物的耐盐胁迫、且编码具有Na+/H+反向转运 蛋白活性的蛋白的qNaCl 3基因。3. 植物转化用载体，该载体含有权利要求1或2所述的基因。4. 转化植物，其是通过权利要求3所述的植物转化用载体进行了转化的耐盐胁迫有所 提高的转化植物。5. 权利要求4所述的转化植物，该转化植物为双子叶植物。6. 权利要求4所述的转化植物，该转化植物为大豆。7. 通过向植物中导入权利要求1或2所述的基因来提高该植物的耐盐胁迫的方法。8. 权利要求7所述的提高植物的耐盐胁迫的方法，其中，植物为双子叶植物。9. 权利要求7所述的提高植物的耐盐胁迫的方法，其中，植物为大豆。10. 培育具有耐盐性的植物的方法，该方法包括：以位于qNaC13基因内或其附近的DNA 标志物的存在为指标，筛选具有耐盐性的植物。11. 权利要求10所述的方法，其中，作为DNA标志物，使用作为SSR标志物的SSR25.8和/ 或SSR55.5。12. 权利要求11所述的方法，其中，使用包含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列的引物和包 含SEQ ID NO: 6的核苷酸序列的引物的引物对来检测SSR25.8,使用包含SEQ ID NO: 7的 核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的引物的引物对来检测SSR55.5。13. 用于检测qNaC13基因的下述的任一种SSR标志物引物对： (i) 包含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 6的核苷酸序列的引 物的引物对;以及 (ii) 包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的引 物的引物对。14. 培育具有耐盐性的植物的方法，其中，筛选不具有约3.8kb的插入片段的植物作为 具有耐盐性的植物进行培育，所述插入片段包含qNaC13基因的外显子3下游的SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列。15. 引物对，该引物对用于检测qNaC13基因的外显子3下游的约3.8kb的插入片段。16. 权利要求15所述的引物对，该引物对包含:包含SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的 引物和包含SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的引物。
【文档编号】A01H5/00GK106029883SQ201580009062
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年2月16日
【发明人】许东河, D.D.阮, 陈华涛, 庄野真理子, 山田哲也, 佐藤雅志
【申请人】国立研究开发法人国际农林水产业研究中心