一种基于等温指数扩增法快速检测miRNA的方法
【专利摘要】本专利公开了一种基于等温指数扩增法快速检测miRNA的方法，涉及荧光探针检测技术领域。通过microRNA与模板DNA特异性结合，在聚合酶和内切酶的作用下实现目标物以指数的形式放大，较传统方法有更高的灵敏度。本方法包括探针预变性?等温指数扩增反应?荧光检测三个步骤，反应时间短，能够较好的区分单核苷酸的差异性，此外，等温条件和简单的荧光测量，将大大促进一个简单，快速，低成本的检测系统的发展，有助于我们对microRNA进行定量分析以及生物体的生理病理机制的理解，并最终为疾病的诊断和治疗提供新的思路和理论基础。
【专利说明】
一种基于等温指数扩増法快速检测m i RNA的方法
技术领域
[0001]本发明涉及荧光探针检测技术领域，更具体地说是一种综合了等温指数扩增法和利用两种发夹探针实现对miRNA的快速超灵敏的荧光检测方法。【背景技术】
[0002]MicroRNA目前是一个十分活跃的研究领域，它对于深入探讨生命现象的本质、解释细胞行为和疾病发生机制、以及疾病诊断、基因治疗药物的开发都具有重大意义。同时细胞内microRNA的表达水平与人类重大疾病如癌症等密切相关。为此microRNA的检测成为当前研究的热点和前沿，先后出现了一些microRNA检测方法，但目前microRNA的检测仍不能满足实际需要，追求更高的检测限、更灵敏的检测方法一直是microRNA研究的目标。因此通过对microRNA高灵敏的检测，能够实现疾病早期预警的目的。
[0003]MicroRNA被视为一种新型的生物标志物和各种疾病的潜在治疗靶标。在生物医学领域上，microRNA有着十分重要的调节作用，microRNA的异常表达与癌症的发展和各种疾病相关。microRNA具有调节基因表达活性的功能，广泛存在于真核生物体内。microRNA的广泛存在与进化上的保守性，暗示它在生命活动中具有必不可少的调节作用，他们参与动植物生长发育、细胞分化、细胞增殖与调亡、激素分泌、肿瘤形成等各种过程。microRNA无论在数量上还是功能上，可能都远远超过目前的发现，对其进行深入的研究，将有助于我们对生物体的各种生理病理机制的理解，并最终为疾病的诊断和治疗提供新的思路和理论基础。
[0004]为了解决microRNA在低浓度下也能进行检测的问题，microRNA识别和信号放大策略变的尤为重要。然而，目前检测方法，如单引物等温扩增技术、滚环扩增反应、恒温指数放大反应虽然具有较高的灵敏度和特异性，但是都比较耗时。因此发展一种既能特异性识别， 又能够检测到低浓度microRNA的方法具有重要意义。microRNA与模板DNA特异性结合，在聚合酶和内切酶的作用下实现microRNA以指数的形式放大，灵敏度高且操作简单、省时省力。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是构建一种发夹探针特异性识别microRNA以及能实现快速灵敏检测microRNA的方法。
[0006]—种基于等温指数扩增的利用发夹探针灵敏、快速检测microRNA的方法，其特征是包括以下步骤:(1)探针预变性首先，FAM标记的发卡探针1和DABCYL标记的发卡探针2以及模板DNA，在95 °C下分别孵育5min;将这三种溶液在室温条件下放置30min;(2)等温指数扩增反应以下步骤进行的总反应混合液体积为80 yL，不同浓度的microRNA与120 nM的模板 DNA部分序列杂交，加入0.25 mM的dNTPs，在浓度为65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作用下，使单链模板DNA进行复制形成双链DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一条短的DNA引物链，最后加入20.0 nM的发卡探针1和发卡探针2混合于缓冲溶液中，混合溶液在55 °C反应1 h;缓冲溶液的成分为Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer;(3)荧光检测荧光检测的实验参数如下:激发波长为496 nm，发射波长范围为500-650 nm。
[0007]本发明的有益效果(1)通过microRNA与模板DNA杂交，在聚合酶、内切酶作用下能够实现目标物的指数扩增；(2)利用发卡探针1和发卡探针2特异性识别microRNA，实现荧光信号快速放大；(3)本发明所述方法操作简单、反应快速。【附图说明】
[0008]图1为本文所述方法的实验原理图。【具体实施方式】
[0009]为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施。
[0010]实施例1一种基于等温指数扩增的利用发夹探针灵敏、快速检测microRNA的方法，其特征是包括以下步骤:(1)探针预变性首先，FAM标记的发卡探针1和DABCYL标记的发卡探针2以及模板DNA，在95 °C下分别孵育5 min;将这三种溶液在室温条件下放置30 min;(2)等温指数扩增反应以下步骤进行的总反应混合液体积为80 yL，不同浓度的microRNA与120 nM的模板 DNA部分序列杂交，加入0.25 mM的dNTPs，在浓度为65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作用下，使单链模板DNA进行复制形成双链DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一条短的DNA引物链，最后加入20.0 nM的发卡探针1和发卡探针2混合于缓冲溶液中，混合溶液在55 °C反应1 h;缓冲溶液的成分为Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer;(3)荧光检测荧光检测的实验参数如下:激发波长为496 nm，发射波长范围为500-650 nm。
[0011]实施例2检测步骤同例1，不同之处是:步骤2中反应时间为0.5 h。
【主权项】
1.一种基于等温指数扩增法快速检测miRNA的方法，其特征是包括以下步骤:(1)探针预变性首先，FAM标记的发卡探针1和DABCYL标记的发卡探针2以及模板DNA，在95 °C下分别孵 育5 min;将这三种溶液在室温条件下放置30 min;(2)等温指数扩增反应以下步骤进行的总反应混合液体积为80 yL，不同浓度的microRNA与120 nM的模板 DNA部分序列杂交，加入0.25 mM的dNTPs，在浓度为65.0 U/mL的Vent DNA polymerase的作 用下，使单链模板DNA进行复制形成双链DNA，再加入666.7 U/mL的Nt.BstNBI，剪切下一条 短的DNA引物链，最后加入20.0 nM的发卡探针1和发卡探针2混合于缓冲溶液中，混合溶液 在55 °C反应1 h;缓冲溶液的成分为Nt.BstNBI buffer和ThermoPol buffer;(3)荧光检测荧光检测的实验参数如下:激发波长为496 nm，发射波长范围为500-650 nm。2.如权利要求1所述的一种基于等温指数扩增的利用发夹探针灵敏、快速检测 microRNA的方法，其特征是步骤(2)中microRNA的浓度为0.375 nM，其核苷酸序列为说明书 核苷酸序列表中所述序列。3.如权利要求1所述的一种基于等温指数扩增的利用发夹探针灵敏、快速检测 microRNA的方法，其特征是步骤(2)中的反应温度为55°C，反应时间为1 h。
【文档编号】C12Q1/68GK106011274SQ201610551469
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】刘海云, 田甜, 颜梅, 于京华, 葛慎光, 张彦, 马超
【申请人】济南大学