用于检测微量组织中pdgfra基因突变的引物组合及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测微量组织中PDGFRA基因突变的引物组合，其包括预扩增引物组、用于检测12号外显子突变的引物组、用于检测14号外显子突变的引物组、用于检测18号外显子突变的引物组；该方法旨在将微量的DNA通过预扩增得到较高浓度的DNA模板，结合直接测序法检测样本中PDGFRA基因的突变情况；将该引物组合应用于制备检测PDGFRA基因突变的检测试剂中，可检测样本的DNA浓度低至100pg，且可以同时检测PDGFRA基因第12、14和18号外显子的所有突变，本发明提供的检测方法灵敏度高，特异性强，成本低，适用于临床肿瘤患者PDGFRA基因突变的检测，具有很好的临床应用价值。
【专利说明】
用于检测微量组织中PDGFRA基因突变的引物组合及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种用于微量组织中户饼并基因突变检 测的引物组合及其在肿瘤用药选择和疾病诊断相关方面的应用。
【背景技术】
[0002] PDGFR是分子量为180kD的单链膜糖蛋白，细胞外配体结合区含5个免疫球蛋白样 结构域，具保守的半脫氨酸残基，单一跨膜片段;胞内的酪氨酸激酶区断裂处，为亲水氨基 酸插入序列。受体分子由α，0两种亚基组成，成熟后的PDGFRW二聚体稳态形式(αα,αβ,ββ) 与配体PDGF (platelet-derived growth factor,PDGF)相应异构体（PDGF-AA，AB，BB)结 合。结直肠癌组织中PDGFR α和PDGFR β均有表达分布，PDGFR α分布于结直肠正常组织、息 肉组织及肿瘤组织上;PDGFR β表达于肿瘤细胞、肿瘤间质细胞和微血管细胞(包括微血管 周细胞）上(Appi址-Kubi Κ, et 曰1 , 2016; Abdel-Rahman 0, 2015)。
[0003] 户饼并基因突变常见于GIST、胶质母细胞瘤、恶性外周神经銷等肿瘤，其中GIST中 户饼并亂基因突变率在5~10%左右，突变主要发生于户饼并亂基因的近膜端区域(外显子12)和 激酶区（外显子14和外显子18)，突变频率分别为0.8%和3.9%，其中W外显子18突变为主 (Vega F, et al, 2〇15)。户0份淵基因突变后则通过活化AKT、MAPK及STAT蛋白中STAT1和 STAT3发挥作用。也有研究发现活化的A-Raf激酶能调节化CG1经PDCFR依赖途径的信号转 导，也能调节PI3K经PDGFR非依赖的信号转导(化rooqi AA，et al, 2015)。
[0004] 伊马替尼是一种酪氨酸蛋白酶抑制剂，能阻断酪氨酸蛋白激酶KIT受体功能，从而 抑制肿瘤的形成。研究表明，基因外显子12和外显子18大部分基因位点突变后使用 伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制剂治疗时GIST患者可从中获益。但如外显子18基因 位点发生D842V、RD841-842KI或D1842-843IM突变使用伊马替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑 制剂治疗时GIST患者不能从中获益。因此，肿瘤病人在用药之前进行巧?份化^基因的突变检 测，将有利于运些患者选择最好的治疗方式。
[0005] 目前针对巧?佛突变的检测方法有很多，如直接测序法，该法对样本要求较高，检 测范围有限。多态性分析法(R化P)，是将PCR与限制性酶切相结合的一种方法，此实验操作 繁琐，检测周期长，成本高昂，存在第一轮酶切不完全导致的假阳性。Taqman水解探针法，使 用扩增阻滞突变系统(ARMS)与巧光探针结合来检测突变，针对该方法设计的引物，使得突 变型得到扩增，野生型无法扩增，从而增强了突变信号，便于检测。但是ARMS技术应用最后 一个碱基不匹配并不能完全阻滞野生型DNA的扩增，存在假阳性的风险，且只能针对特异性 位点检测。此外，如高效液相色谱、毛细血管电泳等，需要特殊的仪器设备，且操作复杂，不 利于在临床上进行大范围的推广。核酸序列扩增法(NASBA)、自序序列复制法(3SR)和链置 换复制法(SDA)虽均为等溫扩增法，但是它们对目的序列的扩增特异性不强。
[0006] 尽管如此，巧?份化^突变的检测方法仍W肿瘤组织标本检测为金标准，但是临床上 常常由于组织样本获取不足量，使其检测具有一定的局限性。因此临床上亟需一种高效准 确全面地检测微量组织中巧Κ/况^基因突变的产品及方法，W便于为肿瘤个性化治疗服务。
[0007] 为此，本发明利用恒溫扩增与直接测序相结合的方法，建立了一套针对微量组织 样本中基因所有突变类型检测的技术流程，该检测方法灵敏度高，特异性强，成本 低，有利于临床使用和推广。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种具有高特异性和灵敏度的检测微量组织样本中 您佛基因突变的引物组合，W组织DNA为检测对象，结合恒溫预扩增技术和普通PCR技术， 通过直接测序法确定肿瘤样本中有无巧基因突变，可对巧?佛基因的突变进行准确的 检测。
[0009] 本发明提供的引物组合能检测出巧粉况^基因发生在第12、14和18号外显子的所有 突变。
[0010] 本发明提供的用于检测巧粉况^基因突变的引物组合包括如沈Q ID NO: 1-沈Q ID NO: 18所示的预扩增引物组、如沈Q ID NO: 19-沈Q ID NO:20所示的用于检测12号外显子 突变的引物组、如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO: 22所示的用于检测14号外显子突变的引物 组，如沈Q ID N0:23-沈Q ID N0:24所示的用于检测18号外显子突变的引物组。
[0011] 本发明的另一目的是将上述引物组合应用在制备检测户饼并基因突变的检测试 剂中。
[0012] 本发明的另一目的是将上述引物组合应用于制备用于检测巧?饼基因突变的检 测试剂盒中，所述试剂盒组分还包含下列常规组分中的一种或几种:聚合酶、引物组合、PCR 反应缓冲液、dNTP、BSA、去离子水。
[0013] 本发明用于检测/??巧基因突变的引物组合的检测使用方法，具体步骤如下： (1)引物稀释 将primerl-primelS分别稀释后混匀制得Primer Mix(表1)，其中primerl-primerlG引 物的终浓度为0.05-0. ΙμΜ，primerU-primer 18引物的终浓度为 1-3μΜ;primer 19-p;rimer24 引物(表1)稀释至5-10μΜ。
[0014] (2)预扩增 在扩增管中加入化L的10X反应缓冲液、2.5化的Primer Mix、lOO-lOOOpg微量DNA模板 (本发明采用的DNA模板来源于结肠癌病人组织，并按照《分子克隆实验指南》中所述常规方 法提取组织DNA)、用去离子水补足至8.如レ混匀，98°C预变性5-lOmin，然后置于冰上10- 20min;再加入 0.化 L dNTP (lOmM each)、0.化 L 100XBSAW 及 0.扣 L pM29 DNA 聚合酶， 30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。
[0015] (3)使用PCR纯化试剂盒纯化上述预扩增产物。
[0016] (4)巧?佛基因突变检测 针对户饼并基因的12号、14号和18号外显子突变，分别采用如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示的引物组检测12号外显子突变;如SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:22所示的引物组 检测14号外显子突变，如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示的引物组检测18号外显子突 变。
[0017] 配置PCR反应总体系为25化:其中Pfu Mix混合液12.5化、所述正向引物（5-10叫1) 的体积〇.5-lyL、反向引物（5-10μΜ)的体积0.5-化L、预扩增产物1-化L、用水补足至25化。 PCR反应条件为:①94°C，5min预变性;②94°C，30s变性;③55°C，30s退火;④72°C，35s延伸； 循环②至④35次;⑤72 °C，5min;测序检测。
[001引本发明的检测优势在于：霞本发明采用多引物组合、利用恒溫扩增及普通PCR相 结合的方法，解决了组织样本中初始DNA含量低的，无法进行户饼并基因突变检测的局限 性。感本发明中使用的试剂价格低廉，可大批量的处理样本。潑本发明方法扩增效率高，如 lOOpg的DNA经扩增后可得到1000ng/μレ可同时检测多位点的突变情况。逆本发明方法DNA 扩增后DNA忠实性好。总之，使用本发明方法可实现对微量组织样本中的户饼并基因的突变 情况进行高效、准确的检测，其对于临床肿瘤早期筛查，指导临床用药，W及监测肿瘤的预 后具有很好的实际应用价值。
[0019] 表1:引物1-24的核巧酸序列
【附图说明】
[0020] 图1是本发明针对lOOOpg的DNA模板扩增结果;其中A图为预扩增结果(3次重复）;B 图为/??并基因12、14和18号外显子扩增结果。
[0021] 图2是本发明针对5(K)pg的DNA模板扩增结果;其中A图为预扩增结果(3次重复）;B 图为/??并基因12、14和18号外显子扩增结果。
[0022] 图3是本发明针对l(K)pg的DNA模板扩增结果。A图为预扩增结果(3次重复）;B图为 /??并基因12、14和18号外显子扩增结果。
[0023] 图4是本发明针对lOOOpg的DNA模板中WGFW基因12、14和18号外显子测序结果 图。
[0024] 图5是本发明针对50化邑的0臟模板中巧?佛7^基因12、14和18号外显子测序结果图。
[0025] 图6是本发明针对10化g的DNA模板中巧?佛基因12、14和18号外显子测序结果图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围，该领域的技术人员可W根据上述本
【发明内容】
对本发明做 出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特异表明，所用试剂均为分析纯，所有试 剂均可从商业渠道获得，百分比均为质量百分比。文中未注明具体条件的实验方法，通常按 照《分子克隆实验指南》中所述常规条件，或试剂制造厂商所建议的条件实施。除非另行定 义，文中所使用的所有专业和科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
[0027] 实施例1: lOOOpg的DNA模板中巧?佛基因突变检测 1、实验材料 pM29 DNA聚合酶aOXreaction buffer，dNTP (lOnM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-primelS (即Primer Mix)，2XP化 Mix，p;rime;rl9-p;rimer24，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京巧限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。 [002引 2、实验步骤及结果 2.1预扩增 (1)引物稀释 将primerl-primelS分别稀释后混匀形成Primer Mix(表1)，其中primerl-primerlG引 物的终浓麼为0.1 μΜ，Dr imer 17-Dr imer 18引物的终浓麼为2μΜ。配晉化下体系：
(2) 将上述试剂混匀后，98°C预变性lOmin，然后迅速置于冰上20min;(3) 再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测 (图ΙΑ)。结果显示使用地i29DNA聚合酶对lOOOpg的DM模板扩增效果良好。
[0029] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500化的平衡液化，12，000巧m (~13，400 X g) 离屯、1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中； (2 )估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除石蜡 油或矿物油）； (3) 将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min, 12,000巧m(~13,400Xg)离屯、30-60S，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中； (4) 向吸附柱CB1中加入6(Κ)化漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12, 000巧m (~13,400Xg)离屯、30-60S，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中； (5) 重复操作步骤(4); (6) 12，000巧m(~13，400 X g)离屯、2 min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室溫放置数 分钟，彻底地惊干，W防止残留的漂洗液影响下一步的实验； (7) 取出吸附柱CB1，放入一个干净的离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-5化L洗 脱缓冲液邸，室溫放置2 min。12，000巧m(~13，400Xg)离屯、2 min，收集DNA溶液。
[0030] 2.3巧?佛基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增W佛7?基因的第12、14和18号外显子；
其中针对12号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对14号外显 子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO: 22所示；18号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 23-沈Q ID NO :24所示。
[0031] (2)反应条件：①94Γ，5min预变性;②94Γ，30s变性;③55Γ，30s退火;④72Γ， 35s延伸；循环②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图IB)，结果显示第二轮PCR对巧?佛亂基因的第12、 14和18号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序 检测。测序结果如图4所示，巧Κ/况^基因第12，14和18外显子均未检测到突变。
[0032] 实施例2:50化g的DNA模板中巧?佛基因突变检测 1、实验材料 pM29 DNA聚合酶aOXreaction buffer，dNTP (lOnM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-primelS (即Primer Mix)，2XP化 Mix，p;rime;rl9-p;rimer24，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京巧限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。
[0033] 2、实验步骤 2.1预扩增 (ο引物稀释。将primerl-primeis分别稀释后混匀形成Primer Mix(表1 )，其中 primerl-primerie引物的终浓度为0.化1，口1'；[11161'17-口1'；[11161'18引物的终浓度为241。配置如 下体系：
(2)将上述试剂混匀后，98°C预变性lOmin，然后迅速置于冰上20min。 [0034] (3)再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测 (图2A)。结果显示使用地i29DNA聚合酶对5(K)pg的DNA模板扩增效果良好。
[0035] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500化的平衡液化，12,000巧m (~13,400Xg) 离屯、1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0036] (2 )估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除 石蜡油或矿物油）。
[0037] (3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400Xg)离屯、30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CBl放入收 集管中。
[003引（4)向吸附柱CB1中加入600化漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇）， 12,000巧m (~13,400Xg)离屯、30-60 sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管 中。
[0039] 巧)重复操作步骤4。
[0040] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)离屯、2 min,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室溫放 置数分钟，彻底地惊干，W防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
[0041 ] (7)取出吸附柱CB1，放入一个干净的离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加 20-50 化洗脱缓冲液邸，室溫放置2 min。12，000巧m(~13，400Xg)离屯、2 min，收集DNA溶液。
[0042] 2.3 /??巧基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增W佛7?基因的第12、14和18号外显子。
[0043] 其中针对12号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对14号外显 子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO: 22所示；18号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 23-沈Q ID NO :24所示。
[0044] (2)反应条件：①94°C，5min预变性;②94°C，30s变性;③55°C，30s退火;④72°C， 35s延伸；循环②至④35次;⑤72 °C，5min; (3 )PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图2B)，结果显示第二轮PCR对巧?佛亂基因的第12、 14和18号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序 检测。测序结果如图5所示，巧Κ/况^基因第12，14和18外显子均未检测到突变。
[0045] 实施例3: lOOpg的DNA模板中巧?佛基因突变检测 1、实验材料 pM29 DNA聚合酶aOXreaction buffer，dNTP (lOnM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去离子水，primerl-primelS (即Primer Mix)，2XP化 Mix，p;rime;rl9-p;rimer24，PCR 仪，超薄产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京巧限公司DP203)，1%的琼脂糖凝胶，电泳仪。
[0046] 2、实验步骤 2.1预扩增 (1)引物稀释。将primerl-primelS分别稀释后混匀形成Primer Mix(表1)，其中 口1'；[11161'1-口1'；[11161'16引物的终浓度为0.化1，口1'；[11161'17-口1'；[11161'18引物的终浓度为241。
[0047] 配置如下体系：
(2)将上述试剂混匀后，98°C预变性lOmin，然后迅速置于冰上20mii [004引（3)再加入如下体系：
将上述混合物混匀后，30-35°C扩增过夜，65°C加热10-20min使酶失活。铺1%的胶检测 (图3A)。结果显示使用地i29DNA聚合酶对l(K)pg的DNA模板扩增效果良好。
[0049] 2.2 PCR产物纯化 (1)柱平衡步骤：向吸附柱CB1中加入500化的平衡液化，12,000巧m (~13,400Xg) 离屯、1 min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0050] (2 )估计PCR反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀(无需去除 石蜡油或矿物油）。
[0051] (3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400Xg)离屯、30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CBl放入收 集管中。
[0化2] (4)向吸附柱CB1中加入600 yL漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇），12,000巧m (~13,400Xg)离屯、30-60 sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入 收集管中。
[0化3] 巧)重复操作步骤4。
[0054] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)离屯、2 min,尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室溫放 置数分钟，彻底地惊干，W防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
[0055] (7)取出吸附柱CB1，放入一个干净的离屯、管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 μL洗脱缓冲液邸，室溫放置2 min。12，000巧m(~13，400Xg)离屯、2 min，收集DNA溶液。 [0化6] 2.3巧?佛基因突变检测 (1)配置如下PCR反应体系，分别扩增您佛7?基因的第12、14和18号外显子。
[0化7]
其中针对12号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;针对14号外显 子突变的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO: 22所示；18号外显子突变的引物如SEQ ID NO: 23-沈Q ID NO :24所示。
[005引（2)反应条件：①94Γ，5min预变性;②94Γ，30s变性;③55Γ，30s退火;④72Γ， 35s延伸；循环②至④35次;⑤72 °C，5min; (3 )PCR反应结束后，铺1%的胶检测（图3B)，结果显示第二轮PCR对巧?佛亂基因的第12、 14和18号外显子均出现特异性扩增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序 检测;测序结果如图6所示，巧Κ/况^基因第12，14和18外显子均未检测到突变。
[0059] W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 用于检测微量组织中基因突变的引物组合，其特征在于，包括如SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 18所示的预扩增引物组、如SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO: 20所示的用于检测 12号外显子突变的引物组、如SEQ ID NO: 21- SEQ ID NO: 22所示的用于检测14号外显子突 变的引物组，如SEQ ID N0:23- SEQ ID N0:24所示的用于检测18号外显子突变的引物组。2. 权利要求1所述的引物组合在制备检测基因突变的检测试剂中的应用。3. 权利要求1所述的引物组合在制备检测基因突变的检测试剂盒中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK106011253SQ201610417813
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】唐文如, 李珊珊, 罗瑛, 盛苗苗, 王芳, 赵月光, 张继虹, 贾舒婷, 吴晓明, 刘静, 周若宇, 旦菊花
【申请人】昆明理工大学