一种融合基因室内质控品、利记博彩app及其固定液的配方的利记博彩app
【专利摘要】本发明提供了一种采用固定的细胞悬液制作常见融合基因室内质控品的方法及其固定液的配方。本发明可用于室内质量控制的融合基因检测包括：BCR?ABL P210(b2a2型和b3a2型)、BCR?ABL P190、PML?RaRa(L型和S型)和AML1?ETO四种融合基因。该方法所使用的固定液价格低廉，无毒无害；一管质控品能同时完成4种融合基因的室内质控，方便经济；而目前市场上尚无可售的融合基因质控品，该发明填补了目前业内无融合基因质控品的空白。
【专利说明】
-种融合基因室内质控品、利记博彩app及其固定液的配方
技术领域
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域，特别设及一种采用固定的细胞悬液制作常见 融合基因室内质控品、利记博彩app及其固定液的配方。
【背景技术】
[0002] 白血病的发病率日趋升高，最近10年来的发病率几乎是此前的两倍。随着医疗水 平及技术的发展，白血病的分类、治疗及预后评价体系都得到了系统性的提升和完善。祀向 治疗药物的问世使分子诊断成为疾病诊断、治疗及预后监测过程中不可或缺的一部分。其 中融合基因的检测不仅辅助疾病分类和诊断，还与用药及治疗方案的选择息息相关。特别 像BCR-ABL P210和BCR-A化P190融合基因，是诊断慢性粒细胞白血病(CML)的特征性分子 标志物；同时也是指导格列卫等酪氨酸激酶抑制剂的祀标，其还可发生于B系的急性淋己细 胞白血病(B-A化）；PMkRaRa是急性早幼粒细胞白血病(M3)的诊断指标，而M3的治疗是区别 于其他急性髓系白血病(AML)的;AML1-ET0融合基因也是AML的一个诊断指标，同时也是预 后良好的一个预后指标。
[0003] 运些分子祀标，同时又是诊断指标，在临床应用上发挥着相当大的作用；同时也承 载着临床检测需求的压力。既然与疾病的诸多环节相关，那么其检测结果的准确性和稳定 性自然成为行业关注的焦点，即其质量控制显得尤为重要。由于国内相关检测起步较晚，而 融合基因检测的目标是RNA，一种非常容易被环境中到处充斥着的RNA酶降解的核酸，所W 用于监控实验室检测质量的质控物一直没有面市。
【发明内容】
[0004] 鉴于目前市面上尚无融合基因检测室内质控品销售，而室内质控又是衡量和评估 一个实验室检测体系的精确度和稳定性的重要方法和质量指标，故本发明设计了一种配置 融合基因质控品的方法和用于配置质控品的固定液。
[0005] -种用于配置细胞悬液作为质控品的固定液，包括70-75 %的无水冰乙醇和1-5 % 的冰醋酸，溶剂为水。
[0006] 更进一步具体的方案中，所述固定液WlOOml计算，包括4°C预冷无水乙醇70ml，冰 醋酸1ml，其余为水。
[0007] 配制好后的固定液在4°C冷藏保存。
[000引所述水为选自DEPC水。所述无水乙醇和冰醋酸均选自分析纯(AR)。
[0009] 本发明还提供了使用上述固定液配置融合基因室内质控品的方法，其包括W下步 骤：
[0010] (1)提取已知融合基因表达的样本中的有核细胞；
[0011] 间用固定液重悬有核细胞沉淀，离屯、弃上清;再加固定液重悬，获得融合基因室内 质巧品。
[0012] 若W收集的全血样品中的白细胞配置融合基因室内质控品，其配制方法包括W下 步骤：
[0013] (1)采用红细胞裂解液裂解红细胞的方法提取已知融合基因表达的样本中的有核 细胞。
[0014] 间用固定液重悬有核细胞沉淀，离屯、弃上清;再加固定液重悬即可。
[0015] 所述固定液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶剂为水。
[0016] 所述 10X 红细胞裂解液配方为：NH4C1 82g，NaHC038.4g，抓 TA-Na2 3.72g，加 d地20定容至1000ml。
[0017] 若W收集的培养细胞配制融合基因室内质控品，其配制方法包括W下步骤：
[0018] (1)消化收集表达已知融合基因的培养细胞，离屯、弃上清。
[0019] 间用固定液重悬细胞沉淀，离屯、弃上清;再加固定液重悬。
[0020] 所述固定液包括包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶剂为水。
[0021] 有核细胞可W选自BCR-ABL P210融合基因 b2a2型阳性、b3a2型阳性，BCR-A化 P190融合基因阳性，PMkRaRa融合基因 L型阳性、S型阳性和AML1-ET0融合基因阳性等样本。 运些有核细胞可W单独经固定液重悬后，配制成质控品，也可W将它们中的两种或两种W 上的有核细胞经固定液重悬后，等体积混合，备用。还可W进一步将混合后的细胞悬液按 lOOul/份分装备用。
[0022] 本发明还提供了用于一种融合基因室内质控品，所述质控品包括有核细胞和细胞 固定液，所述细胞固定液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶剂为水。
[0023] 有核细胞可W选自BCR-ABL P210融合基因 b2a2型阳性、b3a2型阳性，BCR-A化 P190融合基因阳性，PML-RaRa融合基因 L型阳性、S型阳性和AML1-ET0融合基因阳性中等样 本中的一种或多种。
[0024] 本发明还提供了使用上述质控品进行临床检测过程质量控制的方法，其包括W下 步骤：
[00巧](1)取质控品，加入1ml生理盐水，静置5min后离屯、弃上清。再加1ml生理盐水洗涂一 次。
[0026] 间按实验室日常融合基因检测流程，同临床样本一起进行操作。
[0027] 据统计，BCR-A化 P210、BCR-ABL P190、PMkRaRa和ML1-ET0四种融合基因的样本 检测量占所有融合基因检测量的90% W上。几乎每一个开展融合基因检测的实验室都会开 展运四项。实验室检测的精密度和稳定性对疾病的诊断，特别是治疗后微小残留病灶(MRD) 的监测具有非常重要的影响。故对该四种常见融合基因检测的质量控制在实验室检测中显 得尤为重要。
[0028] 作为质控品，其基本要求如下：(1)接近于临床样品的状态或保存于与临床样品相 似的基质中，如血清类质控品；间稳定性好，易于保存;如-20°C保存至少半年，最好是一年； 间处理方法和过程与临床样本一致，能监控整个检测流程;(4)对环境和人员无毒无害。作为 检测RNA的融合基因项目，其质控品的稳定性是个难W解决的大问题。因为空气中，人的唾 液，皮肤等到处都存在着RNA酶，故RNA非常容易降解。稳定RNA，保存RNA是质控品制作的关 键所在。其次作为质控品，其状态，检测过程需与临床样本保持一致，那么最接近临床样本 的物质就是细胞悬液。本发明利用无水乙醇、冰醋酸及DEPC水配置固定液，一方面固定了细 胞，避免细胞之间的粘附聚集，易于均匀分装使用;一方面其中的冰醋酸稳定了细胞中的核 酸成分，不易变性降解。并且稳定性实验已证明，该方法制作的细胞悬液质控品于-20°C条 件下至少能保存9个月。而配置固定液的成分价格低廉，无毒无害，配置方法简单，易于实验 室大批量配置使用。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1:
[0030] 全血有核细胞的提取及细胞悬液的固定:在1.5ml离屯、管中加入1ml IX红细胞裂 解液，取全血样本0.5ml，颠倒混匀。400化pm离屯、3min，吸弃上清，加红细胞裂解液洗涂一 次，加入细胞沉淀等体积的固定液50ul，即为配置好的质控品。
[0031] 所述固定液包括4°C预冷无水乙醇(AR)，70-75ml;冰醋酸(AR)，l-5ml ;DEPC水定容 至100ml; 4°C冷藏保存。
[0032] 实施例2:
[0033] 质控品的RNA提取：取实施例1中质控品加入1ml生理盐水，静置5min后离屯、弃上 清。再加1ml生理盐水洗涂一次。加1 ml Total RNA Isolation Reagent,反复吹吸直至无 明显细胞团块，加入氯仿200μ1，縱满混匀30s，冰上静置10min<a4,000巧m，4°C离屯、lOmin。 用移液器吸取上清液45化1转移至另一离屯、管中，加入等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀后在 冰上静置10minJ4,000巧m，4°C离屯、lOmin。然后用75%的乙醇和无水乙醇分别洗涂离屯、一 次。室溫干燥5min，加入50μ1 DEPC-肥0溶解。
[0034] 实施例3:
[0035] 逆转录:取实施例2中RNA溶液4ul(浓度约200ng/ul)加 lul Primer mix(ReverTra Ace qPCR RT Kit)和 3ulDEPC-H20 混匀，70°C 预变性 5min;冰上骤冷 Imin 后加入 5*RT buffer4ul(ReverTra Ace qPCR RT Kit),Enzyme Mix lul(ReverTra Ace qPCR RT Kit), 并加 DEPC-H20 7ul至总体积为20ιιΚ37Γ60π?η反应后98°C5min灭活，所得即为待检质控品 的cDNA。
[0036] 实施例4:
[0037] 不同配方固定液的比较实验:按实施例1中方法提取有核细胞4份，分别加入4种不 同配方的固定液，4°C固定1天后和-20°C固定一天后分别进行检测。按实施例2和3中方法得 到cDNA。检巧U4份待比较样品的内参A化基因，W判断RNA是否降解。A化基因检测的引物探针 如下表1所示；试剂配置如下表2所示；加入实施例3中所得cDNA各化1。按如下程序进行检 ?i:95°C预变性30s;95°C10s，58°C35s，共40个循环;58°C时采集巧光。T册NDERBI畑Probe qPCR Mix购自东洋纺(上海)生物科技有限公司。A化基因检测拷贝数取L0G10后，下降值不 得>-7.5%。由所得结果可知(表3)，序号1(染色体核型分析常用配方)和序号3(本发明的 固定液)在4 °C固定1天后和-20°C固定一天后，A化内参没有降低，即RNA没有降解。而序号1 由于冰醋酸含量大，具有刺激性，对工作人员的健康不利。而本发明的固定液配方则没有运 个问题。
[00；3 引 表1:
[0039]
[0044] 注:*配方1为染色体核型分析实验中的细胞悬液固定液，该固定液对染色体的形 态无影响;配方2为RNA提取过程中的洗涂液，可去除残留的蛋白、盐离子、提取试剂中残留 的苯酪等有机物;配方3即本发明；配方4是常规病理的细胞固定液，用于细胞的固定。
[0045] 实施例5:
[0046] 不同样品细胞间的干扰实验:不同人的白细胞之间会发生粘附、聚集，然后其内容 的核酸降解。由于质控品的使用量较大，需要将同一种融合基因阳性但来自不同患者的白 细胞进行混合。本实验旨在确定不同人白细胞在固定后是否会发生相互粘附而降解。按实 施例1方法获取固定后的4份不同人员样本，将样品1和2进行混合，样品3和4进行混合。按实 施例巧P3方法取得cDNA，按实施例4中方法检测A化内参基因。由所得结果(表4)可知，混合 后，内参基因未降低，即RNA未发生降解。故本发明的固定液配方可W避免不同来源细胞 的粘附降解。
[0047]表4:
[004引
[0049] 实施例6:
[0050] 可操作性实验：旨在评估该类型质控品在现有实验室流程及不同人员操作过程中 产生的误差是否能满足作为质控品的稳定性要求。按实施例1配置6份BCR-A化P210阳性的 质控品；选两名实验室技术人员A和B，按照实施例2和3方法获取cDNA，检测BCR-ABL P210和 ABL，统计偏倚率。BCR-ABL P210的引物探针如下表5所示;试剂配置如下表6所示;A化检测 按实施例4进行，各加入所得cDNA各化1。按如下程序进行检测:95°C预变性30s; 95 °C 10s，58 °C35s，共40个循环;58°C时采集巧光。BCR-A化P210和A化基因检测拷贝数取LOGIO后，偏倚 不得>±7.5%。由所得结果(表7)可知，两名技术员分别进行质控品检测后，其偏倚率在要 求范围内。即该类型质控品的可操作性符合其作为质控品的要求。
[0化1] 表5:
[0化2]
[0化6] 表7: 「00571
[0化引实施例7:
[0059] 保存稳定性及临床适用性实验：
[0060] 选取已知BCR-A化P210b2a2型和b3a2型阳性样品各两份、BCR-ABL P190阳性样品 4份、PMkRaRa L型和S型阳性样品各4份;AML1-ET0阳性样品2份，按实施例1方案制备成固 定的细胞悬液。取6种融合型别阳性的细胞悬液各300ul，混匀后lOOul/管分装好，-20±2°C 保存备用。制备成的常见融合基因室内质控品。
[0061] 按配置好后当天，一周，两周，一个月，两个月，Ξ个月，6个月和9个月等时间点进 行保存稳定性实验。质控品检测方法同实施例2进行RNA提取;检测采用成品试剂盒，来自上 海源奇生物医药科技有限公司，W验证该质控品是否适用于经CFDA认证的成品检测系统进 行室内质量控制使用。试剂配置如表8.每个PCR反应管中加15U1RNA;按如下程序进行检测： 42°C30min;94°C预变性5min;94°C15s，60°C60s，共40个循环;60°C时采集巧光。检测所得拷 贝数取L0G10后，偏倚不>±7.5%，则认为质控品仍在有效范围内，若某次偏离范围，则再 取一管重新检测W排除偶然因素。由所得结果(表9)可知，-20±2°C保存9个月后，质控品仍 稳定可使用。且该质控品适用于市面上的成品检测试剂盒。
[0062] 表8:
[0063]
[0067] 注:冲210包含b2a2和b3a2两种型别。
【主权项】
1. 一种用于配置细胞悬液作为质控品的固定液，其特征在于，包括70-75%的冰乙醇和 1-5%的冰醋酸，溶剂为水。2. 根据权利要求1所述的固定液，其特征在于，包括70 %的冰乙醇和1 %的冰醋酸。3. 根据权利要求1所述的固定液，其特征在于，所述的水为DEPC水。4. 配置融合基因室内质控品的方法，其包括以下步骤： ⑴提取已知融合基因表达的样本中的有核细胞； ⑵用固定液重悬有核细胞沉淀，离心弃上清;再加固定液重悬，获得融合基因室内质控 品； 所述固定液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶剂为水。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于， 以收集的全血样品中的白细胞配置融合基因室内质控品，其配制方法包括以下步骤： ⑴采用红细胞裂解液裂解红细胞的方法提取已知融合基因表达的样本中的有核细胞； ⑵用固定液重悬有核细胞沉淀，离心弃上清;再加固定液重悬。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述红细胞裂解液配方为：NH4C1 82g， NaHC038 · 4g，EDTA-Na2 3 · 72g，加 ddH20定容至 1000ml。7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于， 以收集的培养细胞配制融合基因室内质控品，其配制方法包括以下步骤： ⑴消化收集表达已知融合基因的培养细胞，离心弃上清； ⑵用固定液重悬细胞沉淀，离心弃上清;再加固定液重悬。8. 根据权利要求4至8之一所述的方法，其特征在于，所述有核细胞选自BCR-ABL P210 融合基因 b2a2型阳性、b3a2型阳性，BCR-ABL P190融合基因阳性，PML-RaRa融合基因 L型阳 性、S型阳性和AML1-ETO融合基因阳性中的一种或多种。9. 一种融合基因室内质控品，包括有核细胞和细胞固定液，其特在在于，所述细胞固定 液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶剂为水。10. 使用权利要求9所述的质控品进行临床检测过程质量控制的方法，其包括以下步 骤： ⑴取质控品，加入lml生理盐水，静置5min后离心弃上清。再加 lml生理盐水洗涤一次； ⑵按实验室日常融合基因检测流程，同临床样本一起进行操作。
【文档编号】C12Q1/68GK106011240SQ201610345672
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月19日
【发明人】邹媛, 陈红梅, 夏成青
【申请人】合肥艾迪康临床检验所有限公司