采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌鉴定分析的方法
【专利摘要】本发明公开了一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌鉴定分析的方法，主要以向其中混合四种不同碳纳米材料作为处理组，通过草坪植物培养，研究添加不同碳纳米材料一段时间后基质中可培养细菌数量变化，并通过分子测序技术分析基质中可培养微生物的分类地位。通过将碳纳米材料添加进草坪建植体系后细菌类群变化认识，为碳纳米材料在垃圾堆肥草坪基质中细菌类群调控应用提供技术支撑。
【专利说明】
采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌鉴定分析的方法
技术领域
[0001] 本发明属于环境保护技术领域，设及一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌 鉴定分析的方法。
【背景技术】
[0002] 碳纳米材料是Ξ维结构中至少有一个小于100 nm的材料。碳纳米材料具有尺寸 小，比表面积大，表面能高，表面原子比例大的特点，在力学、光学、热学、电学等方面表现出 了优异性能。纳米颗粒存在很多微界面，各种界面反应可W通过其强化，在±壤重金属污 染W及污水净化方面发挥着显著的作用。
[0003] 碳元素在自然界含量非常高，对于有机物和生命体也非常重要。1985年，科学家 发现了由60个C原子组成的C6Q。随后碳纳米管和石墨締等也相继被发现。2004年，Geim等 人成功制备出了单层石墨締。之后随着石墨締在光、电、热、磁上的特殊性质被陆续发现， 有关碳材料的研究又进入了一个全新的领域。
[0004] 随着科学技术、现代工业的快速发展W及人口的不断增加，世界上很多国家都呈 现出水体、±壤^及大气污染日益严重的趋势。报道指出，中国50%的河流W及80%w上的湖 泊已经遭受到了污染，地表水的m类水质标准中国的许多湖泊已经达不到了。全国的耕地 中有8000万hm2w上受到了不同程度的污染，而其中最突出的问题就是有机污染物W及重 金属的污染，运一情况已经严重制约了中国可持续发展战略的实施，甚至威胁到了国人的 健康。
[0005] 传统的水体修复技术比如截污、底泥疏竣等虽然暂时能够起一些作用，但是都治 标不治本，而生物修复限制因素有很多，比如环境溫度和酸碱性等，运就使得生物修复客 观上存在着很大的局限性。作为传统的污染±壤修复方法，客±法、淋滤法费时费力，并且 对于大面积的修复起不到很好的作用。与传统的环境修复方法相比较，将纳米材料用于重 金属修复，因其超强的吸附能力和超大的比表面积，不仅不存在传统方法的缺点，还表现出 极高的修复效率。另外大气污染方面形势也是十分严峻，空气中超标的S〇2、C0和NOx等时刻 威胁着我们的身体健康。纳米材料具有极佳的催化效率，甚至能够催化极不易发生的反应 为解决产生大气污染问题提供了新的方法和思路。因此，利用纳米材料解决水体和±壤^ 及大气的污染问题越来越值得人们关注。而碳纳米材料的研究又是其中极有发展前景的领 域。
[0006] 近年来的研究发现碳纳米管能够有效的吸附水体中重金属离子。Li等的实验表 明碳纳米管能够吸附水体中的铅离子，并且与溶液的PH值有很大的相关性。随着溶液pH值 的增加，碳纳米管对铅离子的吸附能力也随之增大。Langmuir和Freundlich模型可W解 释运个吸附过程。随后，Li等还研究了不同氧化方式处理的碳纳米管对儒离子的吸附效果 比较，发现经过氧化处理后，碳纳米管的比表面积显著增加，表面官能团的数量也有明显增 多。具体来说，碳纳米管经KMn〇4氧化之后的吸附效果明显高于也化和HN03的氧化效果。另 夕hLi等人接下来又进行了碳纳米管吸附铜离子的实验、研究了不同形态的碳纳米管对铅 离子的吸附比较、碳纳米管对铅离子的吸附动力学性质w及解吸附的情况，并且讨论了碳 纳米管对铅离子、铜离子W及儒离子在相同溶液中的竞争吸附情况。研究发现，碳纳米管对 对溶液中W上Ξ种不同离子的吸附顺序为化2+>^2+>Cd2%其中对铅离子(Pb 2+)、铜离子 (化2+)的吸附可W用Langmuir方程解释。
[0007] 李延辉等利用HN化氧化处理的碳纳米管进行了对Pb2+的吸附实验。研究发现歷化 氧化处理之后的碳纳米管表面积明显增大，另夕h〇H、-CO、-COOH等官能团被引入到了碳纳 米管的表面。运能够明显增强碳纳米管吸附化的作用面积W及作用力，从而提高碳纳米管 对Pb2+的吸附量。结果表明，吸附量随着溫度的升高而升高，运说明碳纳米管对Pb2+的吸附 是一个放热过程。再生试验表明，吸附效果随抑值的增加而显著增加。当pH低至2时，碳纳米 管上吸附的Pb2+脱附率到了 85%，从而为实现碳纳米管吸附材料的循环利用提供了理论依 据。
[0008] 除此之外，石墨締和氧化石墨締对于有机物污染W及由石油泄露造成的环境污染 也有很强的修复作用。石墨締改性之后对环境中污染物的吸附效果更佳，并且吸附量增大、 性能更加稳定。Chen等人备出的Ξ维多孔氧化石墨締薄膜在选择吸附方面表现出了巨 大的潜力。它吸附机油的重量能够达到自身重量的37倍，吸附有机溶剂的重量则大于自身 重量的26倍，它的吸附效果相比片状石墨締和泡沫石墨締高很多。除此之外，该多孔氧化 石墨締薄膜的性质十分稳定，可利用己烧去除表面的吸附物质之后循环利用。较高的吸附 量和较长的循环使用次数使得该Ξ维多孔氧化石墨締薄膜去除有机物W及清理石油污染 方面表现出了极大的应用前景。
[0009] 上述分析表明，石墨締和碳纳米管等碳纳米材料在环境领域的应用主要在±壤、 水体W及大气污染修复方面，而作为生物调控剂进行应用，尤其碳纳米材料在堆肥草坪基 质中作为微生物调控剂，研究目前尚无文献报道。
[0010] 随着我国经济增长和城市化速度的加快，城市生活和生产过程中产生的垃圾废物 呈现显著增加的趋势。与此同时，生活垃圾的配套处理却还不够完备，大量垃圾暴露在城市 中，对环境造成了很大的影响。堆肥化处理是城市生活垃圾处理及资源化比较便捷的方式， 运不仅能够消化城市中的生活垃圾，缓解了生活垃圾带来的城市环境压力，同时也生产出 了大量堆肥肥料供给农业生产。
[0011] 生活垃圾中含有大量植物生长所必需的营养元素，因此将生活垃圾堆肥化处理并 将堆肥用于农业生产是其资源化利用的有效途径。
[0012] 研究发现将适量垃圾堆肥添加到±壤当中能够有效增加作物产量。因±壤理化性 质W及作物类型不同，其增幅也存在显著差异。周德智等4开究了添加垃圾堆肥后，黄栋壤、 潮±^及红壤中种植的小麦产量变化。结果显示，添加适量垃圾堆肥后，作物均有增产效 果，其中红壤±效果最好(作物增产46%)。贺立源等开究发现，小白菜的产量随着垃圾堆 肥施用量的提高而增加，且与对照相比差异达到显著水平。此外，堆肥的施用不仅对作物产 量有影响，对作物的品质也有显著的提高效果。方亭等人的研究发现，将垃圾堆肥添加到栋 红壤±中，±壤作物油菜的巧粒中蛋白质的含量显著升高，大豆巧粒中所含的蛋白质明显 增加。
[0013] 然而，近些年来人们也开始意识到垃圾堆肥中不仅含有营养物质，同时还含有一 定量的重金属，如果长期施用会增加±壤中重金属的含量。因此，将堆肥用于农业生产可能 会带来一系列的食品安全问题。可见，避开食物链实现垃圾堆肥的资源化利用意义重大。不 仅如此，为防止堆肥利用导致±壤重金属污染，甚至给生态环境带来威胁，在应用的同时必 须考虑重金属修复的问题。
[0014] 传统的草皮生产通常是利用优质±壤。运会对±壤的物理性质产生很大的影响， 导致肥力下降。另外草皮生产时2 cmW上的耕层±壤会被带走，肥沃的耕层±壤进入城市 生态系统，而经过几次的草皮生产之后，农田±壤将变得越来越贫瘡，W致于最终无法再进 行农业生产，运是对国±资源极大的浪费。如果草坪建植W生活垃圾堆肥作为基本体系， 不仅能够消化城市垃圾，还能够减轻草坪生产带给耕层±壤的破坏作用。
[0015] 纳米技术近年来发展十分迅速，在材料、信息、环境等方面均表现出了广阔的应用 前景。虽然已经有一些研究理论研究，表明纳米材料会对微生物的生长产生不同程度的影 响，但应用其调控作用，还尚无相关技术报道。
【发明内容】
[0016] 碳纳米材料因其特殊的结构具有很大的应用范围，吸附水体和±壤中的重金属就 是其中一项重要的应用。本技术从基质微生物角度出发，W生活垃圾堆肥和±壤混合物为 草坪基质材料，W向其中混合四种不同碳纳米材料作为处理组，通过草坪植物培养，研究添 加不同碳纳米材料一段时间后基质中可培养细菌数量变化，并通过分子测序技术分析基质 中可培养微生物的分类地位。通过将碳纳米材料添加进草坪建植体系后细菌类群变化认 识，为碳纳米材料在垃圾堆肥草坪基质中细菌类群调控应用提供技术支撑。
[0017] 为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容： 一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌鉴定分析的方法，其特征在于按如下的步 骤进行： (1)实验材料 实验用±壤取自天津师范大学校园0-20 cm表层±壤，基本性质为:含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250 μS/cm，有机质、全憐、全氮分别为52.3、3.75、2.15g/kg。
[0018] 实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂。pH为7.49,电导率2300 pS/cm， 有机质、全憐、全氮分别为132、6.81、25.1g/kg。重金属Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分别为703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0019] 供试纳米炭黑(CB)购于天津秋实炭黑厂，粒径为20~70皿，比表面积为1200 g，pH值为7.0，实验前利用KMn化对其改性处理。
[0020] 石墨締(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸 0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电导率 8000-10000 S/ 111，含碳量〉99.5〇/〇。
[0021] 氧化石墨締(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片层直径10-50皿，比表面积100-300 m^g，纯度〉90〇/〇。
[0022] 碳纳米管（CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径20-40 nm，长度 10-30 um，-C00H含量 1.43%，纯度〉90wt%，灰粉<8wt%，比表面积〉110 m2/g，导电：〉102 s/ cm〇
[0023] (2)实验方法： 取±后立即测量±壤含水量，计算得到±壤干重与湿重的比例。按照比例算得干重 1500 g所对应的湿±重量。称得相应重量的湿±与30 g垃圾堆肥混合，揽拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆。
[0024] 实验共设5个处理，石墨締(G)、氧化石墨締(GO)、碳纳米管（CNT)、改性纳米炭黑 (CB)按干±重1%的比例分别加入到混合基质中，W不添加碳纳米材料的处理为对照(CK)， 添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间溫度为19~27 °C，相对湿 度为60~72%，每天给±壤补充水分，使±壤湿度保持在±壤持水量的70%。培养130d后，将 盆中0-5cm深度±壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20°C保存，供微生物分离与计数分析。
[0025] 本发明进一步公开加了采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌鉴定分析的方法 在降低基质中可培养细菌总数，降低物种多样性指标方面的应用；其中的细菌总数指的是 芽抱杆菌(姑[別如5 、假黄单胞杆菌(Pset/c/ojraniAo皿Mas)、节杆菌(AriArobacier)、微杆 菌属(ificroAacierit/m)和根瘤菌（5? 打 orAizoAit/m)。
[0026] 本发明同时也公开了采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌鉴定分析的方法在 提高芽抱杆菌数量方面的应用，其中的碳纳米材料指的是KMn化对其改性处理后的纳米炭
[ψ? 0 本发明所述的纳米炭黑(CB)实验前利用ΚΜη化对其改性处理指的是:称取纳米碳10 g 于250 mL锥形瓶中，加入100 mLO.03 mol .L-1的KMn化溶液，静置10 min后，放于万用电热 器上沸腾回流1 h。冷却后，用去离子水反复冲洗，使溶液不再浑浊且pH稳定。转移至烧杯， 110°C条件下烘干至恒重。
[0027] 本发明更加详细的描述如下： 1研制材料与方法 1.1实验材料 实验用±壤取自天津师范大学校园0-20 cm表层±壤，基本性质为:含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250 μS/cm，有机质、全憐、全氮分别为52.3、3.75、2.15g/kg。
[0028] 实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂。pH为7.49,电导率2300 pS/cm， 有机质、全憐、全氮分别为132、6.81、25.1g/kg。重金属Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分别为703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[00巧]供试纳米炭黑(CB)购于天津秋实炭黑厂，粒径为20~70皿，比表面积为1200 g，pH值为7.0，实验前利用KMn化对其改性处理。
[0030] 石墨締(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸 0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电导率 8000-10000 S/ 111，含碳量〉99.5〇/〇。
[0031] 氧化石墨締(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片层直径10-50皿，比表面积100-300 m^g，纯度〉90〇/〇。
[0032] 碳纳米管（CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径20-40 nm，长度 10-30 um，-C00H含量 1.43%，纯度〉90wt%，灰粉<8wt%，比表面积〉110 m2/g，导电：〉102 s/ cm〇
[0033] 技术设计 取±后立即测量±壤含水量，计算得到±壤干重与湿重的比例。按照比例算得干重 1500 g所对应的湿±重量。称得相应重量的湿±与30 g垃圾堆肥混合，揽拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆。
[0034]实验共设5个处理，石墨締(G)、氧化石墨締(GO)、碳纳米管（CNT)、改性纳米炭黑 (CB)按干±重1%的比例分别加入到混合基质中，W不添加碳纳米材料的处理为对照(CK)， 每个处理Ξ次重复。添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间溫度为 19~27 °C，相对湿度为60~72%，每天给±壤补充水分，使±壤湿度保持在±壤持水量的 70%。培养130d后，将盆中0-5cm深度±壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20°C保存，供微生物分 离与计数分析。
[00对研制方法 1.3.1细菌培养基配制方法 根据微生物学实验手册，进行微生物培养基的配制。其中培养细菌用牛肉膏蛋白腺培 养基（LB培养基），具体配方为牛肉膏5g、蛋白腺lOg、氯化钢5g、琼脂18g、蒸馈水 lOOOmL，利用化0H或HC1调节抑到7.0~7.2。12TC灭菌20分钟，室溫惊至50-60°C时，将培 养基倒入直径9cm的培养皿中，每个培养皿约倒入50ml，充分惊凉至凝固，备用。
[0036] 细菌培养最适浓度的确定 为了实验的顺利进行，在正式实验之前，需先进行预实验。根据微生物学实验指导W及 W往培养经验初步确定细菌培养观察的最适浓度在10-3-10-5之间。取〇.5g对照组中的基质 ±壤倒入装有50ml无菌水的锥形瓶中，封口后置于摇床上，W 150 rpm振荡20 min。振荡 停止后静置10 S。吸取1 mL±壤浸出液移入试管中并添加9 mL无菌水，将其稀释10倍，审U 成10-3浓度的±壤浸出液，之后利用此方法分别制成1〇Λ?0-5浓度的±壤浸出液。取200ul ±壤浸出液均匀涂布到LB培养基上，将培养皿倒置放入37度的恒溫培养箱中，避光培养。连 续观察细菌生长情况，待其大小适宜数量稳定后进行计数。为了便于微生物的计数W及形 态特征的区分，应选取菌落数量在30-100之间的培养基进行计数，预实验的结果发现10-4运 一浓度为草坪堆肥基质中细菌培养观察的最适浓度。
[0037] 细菌平板计数方法 采用与预实验相同的稀释平板涂布法分离基质中的细菌，并对其菌落进行计数。因为 通过预实验已确定出最适浓度为10-4,所W实验可W直接将草坪堆肥基质稀释10000倍进行 培养。具体操作过程为:称取0.5肖±壤将其倒入装有50 mL无菌水的锥形瓶中，封口后置于 摇床上，W 150 rpm振荡20 min。振荡停止后静置10 S。吸取0.5 mL ±壤浸出液移入装 有50ml无菌水的锥形瓶中制成10-4浓度的±壤悬浊液，充分混匀后，吸取200UL并将其注射 到固体LB培养基上，涂布均匀，之后将培养皿倒置于37 Γ恒溫培养箱内培养3d，选取菌落 数在30-300范围内的平板进行分离计数，并按照其不同菌落特征归类、编号。用灭菌后的 接种环挑取不同种的细菌菌落培养物少许分别接种到新的LB培养基上，画出连续的折线， W达到对分离到的细菌纯化的目的。接种后做好标签倒置于37度培养箱中培养2d，之后转 移到4°C冰箱中保存备用。
[0038] 细菌的分子生物学鉴定方法 由于细菌细胞中的leSrDNA-部分碱基序列十分保守的，不受微生物所处环境条件的 影响，而一部分序列又是可变的，因此，可W通过分析比较细菌之间16S rDNA的同源性，掲 示它们的亲缘关系W及系统发育地位。
[0039] 利用化up柱式基因组DM抽提试剂盒（上海生工）提取纯培养得到的细菌基因组 DNA，其过程按照试剂盒要求进行。将所得基因组DNA用于细菌16S rDNA的PCR扩增。
[0040] 引物为 27f: 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3/ 1492。 5/-GGT TAC CTT GTT ACG ACT Τ-3/ PCR反应条件与步骤:94°C预变性5min，94°C变性lmin，55°C退火45s，72°C延伸45s，30 个循环，72°C延伸lOmin。扩增体系如下（50化）：引物1(27F) 引物2(1492R) ^iLlOx Buffer(Mgh) 5化;dNTP 1化;Taq酶化L;DNA模板1化Lckffl20 2化L。吸取不同扩增产物各 化L分别与化L eXGlycerol DNA loading buffer混合均匀，吸取化L混合液进行点样，并 进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，将琼脂糖凝胶浸入EB水溶液中染色lOmin，在紫外 凝胶成像系统中观察，观察到明亮目标条带后，将实验所得PCR产物交由北京华大基因公司 纯化与测序。
[0041 ] 细菌leSrDNA序列分析方法 测序结果经NCBI Blast( http: /7WWW.ncbi.nlm.nih.gov)比对分析，获得相似度最 高的五个菌株的leSrDNA序列。运用Clus化IX进行多重对比、用MEGA软件进行系统发育分 析，采用化i曲bor-join法构建系统发育树，自展数(Bootstrap)为1000。根据序列的同源程 度初步确定待鉴定的菌株在分类学上的地位。将培养得到菌株与NCBI数据库中的模式菌株 进行比较，如果相似度达到96%W上，那么可将培养得到的菌株与模式菌株归为一个属，也 就将培养菌株鉴定到了属的水平。
[0042] 研制结果分析 经过对草坪堆肥基质中细菌的培养计数W及种类划分归类，挑选出了不同特征的细菌 菌落。
[0043] 通过对不同细菌leSrDNA的PCR，得到了多条扩增片段，并且通过与DNA Marker的 位置对比，发现其条带符合细菌的特征，送测后的结果显示如下： 本实验共获得10条有效序列，将获得的序列通过Blast程序与Gen-Bank数据库中已 知序列进行相似性比对，其类别信息、相似性百分比及GenBank登录号见表1。
[0044] 表1±壤中可培养细菌的leSrDNA序列相似性分析
通过序列相似性分析发现菌株1、菌株2、菌株5W及菌株8为芽抱杆菌原姑ci^us)，菌 株3为假黄单胞杆菌属(Aet/c/ojraniAo皿Mas)，菌株4和菌株10为节杆菌属(AriArobaciei·)， 菌株6和菌株9为微杆菌属(#icro6aC?erit/m)，菌株7为根瘤菌属（SinorAizobit/m)。相似度 均大于96%，可信度较高。
[0045] 将分离出的10株形态不同的细菌菌株的测序结果进行Blast分析及多重比对，之 后利用MEGA5.1W leSrDNA同源性为基础构建系统进化树。
[0046] 3研制结论 结合16SrDNA、18SrDNA测序技术对添加碳纳米材料后草坪堆肥基质中可培养微生物进 行了鉴定分析，主要研究结果如下:共分离得到10株细菌，经leSrDNA测序结果表明运10株 细菌分属于芽抱杆菌（公乂假黄单胞杆菌（Pset/c/oja打iAomo打as)、节杆菌 (At iAroba C ? e_r)、微杆菌属(胞cro6a C ? eri歴)和根瘤菌（SinorA izo6i歴)。添加碳纳米材料 会明显降低基质中可培养细菌总数，物种多样性指标也有不同程度下降。基质中可培养细 菌优势种由假黄单胞菌属变为芽抱杆菌属，且芽抱杆菌属优势非常明显。纳米碳黑处理组 中芽抱杆菌的数量占到了总数的88.74%。
[0047]
【附图说明】： 图1是对其进行leSrDNA扩增之后的电泳图。
【具体实施方式】
[0048] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的 范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本 发明实质和范围的前提下，对运些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。本发明所用原料、试剂均有市售。
[0049] 实施例1 (1)实验材料 实验用±壤取自天津师范大学校园10 cm表层±壤，基本性质为：含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250 μS/cm，有机质、全憐、全氮分别为52.3、3.75、2.15g/kg。
[(K)加]实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂。pH为7.49,电导率2300 pS/cm， 有机质、全憐、全氮分别为132、6.81、25.1g/kg。重金属Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分别为703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0化1]供试纳米炭黑（CB)购于天津秋实炭黑厂，粒径为20 nm，比表面积为1200 mVg， pH值为7.0，实验前利用KMn化对其改性处理。
[0052] 石墨締(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸 0.5皿，厚度5 nm，比表面积40 m^g，密度约2.化g/cm3,电导率8000 S/m，含碳量〉99.5〇/〇。
[0053] 氧化石墨締(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片层直径10皿，比表面积100 m^g，纯度〉90〇/〇。
[0054] 碳纳米管（CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径20 nm，长度 10um，-C00H含量 1.43%，纯度〉90wt%，灰粉<8wt%，比表面积〉110 m^g，导电：〉102 s/cm。
[0055] (2)实验方法： 取±后立即测量±壤含水量，计算得到±壤干重与湿重的比例。按照比例算得干重 1500 g所对应的湿±重量。称得相应重量的湿±与30 g垃圾堆肥混合，揽拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆。
[0056] 实验共设5个处理，石墨締(G)、氧化石墨締(GO)、碳纳米管（CNT)、改性纳米炭黑 (CB)按干±重1%的比例分别加入到混合基质中，W不添加碳纳米材料的处理为对照(CK)， 添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间溫度为19 °C，相对湿度为 60%，每天给±壤补充水分，使±壤湿度保持在±壤持水量的70%。培养130d后，将盆中1cm深 度±壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20°C保存，供微生物分离与计数分析。
[0化7]实施例2 (1)实验材料 实验用±壤取自天津师范大学校园20 cm表层±壤，基本性质为：含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250 μS/cm，有机质、全憐、全氮分别为52.3、3.75、2.15g/kg。
[0化引实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂。pH为7.49,电导率2300 pS/cm， 有机质、全憐、全氮分别为132、6.81、25.1g/kg。重金属Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分别为703、 341、217、677、5.01 mg/kg。
[0化9]供试纳米炭黑（CB)购于天津秋实炭黑厂，粒径为70 nm，比表面积为1200 mVg， pH值为7.0，实验前利用KMn化对其改性处理。
[0060] 石墨締(G)微片购于南京吉仓纳米科技有限公司，结构为黑色薄片状，微片尺寸20 皿，厚度25 nm，比表面积60 m^g，密度约2.化g/cm3,电导率10000 S/m，含碳量〉99.5〇/〇。
[0061] 氧化石墨締(GO)购于苏州恒球纳米公司，为黑色或褐黄色粉末，平均厚度7 nm，片 层直径50 μL?，比表面积100-300 mVg，纯度>90%。
[0062] 碳纳米管（CNT)购于北京博宇高科技新材料技术有限公司，直径40 nm，长度30 um，-C00H含量1.43%，纯度〉90wt%，灰粉<8wt%，比表面积〉110 m^g，导电：>102 s/cm。
[0063] (2)实验方法： 取±后立即测量±壤含水量，计算得到±壤干重与湿重的比例。按照比例算得干重 1500 g所对应的湿±重量。称得相应重量的湿±与30 g垃圾堆肥混合，揽拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆。
[0064] 实验共设5个处理，石墨締(G)、氧化石墨締(GO)、碳纳米管（CNT)、改性纳米炭黑 (CB)按干±重1%的比例分别加入到混合基质中，W不添加碳纳米材料的处理为对照(CK)， 添加碳纳米材料后充分混匀，每盆播种高羊茅种子5g。培养期间溫度为27 °C，相对湿度为 72%，每天给±壤补充水分，使±壤湿度保持在±壤持水量的70%。培养130d后，将盆中5cm深 度±壤取出混匀，过60目筛，冰箱-20°C保存，供微生物分离与计数分析。
【主权项】
1. 一种采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌鉴定分析的方法，其特征在于按如下的 步骤进行： (1) 实验材料 实验用土壤取0-20 cm表层土壤； 供试纳米炭黑粒径为20~70 nm，比表面积为1200 m2/g，pH值为7.0,实验前利用KMn〇4 对其改性处理； 石墨烯微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电 导率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%; 氧化石墨烯平均厚度3.4-7 nm，片层直径10-50 μπι，比表面积100-300 m2/g，纯度>90%; 碳纳米管直径20-40 nm，长度10-30 um，_⑶OH含量1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，比 表面积>110 m2/g，导电：>102 s/cm; (2) 实验方法： 取土后立即测量土壤含水量，计算得到土壤干重与湿重的比例，按照比例算得干重 1500 g所对应的湿土重量，称得相应重量的湿土与30 g垃圾堆肥混合，搅拌均匀，装入内径 15 cm高20 cm的塑料花盆中，共装15盆； 实验共设5个处理:石墨烯(G)、氧化石墨烯(GO)、碳纳米管(CNT)、改性纳米炭黑(CB)按 干土重1%的比例分别加入，添加碳纳米材料后充分混匀，以不添加碳纳米材料的处理为对 照(CK)，每盆播种高羊茅种子5g，培养期间温度为19~27 °C，相对湿度为60~72%，每天给 土壤补充水分，使土壤湿度保持在土壤持水量的70%，培养130d后，将盆中0-5cm深度土壤取 出混匀，过60目筛，冰箱-20°C保存，供微生物分离与计数分析。2. 权利要求1所述的方法，其中土壤的基本性质为:含水量19.4%，pH 7.27，电导率2250 的/〇11，有机质、全磷、全氮分别为52.3、3.75、2.15 8/1^; 实验用生活垃圾堆肥来自天津市小淀垃圾处理厂，pH为7.49,电导率2300 uS/cm，有机 质、全磷、全氮分别为132、6.81、25.1&/1^; 重金属〇、&1、？13、211丄(1含量分别为703、341、217、677、5.0111^/1^; 纳米炭黑，粒径为20~70 nm，比表面积为1200 m2/g，pH值为7.0,实验前利用KMn〇4对 其改性处理； 石墨烯微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面积40-60 m2/g，密度约2.25 g/cm3,电 导率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%; 氧化石墨烯平均厚度3.4-7 nm，片层直径10-50 μπι，比表面积100-300 m2/g，纯度>90%; 碳纳米管，直径20-40 nm，长度10-30 um，-C00H含量1.43%，纯度>90wt%，灰粉<8wt%，表 面积>110 m2/g，导电:>102 s/cm。3. 权利要求1所述采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌鉴定分析的方法在降低基质 中可培养细菌总数，降低物种多样性指标方面的应用；其中的细菌总数指的是芽孢杆菌 ()、假黄单胞杆菌（Pset/c/ojra/? iAo/moas)、节杆菌（driA_ro/7acier)、微杆菌属 (ifiaro/7acie_rit/?)和根瘤菌（〇4. 权利要求1所述采用碳纳米材料调控草坪堆肥基质细菌鉴定分析的方法在提高芽孢 杆菌数量方面的应用，其中的碳纳米材料指的是ΚΜη0 4对其改性处理后的纳米炭黑。
【文档编号】C12Q1/06GK106011221SQ201610443487
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】多立安, 赵树兰, 郑亚南
【申请人】天津师范大学