一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法。该方法以克雷伯氏菌LDX1?1和野油菜黄单孢菌CICC10258的混合菌种，采用无拮抗兼容性摇瓶与高镁发酵培养基发酵协同发酵，发酵完成后采用混合盐进行凝胶化强度处理。该制备方法发酵速度快，工艺易于操作，发酵浓度高，生产成本低。生产的絮凝剂用于处理高盐度高浮力海水具有结构稳定，絮块致密，沉降速度快的特点，对养殖海水净化具有显著效果。
【专利说明】
-种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法，属于生物技术与生物 工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 随着中国海水养殖业的迅猛发展，沿海育苗场及养殖场废水排放量与日俱增，从 而造成近海水域水质恶化，或富营养化、生态系统失衡，导致了养殖病害滋生、赤潮频发。近 海水域污染严重地破坏了海洋生态环境和影响了广大沿海地区的可持续性经济发展。海水 养殖废水包括来源于粪便和饲料的颗粒态固体废物，溶解态代谢废物，无机盐、抗微生物剂 和药物的残留等。海水养殖废水不同于工业废水和生活污水的是，具有盐度效应和污染物 的含量低、水量大的特点，运就增加了其废水的处理难度。因此，研究有效的养殖海水处理 技术已成为当今社会经济发展的强烈需求。
[0003] 现在的物理处理技术，如沉淀、过滤可去除养殖海水中的悬浮物和部分C0D、B0D， 但对可溶性有机物、无机物及总N、P等的去除效果不佳。化学处理方法，如漂白粉、孔雀石绿 等水质改良剂虽然也能对养殖后的海水进行一定的处理，但运些方法会对水质环境产生二 次污染。臭氧法是一种既能够消除水中的污染物、改善水质而又对环境友好的处理方法，但 臭氧氧化技术的不足之处是处理成本较高，残留的臭氧还会对养殖对象产生一定的毒性作 用。养殖海水的生物净化处理技术研究日益受到社会的关注。生物处理技术是利用微生物 的吸收、代谢作用去除水体中有机物和氨氮，与物化技术相比具有投资低、不易产生二次污 染等优点，是处理溶解态污染物较为经济有效的方式。但由于养殖海水污染物负荷低和存 在的功能菌数目少，造成菌体与污染物不能有效的聚集，故发挥不出良好的反应效果。
[0004] 中国发明专利"海水养殖废水反硝化净化方法"（
【申请人】:大连水产学院，申请号： 200810230123.9)和中国发明专利"海水微生物絮凝剂的制备方法"（
【申请人】：国家海洋局， 申请号：201010247147.2)公开了养殖海水的生物处理方法，但存在着效果单一、规模化应 用困难和生产周期长、处理剂用量大的不足。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有方法的缺陷和满足养殖海水规模化高效生物净化的市 场需求，提供一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法。该方法W克雷伯氏菌LDX1-1 和野油菜黄单抱菌CICC10258的混合菌种，采用无括抗兼容性摇瓶与高儀发酵培养基发酵 协同发酵，发酵完成后采用混合盐进行凝胶化强度处理。该制备方法发酵速度快，工艺易于 操作，发酵浓度高，生产成本低。生产的絮凝剂用于处理高盐度高浮力海水具有结构稳定， 絮块致密，沉降速度快的特点，对养殖海水净化具有显著效果。
[0006] 本发明的技术方案是:一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是，
[0007] (1)生产菌种的扩大培养
[000引斜面菌种培养：将克雷伯氏菌LDX1-UCGMCC No. 11330)、野油菜黄单抱菌 CICC10258，分别接种斜面培养基，24-32 °C各培养24-4化；
[0009] 摇瓶菌种扩大培养:将上述克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄单抱菌CICC10258斜面菌 苔分别接种摇瓶培养基，揽匀，24-3(TC培养10-18h，分别得到克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄 单抱菌CICC10258摇瓶扩大培养液体菌种备用；
[0010] (2)发酵培养(高浓度儀盐发酵）
[0011] 将发酵培养基按体积比1.5%-4.0%的接种量接种克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄 单抱菌CICC10258混合摇瓶扩大培养液体菌种(两菌种体积比为5-7:3-5)，采取高浓度儀 盐、双菌种协同发酵，发酵时间为20-3化；
[0012] (3)发酵液处理(凝胶化）
[OOU] 将发酵液过滤去除菌体及其它杂质，加入混合盐(NaCl 85%+CaCl2 15%)至终浓 度为1.0%-3.0%，升溫至50-80°C，维持15-30min后将溫度快速降至17-30°C，得到液体微 生物絮凝剂。
[0014] 将液体微生物絮凝剂加入1.5-2.5倍体积的乙醇(浓度>90%)醇沉，得沉淀;将沉 淀用离屯、机离屯、，乙醇洗涂后再经真空干燥至水分小于5%，用粉碎机粉碎后，得到固体微 生物絮凝剂。发酵制备的微生物絮凝剂经测定分析，发酵产量>2.4% (即>2知絮凝剂/L发 酵液），絮凝率>93%。
[0015] 各培养基成分如下：
[0016] 克雷伯氏菌化lebsilla sp.)LDXl-l斜面培养基：薦糖10-15旨几，畑4^3 1.5- 2.5g/L，K2HP〇4 0.8-1.3g/L，MgS〇4 0.2-0.9g/L，NaCl 0.3-0.8g/L，FeS〇4 0.01-0.03g/L， 琼脂粉1.5%。
[0017] 野油菜黄单抱菌(《日111:11〇1]1〇]1日3。日1119日3化13)〔1〔〔10258斜面培养基：蛋白腺3-7邑/ L，牛肉膏2-5g/L，氯化钢3-7g/L，琼脂粉1.5 %。
[001引摇瓶培养基：（薦糖60% +葡萄糖40% ) 10-20g/L，混和氮源(NH4N03 55% + ((畑4) 2S04 45%)2.1-4.Og/L，K2HP04 0.8-1.5g/L，MgS04 0.4-1.Og/L，化C1 0.3-0.9g/LJeS04 0.01-0.03g/L0
[0019] 发酵罐培养基：薦糖25-40g/L，玉米淀粉12-25g/L，混和氮源（NH4NO3 55% + ((NH4)2S04 45%)2.0-3.9g/L，K2册〇4 0.8-1.5g/L，MgS〇4 7-18g/L，化C1 0.3-1.0g/L， FeS〇4 0.01-0.04g/L，MnS〇4 0.01-0.05g/L。其中硫酸儀按总量20%、35%、45% 的比例分别 在配制发酵培养基时、发酵培养化和发酵培养化时Ξ个时间段加入培养基中。
[0020] 所述步骤(2)发酵罐控制的条件为:无菌空气通风比为0.25-0.7VVM，揽拌转速为 120-350r/min，发酵溫度为24-32°C，罐压为0.01-0.03MPa。
[0021] 该微生物絮凝剂的使用方法为：W适当的浓度按需要量在同时混合的条件下直接 加入养殖海水、藻类细胞培养液、污染海水等中。
[0022] 针对养殖海水:微生物絮凝剂使用量(干重)为每吨水3-6g，SS絮凝率>91%。
[0023] 针对藻类细胞培养液:微生物絮凝剂使用量(干重)为每吨水4-7g，藻细胞回收率 >93%。
[0024] 本发明的技术效果是：
[0025] (1)本发明采用无括抗兼容性摇瓶培养基与发酵培养基，适合克雷伯氏菌LDX1-1 和野油菜黄单抱菌CICC10258混合菌种生长。本发明采用高儀发酵促进酷基化，基团修饰， 结构改造，乙酷化程度明显提高。本发明采用混合盐凝胶化强度处理，提高了产品的絮凝沉 降速度。
[0026] (2)相比克雷伯氏菌LDX1-1单菌发酵，本发明采用克雷伯氏菌LDX1-1和野油菜黄 单抱菌CICC10258混合菌种发酵，产量提高20%，絮凝率提高8%，产品乙酷化取代度提高 110%，稳定性和凝胶化程度提高，产品絮凝沉降速度加快了 13%。
[0027] (3)本发明混合发酵制备微生物絮凝剂的方法具有工艺合理;生产成本低，可进行 大规模生产;发酵周期短(《30h)，发酵产率高(产率> 2.4 % )和产品絮凝率高（> 93 % )，对 海水净化有显著效果的优点。应用于循环养殖海水处理SS絮凝率>91%;应用于海水养殖 藻液藻细胞回收，回收率>93%，具有广阔的开发前景和很好的应用价值。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合具体实施例对本发明的微生物絮凝剂的制备方法和使用效果进行详细 阐述，W使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范 围做出更为清楚明确的界定。本发明所使用的克雷伯氏菌化lebsilla SP. )LDX1-1菌株由 青岛耀东生物工程有限公司提供(专利申请号：201510656846.5,发明名称:一株克雷伯氏 菌及用它制备微生物絮凝剂的方法）。本发明所使用的野油菜黄单抱菌（Xanthomonas compestris)CICC10258购自中国工业微生物菌种保藏管理中屯、(CICC)。
[0029] 微生物絮凝剂絮凝率的测定为：用海水配制质量浓度为0.4%的高岭±悬液和 10%的化C12溶液，备用。在六联揽拌仪的反应杯中加入体积比98%高岭±悬液、2%化C12 溶液，混匀，制成絮凝体系备用。测定时每lOOmL絮凝体系加入适量絮凝剂，W12化/min的揽 拌转速快速混合40s，然后再W60r/min的揽拌转速缓慢混合120s。静止5min。吸取上清液， 测定波长550nm下的0D值B。加蒸馈水替代发酵液重复W上操作测得0D值A。絮凝率={(A- B)/A}X 100%。对样品进行处理时，在絮凝体系中用样品代替高岭±悬液，其他操作步骤与 微生物絮凝剂絮凝率的测定相同。
[0030] 实施例1微生物絮凝剂制备生产菌种的扩大培养
[0031] (1)生产菌种的扩大培养
[0032] ①培养基
[0033] 克雷伯氏菌化 lebsilla sp.)LDXl-l 斜面培养基：薦糖 12g/L，NH4N〇3 1.5g/L， K2HPO4 1.0g/L，MgS〇4 0.4g/L，NaCl 0.3g/L，FeS〇4 O.Olg/L，琼脂粉 1.5%。
[0034] 野油菜黄单抱菌(Xanthomonas campeshis)CICC10258斜面培养基：蛋白腺5g/L， 牛肉膏3g/L，氯化钢5g/L，琼脂粉1.5 %。
[0035] 摇瓶培养基：（薦糖60%+葡萄糖40%)15g/L，混和氮源(NH4NO3 55% + ((NH4)2S04 45%)3g/L，K2HP〇4 1.2g/L，MgS〇4 0.6g/L，NaCl 0.3g/L，FeS〇4 O.Olg/L。
[0036] ②接种及培养
[0037] 斜面菌种培养：将克雷伯氏菌LDXl-UCGMCC No. 11330)、野油菜黄单抱菌 CICC10258，分别接种斜面培养基，24-32Γ培养24-4化，至斜面菌种生长旺盛；
[0038] 摇瓶菌种扩大培养:将上述克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄单抱菌CICC10258斜面菌 苔分别接种摇瓶培养基，揽匀，24-3(TC培养10-1化，当菌体形态均一，生长数量达到要求时 (2-5 X 108个活菌/mU分别得到克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄单抱菌CICC10258摇瓶扩大培 养液体菌种备用。
[0039] 实施例2微生物絮凝剂发酵
[0040] (1)发酵培养(高浓度儀盐发酵）
[0041 ] 发酵罐培养基：薦糖26g/L，玉米淀粉15g/L，混和氮源(NH4NO3 55% + ((NH4)2S04 45%)2.7g/L，K2HP〇4 l.lg/L，MgS〇4 10g/L，NaCl 0.3，FeS〇4 0.015g/L，MnS〇4 0.03g/L。
[0042] 将发酵培养基按体积比2.2%的接种量接种克雷伯氏菌LDXl-1、野油菜黄单抱菌 CICC10258混合摇瓶扩大培养液体菌种(混合摇瓶扩大培养液体菌种中克雷伯氏菌LDX1-1、 野油菜黄单抱菌CICC10258扩大培养液体菌种体积比为6:4)。发酵采取高浓度儀盐发酵，把 发酵所需量的硫酸儀按总量20%、35%、45%的比例分别在配制发酵培养基时、发酵培养化 时和发酵培养9h时加入培养的发酵罐中。发酵罐控制的条件为：无菌空气通风比为 0.28晋1，揽拌转速为15化/111111，发酵溫度27°(：，罐压为0.0151?曰，发酵时间为2她。
[0043] (2)发酵液处理(凝胶化）
[0044] 将发酵液过滤去除菌体及其它杂质，加入混合盐(NaCl 85%+化Cl2 15%)至终浓 度为2.1 %，升溫至65°C，维持23min;然后将溫度快速降至20°C，制得海水用液体微生物絮 凝剂。
[0045] 实施例3:生产固体微生物絮凝剂
[0046] 实施例1的液体微生物絮凝剂在70r/min充分揽拌下加入2.0倍体积的95%(V/V) 乙醇，得沉淀，将沉淀用离屯、机离屯、8min，将所得固形物用90% (V/V)乙醇充分洗涂，将含醇 固形物用真空干燥器在真空度-0. 〇7Mpa，42 °C下干燥至水分小于5 %，用粉碎机粉碎成80目 粉状。产量为2.6%，絮凝率>93%。
[0047] W采用克雷伯氏菌LDX1-1进行单菌发酵制备絮凝剂（采用专利申请 201510656846.5实施例2中的方法)进行对比，结果如表1所示。
[0048] 表1本发明与克雷伯氏菌LDX1-1单菌发酵的产品效果对比
[0049]
[0050] 从表1可W看出：本发明的发酵产量比克雷伯氏菌LDX1-1单独发酵提高20%;在海 水中盐度效应下絮凝率>93%，比之LDX1-1单独发酵产品提高8%;产品乙酷化取代度为 38%，比之LDX1-1单独发酵提高110%，常溫下产品的稳定性由7天提高到21天；由于凝胶化 程度提高，产品絮凝沉降速度（絮块沉到lOOmL量筒底部的时间）比LDX1-1单一发酵加快了 13%。
[0051] 实施例4微生物絮凝剂的应用
[0052] (1)对中国科学院海洋研究所试验基地循环养殖海水按构建的净化系统进行处 理，制备的微生物絮凝剂使用量(干重)为每吨水3-6g，SS絮凝率>91%，C0D去除率>81%， 微生物去除率>72 %。
[0053] (2)对青岛即墨海水养殖藻液按构建的回收系统进行的藻细胞絮凝回收，添加的 微生物絮凝剂干重为每吨水4-7g，藻细胞回收率>93%，回收的藻细胞浓缩25倍。
[0054] 实施例5微生物絮凝剂发酵
[0055] (1)发酵培养
[0056] 发酵罐培养基：同实施例2。
[0057] 将发酵培养基按体积比2.5%的接种量接种克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄单抱菌 CICC10258混合摇瓶扩大培养液体菌种(混合摇瓶扩大培养液体菌种中克雷伯氏菌LDX1-1、 野油菜黄单抱菌CICC10258扩大培养液体菌种体积比为6.5:3.5)。发酵采取高浓度儀盐发 酵，把发酵所需量的硫酸儀按总量20%、35%、45%的比例分别在配制发酵培养基时、发酵 培养化时和发酵培养化时加入培养的发酵罐中。发酵罐控制的条件为:无菌空气通风比为 0.30晋1，揽拌转速为12化/111111，发酵溫度28°(：，罐压为0.0151?曰，发酵时间为27}1。
[0058] (2)发酵液处理(凝胶化）
[0化9] 将发酵液过滤去除菌体及其它杂质，加入混合盐(NaCl 85%+化Cl2 15%)至终浓 度为2.3%，升溫至62°(：，维持25111111;然后将溫度快速降至18°(：，制得海水用液体微生物絮 凝剂。按照实施例3的步骤可W进一步制备成固体微生物絮凝剂。
[0060] 实施例6微生物絮凝剂发酵
[0061] (1)发酵培养
[0062] 发酵罐培养基:同实施例2。
[0063] 将发酵培养基按体积比2.0%的接种量接种克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄单抱菌 CICC10258混合摇瓶扩大培养液体菌种(混合摇瓶扩大培养液体菌种中克雷伯氏菌LDX1-1、 野油菜黄单抱菌CICC10258扩大培养液体菌种体积比为5.5:4.5)。发酵采取高浓度儀盐发 酵，把发酵所需量的硫酸儀按总量20%、35%、45%的比例分别在配制发酵培养基时、发酵 培养化时和发酵培养化时加入培养的发酵罐中。发酵罐控制的条件为:无菌空气通风比为 0.25VVM，揽拌转速为2(K)r/min，发酵溫度27 °C，罐压为0.015MPa，发酵时间为30h。
[0064] (2)发酵液处理(凝胶化）
[00化]将发酵液过滤去除菌体及其它杂质，加入混合盐(化C1 85%+化C12 15%)至终浓 度为2.0%，升溫至67°C，维持21min;然后将溫度快速降至20°C，制得海水用液体微生物絮 凝剂。按照实施例3的步骤可W进一步制备成固体微生物絮凝剂。
【主权项】
1. 一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是， (1) 生产菌种的扩大培养 斜面菌种培养:将克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄单孢菌CICC10258,分别接种斜面培养 基，24-32 °C 各培养24-48h; 摇瓶菌种扩大培养:将上述克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄单孢菌CICC10258斜面菌苔分 别接种摇瓶培养基，搅匀，24-30 °C培养10_18h，分别得到克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄单孢 菌CICC10258摇瓶扩大培养液体菌种备用； (2) 发酵培养 将发酵培养基按体积比1.5 % -4.0 %的接种量接种克雷伯氏菌LDX1-1、野油菜黄单孢 菌CICC10258混合摇瓶扩大培养液体菌种进行发酵，发酵时间为20-30h;所述克雷伯氏菌 LDX1-1、野油菜黄单孢菌CICC10258混合摇瓶扩大培养液体菌种中，二种菌种的体积比为5-7：3-5； (3) 发酵液处理 将发酵液过滤去除菌体及其它杂质，加入混合盐至终浓度为1.〇%_3.0%，升温至50-80°C，维持15-30min后将温度快速降至17-30°C，得到液体微生物絮凝剂;所述混合盐为:按 质量比计，NaCl 85%+CaCh 15%; 所述摇瓶培养基为：混合碳源10_20g/L，混和氮源2.1-4. Og/L，K2HP〇4 0.8-1.5g/L， MgS〇4〇 · 4-1 · Og/L，NaCl 0 · 3-0 · 9g/L，FeS〇4 0 · 01-0 · 03g/L;所述混合碳源为:按质量比，蔗 糖60%+葡萄糖40%;所述混和氮源为:按质量比，NH4N03 55% + (NH4)2S〇4 45%; 所述发酵培养基为：蔗糖25-40g/L，玉米淀粉12-25g/L，混和氮源2.0-3.9g/L， K2HP〇4〇.8-1.5g/L，MgS〇4 7-18g/L，NaCl 0.3-1.0g/L，FeS〇4 0.01_0.04g/L，MnS〇4 0.01- 0.05g/L;所述混和氮源为:按质量比，NH4N03 55% + (NH4)2S〇4 45%。2. 如权利要求1所述的一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是，上述 液体微生物絮凝剂加入1.5-2.5倍体积的乙醇醇沉，得沉淀;将沉淀用离心机离心，乙醇洗 涤后再经真空干燥至水分小于5%，用粉碎机粉碎后，得到固体微生物絮凝剂。3. 如权利要求1或2所述的一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是， 所述发酵培养基中的硫酸镁按总质量20%、35%、45%的比例分别在配制发酵培养基时、发 酵培养6h和发酵培养9h时三个时间段加入培养基中。4. 如权利要求1或2所述的一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是， 所述步骤(2)发酵控制的条件为：无菌空气通风比为0.25-0.7VVM，搅拌转速为120-350r/ min，发酵温度为24-32 °C，罐压为0 · 01-0 · 03MPa。5. 如权利要求1或2所述的一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是， 所述克雷伯氏菌LDX1-1斜面培养基为：蔗糖1〇-158/1，順4觀 31.5-2.58/1，1(2冊〇4〇.8-1.3g/L，MgS〇4 0.2-0.9g/L，NaCl 0.3-0.8g/L，FeS〇4 0.01-0.03g/L，琼脂粉 1.5%。6. 如权利要求1或2所述的一种养殖海水净化用微生物絮凝剂的制备方法，其特征是， 所述野油菜黄单孢菌CICC10258斜面培养基为:蛋白胨3-7g/L，牛肉膏2-5g/L，氯化钠3-7g/ L，琼脂粉1.5%。7. 权利要求1-6中任意一项所制备的微生物絮凝剂。8. 权利要求7所述的微生物絮凝剂在净化养殖海水、藻类细胞培养液或污染海水中的 应用。
【文档编号】C02F103/20GK106011215SQ201610592127
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】栾兴社, 姜国辉
【申请人】日照清水源生物科技有限公司