一种利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法
【专利摘要】本发明公开一种利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，属于发酵工业领域。包括如下步骤：将特氏杜氏藻细胞加入培养液中，培养，培养过程中测定藻液的光密度，待OD630达到1.2～1.4时加入阻断剂三乙胺50～250ppm，继续培养至稳定期，然后测试油脂含量。本发明在简单添加表观遗传试剂三乙胺的条件下能够明显干扰特氏杜氏藻的代谢，出现大量积累油脂的现象，即能明显提高特氏杜氏藻的油脂含量，是一种非常简单又行之有效的提高油脂的方法；提高微藻油脂含量对其作为生物柴油的原材料有非常重要的意义。
【专利说明】
一种利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法
技术领域
[0001]本发明属于发酵工业领域。具体涉及一种利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法。
【背景技术】
[0002]杜氏藻属(Dunaliella)是一类单细胞、有鞭毛、无细胞壁的绿藻，包括约28个种，如Dunaliella bardawil、Dunaliella tert1lecta、Dunaliella salina等。杜氏藻所具有的耐盐渗透调节机制，使它能够在盐度范围为0.5M?4.5M的环境中生长。其中，D.tert1lecta被称为是最耐盐的真核藻类，它的高耐盐性可以减少杂菌污染，增大了室外培养的可能性。
[0003]生物柴油是一种可再生、可生物降解、无毒的生物燃料。它是生物来源的甘油三酯(TAGs)和自由脂肪酸(FFAs)通过酯交换反应生成的，与传统石油燃料相比，生物柴油在燃烧过程中释放出低水平的环境污染物如挥发性的有机化合物、颗粒物和硫化物。与其他生物柴油原料相比，微藻在生物柴油的生产中具有很多优势。微藻合成的脂肪可以分为储存脂质(非极性脂肪)和结构脂质(极性脂肪)，含有饱和性和不饱和性脂肪酸，所含有的十八烯(18:1)、棕榈(16:0)、硬脂(18:0)和亚麻酸(18:2)能生产出高质量的燃料，这使微藻油脂成为理想的生物柴油原料。
[0004]杜氏藻缺乏细胞壁的包裹，这不仅使提取工艺变的简单，而且还易于对它进行基因操作。目前，在生物柴油领域已有一些关于杜氏藻的研究，以D.tert1lecta藻种为材料的研究最为广泛，它被许多研究者认为是一类非常具有发展潜力的生物能源藻种。
[0005]当前提高微藻油脂含量的研究主要有:生化调控方法和基因、代谢调控方法。前者主要研究中卓有成效的包括氮元素缺乏胁迫，磷元素缺乏胁迫、盐度胁迫、光强度胁迫、紫外辐射、温度胁迫、PH和重金属胁迫等。基因和代谢调控包括:提高脂肪酸、甘油三磷酸的合成、三酰甘油合成相关路径的调控、阻断竞争途径等。当前，表观基因遗传试剂的应用对于提高油脂积累量具有操作简单、效果显著等特点，对于利用微藻作为生物柴油原料的产业应用具有现实意义。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法。该方法实现了利用特氏杜氏藻生产生物柴油的进步。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0008]—种利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，包括如下步骤:
[0009]将特氏杜氏藻细胞加入培养液中，培养，培养过程中测定藻液的光密度(0D值)，待OD63q达到1.2?1.4时加入阻断剂三乙胺，继续培养至稳定期(约4?6d)，然后测试油脂含量。
[0010]所述的培养的条件为:在光照度为6000LX，光暗周期为14h:10h，温度为26°C，以转速50r/min的转速震荡培养。
[0011]所述的阻断剂三乙胺的加入量为50?250ppm，优选为50?150ppm;更优选为10ppm0
[0012]所述的测量油脂含量的方法为:取适量藻液(细胞数含量>10,000)，3000rpm离心5min，用新鲜培养液洗涤两次；加I?2yL ImM Bodipy505/515(0.1 %DMSO，v/v)染液，摇匀后放入37°C培养箱染色10?15min。
[0013]所述的培养液为:配制特氏杜氏藻基本培养液，向基本培养液中加入A5微量元素溶液，调节PH，灭菌、冷却至室温，得到培养液。
[0014]所述的特氏杜氏藻基本培养液，其成分为:NaNO3为0.420g/L，NaCl87.69g/L，NaH2PO4.2H20 为 0.156g/L，NaHC03 为 0.840g/L，KCl 为 0.074g/L，MgS04.7H20为 I.230g/L，CaCl2.2H20为0.044g/L，0.l%EDTA铁0.5mL/L，调pH至7.5。
[0015]所述的A5微量元素溶液，其成分如下:H3BO3为286 ,MnCl2.4H20为181，ZnS04.7H20为22，CuS04.5H20为7.9，(ΝΗ4)6Μθ7θ24.4Η20为3.9，单位均为mg/100mL，加入的量为lmL/L。
[0016]所述的灭菌的条件为:压力102.9kPa，温度121°C，时间20?25min。
[0017]本发明的藻种来源:
[0018]所涉及的特氏杜氏藻(Dunaliella tert1lecta FACHB-821)购于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(湖北武汉)，并采用液体培养基弱光保存。
[0019]荧光分光光度计测试藻液油脂含量，表明加入阻断剂前后油脂含量有一个明显激增的变化，并于对数后期时达到最大值，其中加入三乙胺的量在10ppm时，油脂积累量最尚O
[0020]本专利的发明效果在于:加入三乙胺后能够明显干扰特氏杜氏藻的代谢，出现大量积累油脂的现象，是一种新的提高特氏杜氏藻油脂含量的方法。
[0021]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0022](I)特氏杜氏藻是属于真核自养微生物，被称为是最耐盐的藻类，它的高耐盐性可以减少杂菌污染，适于室外培养。
[0023](2)特氏杜氏藻缺乏细胞壁，油脂易于提取。提高其油脂含量对特氏杜氏藻作为生物柴油生产原料的发展非常有益。
[0024](3)本发明在简单添加表观遗传试剂的条件下即能明显提高特氏杜氏藻的油脂含量，是一种非常简单又行之有效的提高油脂的方法。
[0025](4)本发明为提高特氏杜氏藻油脂含量提供一种新方法，提高微藻油脂含量对其作为生物柴油的原材料有非常重要的意义。
【附图说明】
[0026]图1是加入三乙胺后，对照组和各实验组的生长趋势。
[0027]图2是加入三乙胺后，对照组和各实验组的叶绿素a的变化趋势。
[0028]图3是加入三乙胺后，对照组和各实验组的叶绿素b的变化趋势。
[0029]图4是加入三乙胺后，对照组和各实验组的类胡萝卜素的变化趋势。
[0030]图5是稳定期测量的对照组和各实验组的荧光强度结果。
[0031 ]图6是计算过后对照组和各实验组平均荧光强度。
【具体实施方式】
[0032]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0033]实施例中所涉及的特氏杜氏藻(Dunaliella tert1lecta FACHB-821)购于中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库(湖北武汉)，并采用液体培养基弱光保存。
[0034]实施例1
[0035](I)特氏杜氏藻培养液配制
[0036]配制盐藻培养液:NaNO30.420g/L，NaCl 87.69g/L, NaH2PO4.2H20 0.156g/L，NaHCO3 0.840g/L，KCl 0.074g/L,MgSO4.7H20 I.230g/L，CaCl2.2H20 0.044g/L,0.1 %EDTA铁0.5mL/L。向培养液中加入A5微量元素溶液lmL/L，调pH至7.5 <^5微量元素溶液，其成分如下= H3BO3 286,MnCl2.4H20 181, ZnSO4.7H20 22, CuSO4.5H20 7.9, (NH4)6Mo7O24.4H203.9，单位均为11^/100111匕盐藻培养液按1001^每瓶分装至5001^的三角瓶中，四层纱布封口，在102.9kPa大气压下121°C高温灭菌20min。室温冷却后使用。
[0037](2)接种培养
[0038]将处于对数生长期的藻液于5000r/min下离心lOmin，弃除培养液，按1%的接种量将藻细胞加入装有新鲜培养液的三角瓶中，用四层纱布包裹瓶口。将三角瓶置于光照培养箱中，在光照度为6000Lx(光暗周期为14h:1Oh)，温度为26°C，以转速50r/min的转速震荡培养。培养过程中用分光光度计测定藻液的光密度(0D值)，当其OD63q达到1.2左右时加入三乙胺O、50、100、150、200 和 250ppm，继续培养4 ?6天。
[0039](3)油脂的提取
[0040]取稳定期的适量藻液(细胞数含量>10，000)，3000印111离心51^11，用新鲜培养液洗涤两次；加I?2yL ImM Bodipy505/515(0.l%DMS0，v/v)染液，摇匀后放入37°C培养箱染色1min。使用荧光分光光度计测量荧光强度。
[0041](4)油脂含量测定
[0042]利用荧光分光光度来测定油脂的含量
[0043]操作条件:激发波长488nm，发射波长设定490?520nm，507nm处为荧光强度波峰。比较507nm处的荧光强度来判定各浓度三乙胺对油脂产量积累的影响。加入三乙胺使荧光强度显著增高，浓度为10ppm时，油脂积累量最大。
[0044]结论
[0045]当其0D63Q达到1.2左右时加入三乙胺Oppm(空白对照)、50ppm、lOOppm、150ppm、200ppm、250ppm，继续培养，藻细胞的生长趋势如图1所示，叶绿素a的变化趋势如图2所示，叶绿素b的变化趋势如图3所示，类胡萝卜素的变化趋势如图4所示，稳定期测量的荧光强度(总油脂积累量)结果如图5所示，平均荧光强度(单细胞油脂量)结果如图6所示。表明:加入三乙胺使荧光强度显著增高，浓度为10ppm时，油脂积累量最大。
[0046]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于包括如下步骤: 将特氏杜氏藻细胞加入培养液中，培养，培养过程中测定藻液的光密度，待OD63Q达到1.2?1.4时加入阻断剂三乙胺，继续培养至稳定期，然后测试油脂含量。2.根据权利要求1所述的利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于:所述的阻断剂三乙胺的加入量为50?250ppm。3.根据权利要求1所述的利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于:所述的阻断剂三乙胺的加入量为50?150ppm。4.根据权利要求1所述的利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于:所述的阻断剂三乙胺的加入量为lOOppm。5.根据权利要求1所述的利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于:所述的培养的条件为:在光照度为6000Lx，光暗周期为14h:10h，温度为26°C，以转速50r/min的转速震荡培养。6.根据权利要求1所述的利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于:所述的测量油脂含量的方法为:取适量藻液，3000rpm离心5min，用新鲜培养液洗涤两次;加I?2yL ImM Bodipy505/515染液，摇匀后37°C染色10?15min; 所述的适量藻液为细胞数含量> 10，000; 所述的Bodipy505/515中含有0.1 %DMS0。7.根据权利要求1所述的利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于:所述的培养液为:配制特氏杜氏藻基本培养液，向基本培养液中加入A5微量元素溶液，调节PH，灭菌、冷却至室温，得到培养液。8.根据权利要求7所述的利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于:所述的特氏杜氏藻基本培养液，其成分为:NaNO3为0.420g/L，NaCl 87.69g/L，NaH2PO4.2H20 为 0.156g/L，NaHC03 为 0.840g/L，KCl 为 0.074g/L，MgS04.7H20为 I.230g/L，CaCl2.2H20为0.044g/L，0.l%EDTA铁0.5mL/L，调pH至7.5。9.根据权利要求7所述的利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于:所述的A5微量元素溶液，其成分如下= H3BO3为286 ,MnCl2.4H20为181，ZnS〇4.7H20为22，CuS04.5H20为7.9，(ΝΗ4)6Μθ7θ24.4Η20为3.9，单位均为mg/100mL，加入的量为lmL/L010.根据权利要求7所述的利用阻断剂干扰特氏杜氏藻代谢使其大量积累油脂的方法，其特征在于:所述的灭菌的条件为:压力102.9kPa，温度121°C，时间20?25min。
【文档编号】C12R1/89GK106011189SQ201610566716
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】姜建国, 薛璐璐, 周思思
【申请人】华南理工大学