2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用

2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种2?苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用。本发明利用重组酶ARO8、ARO10和ADH1这三种重组酶构成共反应体系，将微生物体内Ehrlich途径需要多步连续反应、多种酶参与才能合成2?苯乙醇这样复杂的代谢过程，简化为在体外的同一反应体系内进行，从而减少了环境污染、缩短了反应流程。进一步地，本发明采用戊二醛作为交联剂，将三种重组单酶进行无载体共固定化，制备共交联酶聚集体(Combi?CLEAs)，体外合成目标产物，从而在上述有益效果的基础上进一步实现酶的循环使用，降低生产成本，本发明填补了多酶体外制备2?苯乙醇的技术空白，为生物制备2?苯乙醇提供重要的借鉴。
【专利说明】
2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明设及生物合成技术领域，更具体地，设及一种2-苯乙醇的非细胞合成生物 学制备方法及应用。
【背景技术】
[0002] 2-苯乙醇（2斗116]17161:11日]1〇1,2斗6)又称0-苯乙醇（0斗116]17161:11日]1〇1)，化学名2- 苯基乙醇（2-Phenylethyl alcohol，2-PEA)，分子量 122.16，结构式为：
[0003]
[0004] 2-苯乙醇是一种具有淡雅细腻玫瑰气味的芳香醇，天然存在于许多植物的精油 中，2-苯乙醇香气轻柔甜和，颇受人们欢迎，是目前全球使用量仅次于香兰素的第二大香料 成分，广泛应用于食品、化妆品、烟草和日化用品领域，它不仅是所有玫瑰香型香气的基本 组分，而且因其具有协合及增效作用，成为多种香型配方所需的组分，是具有很高价值的香 料物质;在医药上，2-苯乙醇是传统的抑菌剂。
[0005] 目前，全球2-苯乙醇的年产量近万吨，基本上都是采用廉价的化工原料苯或苯乙 締化学合成，仅有很少一部分从玫瑰油中提取。化学合成所使用的原料大多对人体健康和 环境有巨大危害，而且所合成的产品2-苯乙醇中常含有气味不良、难W除去的杂质，如联二 苯、β-氯代乙苯、氯乙醇等，严重影响产品质量。随着消费观念的改变，人们越来越崇尚"绿 色"、"天然"的食品和添加剂。在欧美国家，能被标记为"天然"的调味剂和芳香剂必须是采 用物理方法从天然材料中提取和酶催化或微生物发酵法生产的。若从玫瑰中提取天然2-苯 乙醇，每5t玫瑰鲜花仅能萃取玫瑰精油化g，生产成本极其昂贵，无法大规模生产。国际上天 然2-苯乙醇基本都是W微生物转化k苯丙氨酸生产，主要集中在法国、德国、日本等发达国 家，但生产量远不能满足消费需求。
[0006] 2-苯乙醇的一个重要的生产途径是采用微生物发酵，该途径方法原料和合成过程 绿色环保、反应条件溫和、产物安全、生产周期短、可大规模生产。微生物菌体内2-苯乙醇的 生物合成有Ξ条途径:第一条途径是从头合成的莽草酸途径，广泛存在于微生物体内，但代 谢途径长、支路多、存在多种抑制，2-苯乙醇产量极低;第二条是心苯丙氨酸脱簇生成苯乙 胺、去氨基还原生成2-苯乙醇，此途径较少发生;第Ξ条是化rl ich途径，心苯丙氨酸通过转 氨作用生成苯丙酬酸、再脱簇形成苯乙醒、最后还原生成2-苯乙醇。Ehrlich途径是微生物 合成2-苯乙醇的首选途径，是分别在芳香族氨基转氨酶、苯丙酬酸脱簇酶和醇脱氨酶巧中酶 的作用下进行的，研究者们已在基因水平上对其进行了深入的研究，重点研究编码巧巾酶的 结构基因及其转录和调控方式。
[0007] 生物界所有物质代谢都由多酶共同作用来完成，运些不同的酶能高度有序地自组 装形成多酶复合体(multienzyme complexes，MECs)参与反应，通过提高中间产物在不同酶 之间的转运浓度，实现高效催化化opez-Gallego et al.,2010;Schoffelen et al.,2012; Zhang, 2011)。但是多酶共反应后存在酶分离回收困难、重复利用率低、稳定性较差等问题， 也存在2-苯乙醇的产量一直较低，成本增加，香气品质受到影响等较多缺点。
[0008] 目前尚未发现多酶体外制备2-苯乙醇的相关研究和文献报道。

【发明内容】

[0009] 本发明要解决的技术问题是针对现有2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备技术的 不足，拟利用多酶复合体高效催化的运一优点，在体外人工制备多酶反应体系，即将高效表 达化rlich途径的巧巾酶巧巾重组酶置于一个适宜的反应体系中，构建巧巾重组酶体外共反应 制备2-苯乙醇的最优反应体系，不经过生物体内复杂的代谢系统，直接体外制备目标产物 2-苯乙醇，建立一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法。
[0010] 本发明的目的通过W下技术方案予W实现：
[0011] 提供一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，是在同一反应体系内通过重组 转氨酶IAR08、苯丙酬酸脱簇酶AR010和醇脱氨酶ADH1组成的共催化体系催化转化，1^-苯丙 氨酸经由苯丙酬酸、苯乙醒，转化为2-苯乙醇;其中，所述反应体系内，是心苯丙氨酸和草酷 乙酸为底物，重组酶 AR08、AR010 和 ADH1 按酶活力 ^1:0.25:1、1:1:1、1:0.5:1 或 1:0.25:2 (U/U/U)配比确定，加入量为10化L，在pH值为5.5~7.5、Mgh浓度为1.0~5mM的反应体系中， 水浴溫度为30~40°C条件下，反应转化4~7min后，W等体积的乙腊终止反应，即制得2-苯 乙醇。
[0012] 本发明创造性地总结得到由重组芳香族转氨酶I、苯丙酬酸脱簇酶和醇脱氨酶组 成的游离多酶体系，能苯丙氨酸和草酷乙酸为底物，体外制备2-苯乙醇，具有催化效率 高、操作简单、不需提纯中间产物等优点。
[0013] 在所述游离多酶体系条件下，优选k苯丙氨酸和草酷乙酸地摩尔比为0.75:1。
[0014] 优选AR08、AR010和A畑1W1:0.25: UU/U/U)配比。优选Mgh浓度为 1.0~2.5mM;进 一步优选为1.5mM。优选地，水浴溫度为33~40°C ;进一步优选为37°C，优选在37°C水浴反应 5min。优选地袖值为5.5~6.5;进一步优选地，所述抑值为6。最优选地，在所述游离多酶体 系条件下，所述k苯丙氨酸和草酷乙酸的摩尔比为0.75:1，重组酶AR08、AR010和AD化按酶 活力W1:0.25:1配比，加入量为lOOyL，pH值6.0、Mgh浓度为1.5mM，37°C水浴5min后W等体 积的乙腊终止反应即得。
[0015] 所述多酶体系在实际应用中还未能完全解决中间体性质不稳定引起的产率不够 高、反应后酶分离回收存在一定困难，重复利用率低，稳定性较差等不足，为进一步完善本 发明技术方案，本发明进一步将所述巧中重组酶同时固定在同一个载体中，提高酶的稳定性 和重复利用率，增加反应的局部浓度W提高产品的得率。在实际研究试验过程中，只有科学 确定酶作用的最适溫度、最适pH、酶的共固定化比例、固定化次序等各个因素的作用效果和 机制W及相互之间影响制约的规律和关系，才能总结出所述3中重组酶的共固定化技术方 案。
[0016] 因此本发明提供一种优选的技术方案是先将所述重组转氨酶IAR08、苯丙酬酸脱 簇酶AR010和醇脱氨酶ADH1通过共固定方法制得共催化体系Combi-化EAs，然后利用Combi- 0^43对心苯丙氨酸进行催化转化，经由苯丙酬酸、苯乙醒，转化为2-苯乙醇。
[0017] 在共固定技术方案条件下，其中，所述反应体系内，是^心苯丙氨酸和草酷乙酸为 底物，优选抑值为5.0、Mgh浓度为1.0~5mM，水浴溫度为40°C，反应转化时间为5min。
[0018] 所述共催化体系Combi-化EAs的制备方法为：将AR08、AR010和ADHl按照1:1:1、1: 0.5:1或1:0.25:1配比后，经沉淀剂硫酸锭沉淀后形成多酶聚集体，加入戊二醒对多酶聚集 体进行交联，制得多酶共固定体系;其中，硫酸锭的饱和度为60~90%，pH值为4~6,戊二醒 的加入量按照其终浓度为0.05~0.25 % (V/V)确定。
[0019]优选地，沉淀剂硫酸锭的饱和度70%。优选地，沉淀剂硫酸锭的pH值为5优选地， AR08、AR010和ADH1的酶配比为1: 0.5 :1。优选地，所述戊二醒的加入量按照其终浓度为 0.1%(V/V)确定。优选地，所述交联的溫度为20~35°C，进一步优选30°C。优选地，所述交联 的时间为30~150min，进一步优选120min。
[0020] 本发明所述Combi-化EAs具有优良的重复操作性，重复使用4次后，仍能维持66% 的初始酶活。
[0021] 本发明具有W下有益效果：
[0022] 本发明提供了一种新的2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，利用3种重组酶 构成共反应体系，将微生物体内化rlich途径需要多步连续反应、多种酶参与才能合成2-苯 乙醇运样复杂的代谢过程，简化为在体外的同一反应体系内进行，从而减少了环境污染、缩 短了反应流程。进一步地，本发明采用戊二醒作为交联剂，将3种重组单酶进行无载体共固 定化，制备共交联酶聚集体(Combi-CLEAs)，体外合成目标产物，从而在上述有益效果的基 础上进一步实现酶的循环使用，降低生产成本。本发明填补了多酶体外制备2-苯乙醇的技 术空白，为生物制备2-苯乙醇提供重要的借鉴，为制备天然2-苯乙醇提供创新思路。
【附图说明】
[0023] 图1多酶体系催化k苯丙氨酸合成2-苯乙醇的路线示意图。图2依次添加 Ξ种酶后 的高效液相色谱检测2-苯乙醇结果。图3Ξ酶共反应的高效液相色谱检测2-苯乙醇结果。图 4Ξ酶共反应的反应产物2-苯乙醇经气相质谱联用分析结果。图5Ξ酶共反应的反应产物2- 苯乙醇经离子质谱分析结果。图6Ξ酶共反应的反应时间对多酶活力的影响情况。图7Ξ酶 共反应的多酶配比对反应的影响情况。图8Ξ酶共反应的Mgh浓度对多酶活力的影响情况。 图9Ξ酶共反应的溫度对多酶活力的影响情况。图10Ξ酶共反应的抑值对多酶活力的影响 情况。图11Ξ酶共反应的底物浓度对多酶活力的影响情况。图12优化Ξ酶共反应条件下高 效液相色谱测定2-苯乙醇结果。图13Ξ酶共固定中沉淀剂对多酶聚集体活力的影响情况。 图14Ξ酶共固定中硫酸锭饱和度对多酶聚集体活力的影响情况。图15Ξ酶共固定中抑对多 酶聚集体活力的影响情况。图16Ξ酶共固定中多酶配比对Combi-化EAs活力的影响情况。图 17Ξ酶共固定中戊二醒浓度对Comb i -化EAs活力的影响情况。图18Ξ酶共固定中交联溫度 对Combi-CLEAs活力的影响情况。图19Ξ酶共固定中交联时间对Combi-CLEAs活力的影响情 况。图20Ξ酶共固定中溫度对共固定化多酶和游离多酶活力的影响情况。图21共固定化多 酶和游离多酶的溫度稳定性。图22 pH对共固定化多酶和游离多酶活力的影响。图23底物配 比对共固定化多酶和游离多酶活力的影响。图24共固定化多酶和游离多酶的胆存稳定性。 图25共固定化多酶的操作稳定性。图26 Aro8基因的克隆鉴定结果。图27 ArolO基因的克隆 鉴定结果。图28 ADH1基因的克隆鉴定结果。图29表达载体p32-YT0801-Aro8电泳分析图。图 30表达载体p32-YT0801-Arol0电泳分析图。图31表达载体P32-DV10-A化1电泳分析图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理 解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的原料为常规市购或商业途径获 得的原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设 备。
[0025] 实施例1
[0026] 主要试剂:重组芳香族氨基转氨酶I、苯丙酬酸脱簇酶和醇脱氨酶，常规市购或参 照现有技术文献构建或者参照本发明实施例5方法构建。化学标准品苯丙氨酸、草酷乙 酸、2-苯乙醇，购自美国Sigma-Al化i ch公司。其他化学试剂均为国产分析纯或色谱纯。主要 仪器:数显恒溫水浴锅皿-2(江苏常州国华电器有限公司），恒溫金属浴C皿-100(江苏杭州 博日科技有限公司），精密抑计P服-3C(上海精密科学仪器有限公司），Mettler-Toledo电子 天平AB204-N(上海Mettler-Toledo仪器有限公司），超声破碎仪(宁波科技有限公司），液相 色谱仪(上海天美公司），气相色谱质谱仪GC-MSQP2010Plus(日本岛津公司）。
[0027] 图1显示了心苯丙氨酸转化为2-苯乙醇的过程。在同一反应体系内，依次通过重组 转氨酶IAR08、苯丙酬酸脱簇酶AR010和醇脱氨酶ADH1的转化，1^-苯丙氨酸经由苯丙酬酸、苯 乙醒，转化为2-苯乙醇。所有反应体系都为0.5mL，缓冲液中包含O.OlmM的憐酸化唉醒、 0.2mM的焦憐酸硫胺素和0.1 mM的NADPH。
[0028] 1.多酶共反应的活性测定：苯丙氨酸和草酷乙酸为底物，册LC检测多酶共用 的催化活性。反应体系总体积50化L，含有：lOmM k苯丙氨酸，lOmM草酷乙酸，0.5mM Mg2+， 0.OlmM憐酸化多醒，0.1 mM焦憐酸硫胺素，0.1 mM NADPH，AR08、AR010和ADHIS种重组酶各10 yL。加入酶液混合均匀，开始计时，33 °C反应3min，加入50化L乙腊终止反应，过滤上清液， HPLC测定2-苯乙醇的含量。
[0029] 反应分两组:第一组按第Ξ章单酶的作用时间依次加入Ξ种酶，即AR08作用lOmin 后，加入AR010充分反应30min，最后加入AD化作用3min;第二组同时加入Ξ种重组酶，混合 均匀后反应3min。测定两组中2-苯乙醇的含量。
[0030] 多酶共反应的酶活力定义:在最适条件下，每分钟每毫升多酶混合液所催化生成 的2-苯乙醇的皿〇1量。酶活单位为皿ol/(min · mL)。
[0031] 2. 2-苯乙醇测定条件：
[0032] 仪器:天美液相色谱仪；色谱柱:Phenomenex lima C18 250mmX4.6mm;参照方法， 流动相为乙腊-水（50/50，￥八），使用前经0.224111微孔滤膜过滤并超声脱气；检测波长为 216]11]1;流速1.〇1]11/1]11]1;柱溫为室溫。2〇41定量环定量。
[0033] 3. 2-苯乙醇的GC-MS检ii条件
[0034] 仪器采用6(：-159?2010?11130，柱子(0.25臟10,30111)，分流进样。升溫程序:进样溫 度250°C，初始溫度40°C，保留5min，4.0°C/min升至。C，再W30.0°C/min加热到250°C保留 5min。
[0035] 4.多酶共反应的反应条件确定验证和试验方法
[0036] (1)多酶共反应的时间：分别测定在不同反应时间下多酶的酶活，测得重组酶 AR08、AR010、A畑1的酶活分别为：0.87、0.22和1.75皿ol/(min · mL)(测定方法参照现有常 规）dW最大酶活为100%，结果用相对酶活表示。
[0037] (2)多酶共反应的酶配比：在设计多酶配比时，固定其中一个重组酶的量，例如固 定AR08的量，按照酶活力对酶W不同比例搭配：1:1:1，1:0.5 :1，1:0.25 : 2，1:0.25 :1，1: 0.25:0.5,1:0.15:0.5和1:0.15:0.25,分别测定不同配比下的酶活，W最大酶活为100%， 结果用相对酶活表示。
[003引（3)多酶共反应的Mg2+浓度:设定反应体系中不同的Mg2+终浓度，测定不同条件下 的酶活。例如分别设Mg2+终浓度为0、0.3、0.5、0.6、1.0、1.5和2. OmM，不同条件下的酶活测定 结果用相对酶活表示，W测定的最大酶活为100%。
[0039] (4)多酶共反应的最适溫度:分别测定多酶在30°C、33°C、35°C、37°C和40°C共反应 时的酶活，W最大酶活为100%，结果用相对酶活表示。
[0040] (5)多酶共反应的最适pH:将Ξ种重组酶AR08、AR010、ADH1依酶活力W不同配比， 加入不同pH的0.1M憐酸钢缓冲液中，混合均匀，4°C放置30min，在最适条件下反应，测定酶 活。pH体系分别为5.0、5.5、6.0、6.5和7.0，结果用相对酶活表示，W测定的最大酶活为 100%。
[0041] (6)底物浓度对酶活性的影响：测定在底物k苯丙氨酸与草酷乙酸的不同摩尔比 条件下的多酶酶活，结果用相对酶活表示，W最大酶活为100%。为免寶述，本实施例分别W 底物k苯丙氨酸与草酷乙酸的的摩尔比为〇.2:1、0.5:1、0.75:1、1:1、1.5:1和2:1进行说 明。所有独立实验重复至少Ξ次。
[0042] 5.试验结果：
[0043] (1)多酶共反应的活性鉴定:本实施例WAR08酶促反应的底物心苯丙氨酸和草酷 乙酸作为起始底物，WADH1的催化产物2-苯乙醇作为终产物，在同一体系内共同反应，检测 Ξ酶共用的催化活性，W验证Ξ酶共用体外合成2-苯乙醇的可行性。反应同时设二组:第一 组按单酶的作用时间依次加入Ξ种酶(AR08在30°C时的反应时间为lOmin，而AR010和ADH1 的作用时间分别为30min和3min);第二组同时加入Ξ种重组酶反应3min。参照2-苯乙醇标 准品，用HPLC检测反应产物，第一组只有底物峰及其他中间产物杂峰，没有检测到反应产物 的存在，分析是因为形成的中间产物不稳定所致;第二组在与标准品2-苯乙醇出峰时间相 同的位置，即4.650min处出现了一个小峰，且底物峰面积减少，显示体系生成了目标产物2- 苯乙醇，浓度为11.51μΜ，见图巧日图3所示。表明AR08、AR010和A畑1共同存在于反应体系时， 具有催化活性。
[0044] 对Ξ酶共反应体系的反应产物进一步进行GC-MS检测，在32.563min处发现有目标 产物2-苯乙醇的存在，见图4所示，对该峰进行进行离子碎片分析，通过比对，进一步证实产 物为2-苯乙醇，见图5所示。结果表明AR08、AR010和40^立酶共反应，能成功催化底物心苯 丙氨酸转化为2-苯乙醇。
[0045] (2)多酶共反应的时间精确确定
[0046] 单酶体系的反应时间各不相同，AR08在30°C时的反应时间为lOmin，而AR010和 ADH1的作用时间分别为30min和3min。本发明研究分析多酶共反应得到的中间产物性质不 稳定，如果酶作用时间过长，易聚合变稠甚至被氧化，因此有必要考察多酶体系的最佳共反 应时间。
[0047] W等摩尔的心苯丙氨酸和草酷乙酸为底物，反应体系中Mgh浓度为0.5mM，加入酶 活力相等的Ξ种重组酶，在33°C下反应不同时间，用HPLC方法测定反应液中2-苯乙醇的含 量，计算相对酶活，得出Ξ酶体系的反应时间为5min，见图6所示。
[0048] (3)多酶共反应的酶配比精确确定试验
[0049] 在多酶反应体系中，1^-苯丙氨酸依次经转氨酶I、苯丙酬酸脱簇酶和醇脱氨酶的催 化，生成2-苯乙醇，因 Ξ种酶的酶活W及酶促反应速度不同，为使心苯丙氨酸的转化率达到 最大，本实施例进一步确定Ξ种酶的最佳比例。由于转氨酶IAR08是反应的第一个酶，因而 在讨论多酶配比问题时，固定AR08的酶量，按照酶活力对Ξ种酶W不同比例搭配，共测定7 种不同比例的反应。所有反应体系都为0.5mL，包含有0.0 ImM的憐酸化唉醒、0.2mM的焦憐酸 硫胺素、O.lmM的NADPHW及0.5mM的Mg2\33°C水浴5min后，HPLC测定2-苯乙醇的含量，计算 相对酶活。图7所示为本发明主要的实验结果显示图。若AR08不足，则产生的苯丙酬酸浓度 低，2-苯乙醇的产率也低;若AR08过量而AR010和ADH1不足，则苯丙酬酸浓度增大，易导致产 物抑制，对心苯丙氨酸的转化率产生影响；因此，合适的多酶配比有利于产物的形成。由图7 可知，Ξ酶按照酶活力W1:0.25:1配比的活力最大;而分别:1:1、1:0.5:1和1:0.25:2配 比的酶活虽然较1:0.25:1次之，但同样可W是保障足够的活力，只是说明此Ξ组的AR010和 ADH1酶量已饱和或者过量;而1:0.25:0.5、1:0.15:0.5和1:0.15:0.25配比时的酶活较低， 说明此Ξ组中AD化和AR010酶量不足。因此多酶共反应时，AR08、AR010和A畑1:1:1(U/U/ U)、l :0.5:1(U/U/U)和1:0.25: 2(U/U/U)或 1:0.25:1(U/U/U)为优选，进一步地，^1:0.25:1 (U/U/U)为最佳配比。
[0050] (4)多酶共反应的Mgh浓度确定试验
[0051] 本发明人研究分析因为Mgh是带二个正电荷的儀离子，可参与酶的催化活性，使得 Mgh具有比酸更强的催化作用，有利于酶活性中屯、的形成和空间结构的稳定。此外，Mg2+通 过静电屏蔽负电荷，可促进反应的进行。但同时，较高浓度的Mgh对酶具有抑制作用，本发明 人研究分析认为是Mg2+与富电子中屯、形成配位键，阻断了底物与酶的活性中屯、结合。与此同 时，本发明人大量前期实验总结AR08单酶催化体系中Mgh浓度为0.6mM，AR010体系的Mgh为 0.5mM，而5mM Mgh有利于AD化的活性，进一步证实了本发明人的研究分析结论。因此，按一 定比例相互构成的多酶反应体系必须考虑Mgh的最佳浓度范围。根据Ξ种重组单酶作用的 适宜Mgh浓度范围，测定若干组不同Mgh浓度的反应。图8中显示了其中6组不同Mgh浓度的 反应结果。AR08/AR010/ADH1依酶活力W1:0.25:1配比，33 °C水浴5min，测定各组相对酶活。 由图8可知，当反应体系内不添加 Mg叫寸，重组酶AR08和AR010不能发挥其催化活性;Mgh浓 度在1.0~2.5mM范围时，多酶活性一直维持较高且稳定的水平，没有很明显的变化;Mgh浓 度继续增大至化.OmM时，酶活力稍下降，表明酶的活性受到Mgh的抑制;Mgh浓度为1.5mM时， 多酶体系的催化活力最大。
[0052] (5)多酶共反应的最适溫度确定试验
[0化3] 试验总结，重组酶AR08、AR010和ADH1的最适溫度分别为30 °C、37°C和35 °C，图9显 示了在不同溫度下反应的酶活力变化情况。多酶反应体系中，AR08/AR010/ADH1依酶活力W 1:0.25:1配比，Mgh浓度为1.5mM，水浴5min后加入等体积乙腊终止反应。
[0054] 结果显示，在30~40°C的溫度范围内，溫度对Ξ酶体系的活性影响不很明显。30°C 是AR08的最适溫度，但对AR010和A畑1活性稍有影响，多酶体系的相对酶活为75% ;40°C对 Ξ种重组酶都有影响，多酶体系的相对酶活降为65%。多酶共用的最适反应溫度与AR010的 最适溫度一致，都为37°C，分析总结认为AROlO是Ξ酶体系的关键酶，在30~40°C溫度范围 内发挥更强的作用。
[0055] (6)多酶共反应的最适pH确定试验
[0056] 试验总结Ξ个重组单酶的最适pH有差异，分别为7.0、6.0、6.0,因此本发明人分 析，Ξ者构成的多酶体系的最适抑，会受到Ξ种单酶体系抑差异的影响，为此，进行了不同 的试验，在抑5.5~7.5范围内调节抑，研究立酶体系的最适抑。图10的试验结果是WMgh浓 度为1.5mM、AR08/AR010/A畑1依酶活力:0.25:1配比、37°C水浴5min等条件下进行说明。 试验总结结合图10可看出，多酶体系的最适pH范围为5.5~6.5，pH6.0时的相对酶活最大。 在抑5.5~7.5范围内，多酶的催化活性没有大幅下降，最低的相对活性能保持66%左右。
[0057] (7)底物浓度对酶活性的影响试验
[005引研究总结底物k苯丙氨酸和草酷乙酸的浓度配比会影响AR08对底物的转化率，继 而影响AR010和ADH1的转化率。因此，在保持底物草酷乙酸浓度为1 OmM不变的情况下，对底 物心苯丙氨酸和草酷乙酸采用不同的摩尔比，在Ξ酶共反应的最适条件下保持5min后，测 定2-苯乙醇的含量，计算相对酶活，结果如图11所示。由图11可W看出，1^-苯丙氨酸与草酷 乙酸摩尔比低于0.75:1时，多酶共反应的相对酶活随心苯丙氨酸配比的增加而增大；当进 一步增大底物k苯丙氨酸的浓度时，多酶活力没有明显的变化，一直维持在最高水平，说明 k苯丙氨酸浓度已达到饱和状态;摩尔比从1.5:1增大到2:1时，相对酶活小幅下降到96%， 是因为k苯丙氨酸的抑制作用所致。由此可见，k苯丙氨酸与草酷乙酸的摩尔比为0.75:1 时，相对酶活最大。
[0059] 实施例2最适条件下多酶共反应合成2-苯乙醇
[0060] 本实施例仪器、试剂和检测方法等参照实施例1。Wレ苯丙氨酸和草酷乙酸为底 物，研究了重组芳香族氨基转氨酶IAR08、苯丙酬酸脱簇酶AR010和醇脱氨酶ADH1，共同作用 于同一体系合成2-苯乙醇的最适条件，所有反应体系都为0.5mL，包含O.OlmM的憐酸化唉 醒、0.2mM的焦憐酸硫胺素和0.1 mM的NADPH。
[0061] W摩尔比为0.75:1的心苯丙氨酸和草酷乙酸为底物，按照前述最佳条件合成2-苯 乙醇。重组酶AR08、AR010和A畑1按酶活力W1:0.25:1配比，加入量为10化L，在抑6.0、Mgh浓 度为1.5mM的反应体系中，37 °C水浴5min后，W等体积的乙腊终止反应，用HPLC测定2-苯乙 醇的含量，为40.92μΜ，见图12所示。在本发明最佳的多酶共反应条件下，2-苯乙醇浓度达到 较高的值。重组多酶的酶活力为0.082皿olAmin · mU。
[0062] 实施例3Ξ酶共固定体系参与的共反应试验
[0063] 主要试剂:重组芳香族氨基转氨酶I、苯丙酬酸脱簇酶和醇脱氨酶常规市购或参照 领域常规技术构建，或者参照本发明实施例5方法构建。化学标准品苯丙氨酸、草酷乙 酸、2-苯乙醇，购自美国Sigma-Al化ich公司。其他试剂常规市购，W上化学试剂均为国产分 析纯或色谱纯。主要仪器:数显恒溫水浴锅皿-2(江苏常州国华电器有限公司），电热鼓风干 燥箱101A-3S(广东广州富民测控科技有限公司），恒溫金属浴C皿-100(江苏杭州博日科技 有限公司），伊莱克斯冷藏冰冻箱BCD-263C(伊莱特（中国）有限公司），Eppendorf离屯、机 5810R(德国Eppendorf公司），精密pH计PHS-3C(上海精密科学仪器有限公司），Mettler- Toledo电子天平AB204-N(上海Mettler-Toledo仪器有限公司），超声破碎仪(宁波科技有限 公司），液相色谱仪(上海天美公司）。一、试验方法：
[0064] 酶活力测定方法：苯丙氨酸和草酷乙酸为底物，册LC检测共固定化多酶 (Combi-化EAs)的催化活性。反应体系总体积50化L，含有：lOmMレ苯丙氨酸，lOmM草酷乙 酸，1.5mM Mg2%0.0ImM憐酸化多醒，0.1 mM焦憐酸硫胺素，0.1 mM NADPH，共固定化多酶30化。 加入酶液混合均匀后，开始计时，最适溫度下反应5min，迅速加入50化L乙腊终止反应，上清 液用22μπι滤膜过滤后，HPLC测定216nm波长的吸光值，计算2-苯乙醇的含量。
[0065] Ξ酶共固定体系CombiHXEAs的酶活力定义:在最适条件下，每分钟每毫升Combi- CLEAs混合液所催化生成的2-苯乙醇的皿〇1量。酶活单位为皿ol/(min · mL)。
[0066] 2-苯乙醇测定条件同实施例1。
[0067] 酶活力回收率计算:酶活力回收率是指Combi-化EAs所表现的活力占初始游离多 酶液总活力的百分数。
[006引
[0069] 1.共固定化多酶(Comb i -CLEAs)制备
[0070] 多酶聚集体的制备：重组转氨酶I、苯丙酬酸脱簇酶和醇脱氨酶按酶活力Wl: 0.25:1比例混合，取10化L混合酶液装于试管内，向其中缓慢滴加9(Κ)化沉淀剂，同时边滴加 边轻微揽拌，每隔30min取样一次，在8000巧m下低溫离屯、5min，取上清液测定酶活，直至所 有蛋白被沉淀。
[0071] 多酶聚集体的交联:在加入沉淀剂的多酶聚集体悬浮液中缓慢加入一定浓度的交 联剂戊二醒，持续轻微揽拌，在一定溫度下交联一定时间，400化pm离屯、lOmin，弃上清，W ImL pH7.0的憐酸氨二钢/憐酸二氨钢缓冲液洗涂沉淀后离屯、，ImL缓冲液重悬沉淀，于4°C 保存备用。
[0072] 2.多酶共固定化条件研究
[0073] 沉淀剂种类的确定：分别采用90 %硫酸锭、90 %异丙醇、90 %下醇、60 % PEG6000、 90%乙醇、90%丙酬、90%叔下醇和90%乙腊作为沉淀剂，取100化^1:0.25 :UU:U:U)比例 混合混合的多酶液，分别加入90化L上述沉淀剂，25°C沉淀30min，8000巧m离屯、5min，洗涂， W ImL pH7.0的憐酸氨二钢/憐酸二氨钢缓冲液重悬沉淀，测定各酶活，计算酶活回收率。
[0074] 沉淀剂饱和度的确定：取lOOliL混合酶液，向其中缓慢加入900化饱和度分别为 20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 % 和90 % 的抑7.0的硫酸锭溶液，25°C沉淀30min，测 定各酶活，计算酶活回收率。
[0075] 沉淀pH的确定：取100化混合酶液，缓慢加入900yL，pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、 5.0、6.0、7.0和8.0的饱和硫酸锭溶液，25 °C沉淀30min，测定各酶活，计算酶活回收率。
[0076] 多酶配比的确定：参照实施例1，固定第一个酶AR08的酶量，按照酶活力，AR08、 AR010和ADH1 分别Wl:l:l，l:0.5:l，l:0.25:2，l:0.25:l，l:0.25:0.5，l:0.15:0.5和 1: 0.15:0.25的比例配制多酶混合液，各取10化L混合酶液，向其中缓慢加入90化L饱和硫酸锭 溶液，25°C沉淀30min，测定各酶活，计算酶活回收率。
[0077] 交联剂浓度的确定:按照前述最佳条件制备多酶聚集体悬浮液，向其中加入终浓 度分别为0.05%、0.10%、0.15%、0.25%、0.50%和0.75%的戊二醒溶液并稍加揽拌，251： 交联120min后，4000巧m离屯、lOmin，用10mLpH7.0的憐酸盐缓冲液洗涂沉淀3次，最后WlmL 此缓冲液重悬沉淀，测定各酶活，计算酶活回收率。
[0078] 交联剂溫度的确定:制备多酶聚集体悬浮液，并加入合适浓度的戊二醒溶液，分别 在0°C、10°C、25°C、35°C和45°C下交联120min，离屯、，洗涂，W ImL缓冲液重悬沉淀，测定各酶 活，计算酶活回收率。
[0079] 交联时间的确定：制备多酶聚集体悬浮液，加入戊二醒溶液，在最适溫度下，分别 交联30、60、90、120和150min，离屯、，洗涂，W ImL缓冲液重悬沉淀，测定各酶活，计算酶活回 收率。
[0080] 3.采用响应面分析方法验证本发明多酶共固定化条件
[0081 ] 根据单因素实验结果，采用Box-Behnken试验设计，对影响Combi-化EAs活性的显 著因素进行3因素3水平设计。各因素编码及水平见表1所示。
[0082] 根据相应的试验表进行试验后，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平方 项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最 佳值。
[0083] 表1Box-Belmken响应面设计试验因素水平和编码
[0084]
[0085] 4.从共固定化多酶(Combi-CLEAs)酶学性质研究确定本发明工艺参数
[0086] (1 )Combi-CLEAs的最适溫度：分别测定Combi-CLEAs在30°C、33°C、35°C、37°C、40 °C、45°C和50°C溫度下的酶活，结果用相对酶活表示，W测定的最大酶活为100%。^游离多 酶 AR08: AR010: ADH1 的最佳配比 1:0.25:1 (U: U: U)为对照。
[0087] (2)Combi-化EAs的溫度稳定性:将Combi-化EAs分别置于 10°C、30°C、50°C、70°C和 90°C下保溫化，测定剩余酶活。测定结果用相对酶活表示，W未保溫的酶活为100%。W游离 多酶 AR08: AR010: ADH1 的最佳配比 1:0.25:1 (U: U: U)为对照。
[008引（3) Combi-CLEAs的最适抑:将Combi-化EAs加入不同抑的缓冲溶液中，混合均匀，4 °C放置30min，在最适溫度条件下反应，测定酶活。抑体系分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 和9.0，其中pH3.0~5.0为0.1M醋酸钢缓冲液，pH6.0~7.0为0.1M憐酸钢缓冲液，pH8.0为 0.1M Tris-HCl缓冲液;PH9.0为0.05M Gly-NaOH缓冲液。结果用相对酶活表示，W测定的最 大酶活为100 %。W游离多酶AR08: AR010: A畑1的最佳配比1:0.25:UU:U: U)为对照。
[0089] (4)底物浓度对Combi-化EAs活性的影响：测定仿111扣-〇^43在心苯丙氨酸与草酷 乙酸的摩尔比分别为0.2:1、0.5:1、0.75:1、1:1、1.5:1和2:1条件下的酶活，结果用相对酶 活表示，W测定的最大酶活为100 %。W游离多酶AR08: AR010: ADH1的最佳配比1:0.25: UU: U:U)为对照。
[0090] (5)Combi-CLEAs的胆存稳定性:取Combi-CLEAs分别置于4°C冰箱保存40d，每隔一 定时间取出等量酶液测定酶活，W测定的最大酶活为100%，结果用相对酶活表示。W游离 多酶 AR08: AR010: ADH1 的最佳配比 1:0.25:1 (U: U: U)为对照。
[0091] (6)Combi-化EAs的操作稳定性:取等量游离多酶和Combi-化EAs分别作用心苯丙 氨酸，终止反应后滤出酶液继续下一批次反应，测定每批反应的酶活，W测定的最大酶活为 100%，结果用相对酶活表示。
[0092] 二、试验结果
[0093] 1.多酶共固定化条件研究结果
[0094] (1)沉淀剂种类的选择
[00M]利用中性盐、水溶性有机溶剂和非离子型高聚物沉淀游离酶是制备化EAs的第一 步，沉淀剂种类不同，诱导出的酶构象也不同，随后的交联反应定格方式也不同，最终的交 联酶聚集体的活性差异极大。因此沉淀剂的种类对酶活有很大影响。经过针对性研究筛选 和对比试验，本实施例向等量的多酶液中分别加入不同8种沉淀剂（（NH4)2S〇4、叔下醇、 PEG6000、异丙醇、正下醇、乙醇、丙酬、乙腊），测得各种聚集体的酶活如图13所示，图13中， CK:游离酶;A:90%(NH4)2S04;B:90%叔下醇；C:60%PEG6000;D:90%异丙醇；E:90%正下 醇;F:90%乙醇;G:90%丙酬;H:90%乙腊）。从图13中可W看出，各种沉淀剂对混合多酶的 沉淀效果各有差异，W硫酸锭和叔下醇作为沉淀剂最终所得到的酶聚体的活性较高，酶活 回收率达到68%。硫酸锭是一种中性盐，在溶液中能破坏蛋白质的水化层而使蛋白质凝集 沉淀。叔下醇是一种水溶性有机溶剂类蛋白沉淀剂，沉淀的原理主要是有机溶剂能降低水 溶液的介电常数，减小溶剂的极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加带电 质点间的相互作用，增加蛋白质分子之间的相互吸引，致使蛋白质颗粒间容易凝集;其次， 运种极性有机溶剂能与水互溶，脱去蛋白质分子周围的水化层，破坏蛋白质分子的水膜而 是蛋白发生沉淀。PEG 6000是一种不带电荷的直链聚合物，主要通过空间位置排斥作用W 及很强的亲水性，来破坏蛋白质分子表面的水化层，使酶聚集或脱水而沉淀。本文W60% PEG 6000制备的聚集体相对酶活只有43%，可能是PEG浓度不高、对酶的空间排斥作用不强 所致，此外，PEG溶液的粘度大，影响操作，试验重复性不好。其它有机溶剂如丙酬、乙腊的沉 淀效果都比较好，但是酶活不高，运是因为运些有机溶剂在沉淀过程中对酶活的影响很大， 造成酶部分失活。因此，经过分析和试验验证，本发明选取硫酸锭作为制备Combi-化EAs的 沉淀剂。
[0096] (2)沉淀剂饱和度的确定
[0097] 本实施例研究了沉淀剂浓度对多酶聚集体活性的影响。W不同饱和度的硫酸锭对 多酶混合液沉淀30min，离屯、后测定各聚集体活性，W等量的游离多酶酶活回收率为100%， 结果如图14所示。随着沉淀剂浓度的升高，被沉淀的蛋白量也增多，因而多酶聚集体的活性 呈上升趋势;沉淀剂浓度越大，酶蛋白的沉淀越完全，聚集体中的酶活越高。当硫酸锭饱和 度从20%增加到40%，多酶的沉淀速度最快，聚集体相对活性从18%显著增加到58% ;随着 硫酸锭饱和度的继续增大，相对酶活逐渐升高；当其饱和度为90%时，绝大部分多酶被沉淀 下来，相对酶活达到最大，但70%、80%和90%Ξ种饱和度的相对酶活差异不显著，从制备 成本考虑，沉淀剂的最终饱和度为70 %。
[0098] (3)沉淀抑的确定
[0099] 用不同pH的硫酸锭沉淀剂制备多酶聚集体，测定酶活，W等量的游离多酶酶活回 收率为100%，结果如图15所示。由图15可知，随着pH值的升高，酶活呈先上升再下降的变化 趋势;pH4.0~6.0范围内的相对酶活较高，处于67 %~77 %之间；当抑5.0时，聚集体活力最 大，运是因为重组酶4308、41?010和4的11的等电点分别为5.81、4.91和5.06，因而在抑5.0附 近沉淀最完全。运些在水溶液中被硫酸锭沉淀下来的酶聚集体，酶分子之间通过非共价键 结合在一起，当酶聚集体置于水相反应体系中时，聚集体因不稳定而发生分解，酶分子重新 溶解在水中，酶分子的空间构象受到破坏，从而影响酶活力，从前述试验结果看出，即使在 完全沉淀的条件下，聚集体的最大相对酶活也不足80%，因此，为了避免聚集体的再次溶 解，在多酶发生沉淀后需采用一定浓度的交联剂进行交联。
[0100] (4)多酶配比的确定
[0101] 在确定多酶配比时，固定第一个酶AR08的酶量，按照酶活力对Ξ种酶W不同比例 搭配，并在25°C用pH5.0、70%饱和度的硫酸锭沉淀30min，离屯、后在各聚集体中加入适量戊 二醒进行交联，制备Combi-CLEAs，测定其酶活，W等量的游离多酶酶活回收率为100%，结 果如图16所示。多酶配比不同，酶的活力不同；AR08:AR010:ADH1为1:0.5:1(U/U/U)时，相对 酶活最大，运与前述游离Ξ酶联用时的最佳配比有一定偏差，可能是Ξ酶W1:0.5:1配比 时，分子直径、空间构象不同的Ξ种重组酶形成的交联聚集体颗粒大小合适，底物分子容易 扩散进入聚集体内部，且酶分子间距离比游离酶更近，AR08产生的苯丙酬酸易被AR010原位 脱簇、苯乙醒易被A畑1原位脱氨，因此，W1:0.5:1配比的酶液制备的Combi-化EAs获得了最 高的活力。
[0102] (5)交联剂浓度的确定
[0103] 戊二醒是适合于本发明固定化体系，其对酶的交联主要是通过醒基和酶分子表面 的胺基发生反应，得到不溶性的酶交联聚集体。但戊二醒的用量对制备的酶交联聚集体有 不同的影响。AR08、AR010和ADH1按照酶活力W1:0.5 :1配比后，经70 %饱和度硫酸锭沉淀 后，加入不同体积的戊二醒对多酶聚集体进行交联，使溶液中戊二醒的终浓度分别为： 0.05%、0.10%、0.15%、0.25%、0.50%和0.75%(V/V)，制得各种Combi-CLEAs，测定其酶 活，结果如图17所示。由图17可知，随着戊二醒浓度的增加，酶活力呈先小幅上升再持续下 降的变化趋势，在戊二醒浓度为0.10 %时，相对酶活达到最高;戊二醒浓度由0.50 %增加到 0.75%时，相对酶活急剧下降了30%。表明在一定范围内，戊二醒用量增大，得到的Combi- CLEAs的量也增多，酶活力增大，但是戊二醒用量过大，会引起对酶的过度交联，导致酶活性 的严重损失。运是因为戊二醒主要通过交联作用来降低酶的流失量，在低浓度时，仅有少量 的酶分子能够发生交联，得到的不溶性的交联酶聚集体量很少，有大量的酶没有被交联，在 洗涂过程中泄漏、流失，因而酶活力低;但是当浓度过高时，戊二醒与酶分子自身的氨基酸 发生多位点结合，使蛋白质的高级结构发生一定程度的破坏，不仅造成了酶活力的损失，而 且形成结构紧密的聚集体使得底物分子很难接近酶的活性中屯、，从而影响酶分子活性中屯、 的有效性，因此体现出较低的酶活力。
[0104] (6)交联溫度的确定
[0105] 溫度也是影响多酶交联聚集体活力的一个重要因素。在多酶聚集体中加入终浓度 为0.10 %的戊二醒进行交联，分别置于0、10、20、25、30、35、45 °C下交联反应120min，测定各 Combi-CLEAs的活力，计算相对酶活。从图18中可W看出，溫度从(TC升高到30°C时，酶活力 不断增大;在20~30°C范围内的酶活增大显著;30°C时，相对酶活最大，达到74%。随着溫度 的继续升高，酶活力损失增大，45°C时，Combi-化EAs的相对活力降为43%。因此制备多酶交 联聚集体的最适溫度选为30°C。
[0106] (7)交联时间的确定
[0107] 交联时间影响多酶聚集体的活性。终浓度为0.10%的戊二醒在30°C下交联多酶聚 集体的时间分别为30、60、90、120和150111111，测定各(：〇111扣-化643的活力，计算相对酶活。结 果如图19所示，随着交联时间的增加，Combi-CLEAs的相对酶活也平稳增大，运是因为交联 时间越长，交联越彻底，多酶交联聚集体的量越多，酶的活力越大；当超过120min时酶活开 始下降，交联150min时，相对酶活下降到41%，运是因为交联时间过长，过多的戊二醒覆盖 酶的部分活性部位，影响酶活力;此外，交联时间过久，戊二醒易发生聚合和氧化等反应，从 而影响酶活和交联效果。因此，交联时间对Combi-CLEAs的稳定性和活性非常重要，故确定 120min为合适的交联时间。
[0108] Ξ、多酶共固定化条件的响应面研究验证试验
[0109] 1 .Box-Benhnken试验结果与分析
[0110] 本发明采用Box-Behnken试验设计，W(NH4)2S04为沉淀剂，选取多酶配比为1: 0.5:1、沉淀抑为5.0、交联时间为120min，对影响多酶化EAs活性的显著因素进行3因素3水 平的设计，W3次试验所得酶活力回收率的平均值为响应值(Y)，具体试验设计和结果如表2 所示。
[0111] 表SBox-Belmken试验设计及其结果
[0112]
[0113]
[0114] (2)二次回归拟合及方差分析
[0115] 应用统计软件SAS 8.0(Statistics Analysis System)对表2的数据进行二次多 项回归拟合，统计学上的显著性由T检验确定，决定系数和变异系数由F测验决定。由Box- Behnken试验数据拟合得到响应值(Y)与各因子(A，B，C)之间的二次回归方程为：
[0116] Υ = -1〇24.29+17.18A+519.85B+31.61C+8.63AB-0.079AC+11.78BC-0.1 1A2- 7488.50B2-0.47C2
[0117] 对上述二元回归方程进行显著性分析及方差分析，结果见表3。
[0118] 表SBox-Belmken试验设计回归方程的方差分析
[0119]
[0120]
[0121] 各因素与响应值之间线性关系的显著性由F值检验来判定，概率P(F>Fa)的值越 小，则说明变量的显著性越高。失拟项化ack of fit)是用来评估方程可靠性的一个重要数 据，如果显著，表明方程模拟不好;如果不显著，表明方程模拟比较好，可W很好地分析W后 的数据，即可W用该回归方程代替真实试验点对实验结果进行分析和预测。由表3可知，模 型的显著水平为〇.〇〇〇1(<〇.01)，表明模型对响应值(酶活力回收率)的影响极显著，该模型 在统计学上有意义。交联溫度影响极显著，3因素对酶活力回收率的影响显著性为交联溫度 〉硫酸锭饱和度〉戊二醒浓度;交互项A(硫酸锭浓度)与B(戊二醒浓度）、A(硫酸锭浓度)与C (交联溫度)交互作用显著，说明运3个因素都是Combi-CLEAs制备过程中的关键控制因素； 二次项A2、B2、C2影响极显著。失拟项P = 0.631100.05)，没有显著性意义，说明数据中没有 异常点，不需要引入更高次数的项，模型适当。
[0122] 表4模型的可信度分析 「01231
[0124] 由表4可W看出，相关系数R2 = 0.9864，说明响应值的变化有98.64%来源于所选 Ξ个变量。校正决定系数R2(Ad j) = 0.9688(〉0.80)，说明96.88 %的实验数据的变异性可用 此模型解释;而较低的变异系数C.V. % (5.54%)表明，模型中仅有5.54%变异不能由该模 型解释，即有94.45%的变异可W由由该模型来解释，表明该模型是高度显著的。信噪比 Adeq Precision大于4比较合理，该模型信噪比为19.485,表明模型能很好反映真实的实验 值。综上分析，该回归方程可W较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可W利用其确 定Comb i -CLEAs的最佳制备条件。
[0125] 3.验证试验
[01%]根据Box-Behnken设计模型分析得知，多酶共固定化条件优化工艺参数为：（NH4) 2SO4饱和度为71.57 %，戊二醒浓度为0.10 %，交联溫度为28.55°C。在此条件下，酶活回收率 预测值为67.29%。为了确定建立的模型与试验结果是否相符，根据实际操作，将固定化工 艺参数修正为(NH4)2S04饱和度为72 %，交联溫度为29 °C，戊二醒浓度仍为0.10 %;在此参数 下，进行了3组实验，得到的酶活回收率为65.76±3.27%，与模型预测值接近。所拟合数据 模型很好地与本发明实际方案具有较好的吻合度。
[0127] 4.共固定化多酶酶学性质研究试验
[0128] (1)溫度对共固定化多酶活性的影响
[0129] 高溫下酶的活性构象发生解离，是酶活性降低或丧失的根本原因，而固定化技术 通过酶分子之间或酶与载体之间的各种共价键的连接，可有效减少运种构象的解离。因此 大多数酶经固定化后，最适溫度较游离酶会有所提高。本实验分别测定了不同溫度下 Combi-CLEAs和游离酶的活性，结果如图20所示。由图20可知，游离酶的最适溫度为37°C， Combi-CLEAs的最适溫度有小幅升高，为40°C;且Combi-CLEAs的适宜作用溫度范围较游离 酶宽，在37~50°C范围内，其相对酶活力都保持在最高酶活的86% W上。表明交联固定化技 术提高了酶的催化溫度。其原因是交联剂戊二醒形成的交联酶聚集体结构比较致密，对酶 的活性基团有一定的保护作用。从图中也可看出，随度着溫度的进一步升高，固定化酶和游 离酶的活性都逐渐降低，因此，除了确定其最适溫度，还应考虑固定化酶的热稳定性。
[0130] (2)共固定化多酶的溫度稳定性
[0131] 热稳定性是考察固定化酶性能的一个重要指标。对固定化酶和游离酶在不同溫度 下处理化，测定其剩余酶活性，结果如图21所示。图中可W看出，随着溫度提高，Combi- CLEAs和游离多酶的活性均呈下降趋势，但游离酶的活性下降幅度更大;在50°C保溫化后， Combi-CLEAs的相对酶活仍保持在80%，而游离酶仅50% ;90°C处理化后，前者剩余活力为 25%，后者不足10%。由此可见，共交联酶聚体运种固定化方法能有效提高酶的热稳定性， 明显降低热失活程度。其原因是游离酶形成化EAs后，空间结构发生变化，部分活性基团被 包埋在聚集体内部，从而受到了保护，因此耐热性有所增强;此外，较高的溫度有利于底物 分子扩散至聚集体内部与酶发生反应。
[0132] (3)p取?共固定化多酶活性的影响
[0133] 酶的活力易受环境抑的影响，只有在一定抑下，酶才能表现最大活力。由于载体对 微环境中离子强度的影响，固定化酶的最适抑值往往会发生漂移。本实施例测定了抑3.0 ~9.0的缓冲液中Combi-CLEAs和游离多酶的活性，结果见图22。由图可知，Combi-CLEAs的 最适抑为5.0，游离多酶的最适pH为6.0，Combi-CLEAs向酸性偏移了一个单位，其适宜作用 pH范围也向酸偏移。可能是因为交联过程中，戊二醒分子中的醒基与酶分子中的氨基发生 了亲核反应，使得蛋白质分子侧链基团的负电荷增多，外部溶液中的抑必须向酸性偏移才 能中和运些负电荷。
[0134] (4)底物浓度对共固定化多酶活性的影响
[0135] 研究底物的浓度配比影响共固定化多酶(Combi-CLEAs)活性时，保持底物草酷乙 酸浓度为lOmM不变的情况下，对底物心苯丙氨酸和草酷乙酸采用不同的摩尔比，在Combi- CLEAs的最适条件下保持5min后，测定酶活，结果如图23所示。由图可见，底物配比对共固定 化多酶和游离多酶的影响一致，当k苯丙氨酸与草酷乙酸摩尔比低于0.75:1时，二者的相 对酶活都随k苯丙氨酸浓度的增加而增大，但固定化多酶的相对酶活稍高；当底物摩尔比 超过1.5:1时，因心苯丙氨酸的抑制，二者活力稍有下降，固定化多酶下降速度稍快。由此可 见，k苯丙氨酸与草酷乙酸的摩尔比为ο. 75:1时，固定化多酶和游离多酶的相对酶活最大。
[0136] (5)共固定化多酶的胆存稳定性
[0137] 酶的胆存稳定性对其商业化应用非常重要。将游离多酶和共固定化多酶化EAs置 于4°C冰箱保存40d，每隔一定时间测定酶活，结果如图24所示。在胆存的前lOd内，两者的活 力都没有明显变化;20d后，固定化酶维持98%的活性，游离酶活性为95% ;40d后，酶活力都 有所下降，但Combi-CLEAs的下降趋势比游离酶缓慢，两者活性分别维持初始酶活的87%和 70%。表明固定化酶的胆存稳定性较好，运主要是因为Combi-CLEAs制备过程中的沉淀和交 联步骤对酶有提纯作用，避免了杂蛋白造成酶的水解。此外，酶分子W多点共价交联形式牢 牢锁定在一个区域内，避免了酶W游离态形式泄漏到溶液中。
[0138] (6)共固定化多酶的操作稳定性
[0139] 可重复利用性也是衡量固定化酶性能的一个重要指标。在每一批次反应结束后， 将Combi-CLEAs滤出继续下一批次反应，结果见图25。固定化多酶在重复使用4次后，底物的 转化率为23%，维持了 66%的初始酶活，而游离酶因为难W回收，使用1次后酶活只保留了 4%，说明Combi-CLEAs具有较好的重复操作性;连续使用8次后，固定化多酶活力下降幅度 极大，仅剩19%的活力，主要原因是多次重复影响其稳定性，其次是Combi-CLEAs颗粒细小、 影响回收。
[0140] 实施例4多酶共固定体系应用于共反应制备2-苯乙醇
[0141] 依响应面分析得出的最优工艺参数，进行多酶共固定，按照最佳条件合成2-苯乙 醇。Combi-CLEAs加入量为10化L，在抑5.0、40 °C水浴5min后，W等体积的乙腊终止反应，用 HPLC测得2-苯乙醇的含量为28.61μΜ。共固定化多酶的酶活力为0.057皿olAmin · mU。
[0142] 实施例5优化的Ξ种重组酶的构建方法
[0143] W下构建方法中没有特别说明的均为参照本领域常规技术，没有说明的生物材料 均为市购或本领域常规使用的生物材料。
[0144] 一、从酿酒酵母的不同菌株中克隆得到了 W化rlich途径合成2-苯乙醇的3个关键 酶的11个基因。
[0145] (1)3个芳香族氨基转氨酶I基因。其DNA序列长度为1503bp，相对分子质量大小为 56.2kD，理论等电点为5.81。3个基因的66扣曰114登录号分别为雌422721.1、雌422722.1和 KC422723.1〇
[0146] (2)3个苯丙酬酸脱簇酶基因。其DNA序列长度为1908bp，相对分子质量大小为 71.4kD，理论等电点为6.10。其中2个基因在〇6扣曰扯中注册，登录号分别为雌422719.1和 KC422720.1〇
[0147] (3)5个醇脱氨酶基因。分别为:2个醇脱氨酶A化1基因、1个醇脱氨酶A化2基因、1个 醇脱氨酶Adh3基因和1个醇脱氨酶Sfal基因。其中，A化1和Adh2基因的DNA序列长度都为 1047bp，相对分子质量大小约为36.8kD，DV10-A化1基因的理论等电点为6.07，EC1118-A化1 和DV10-A化2理论等电点都为6.21。6(：1118-4化1基因和0￥10-4化2的66扣曰证登录号分别为 KC491732.1和雌491733.1。￥1'0801-4化3基因的0魁序列长度为112869，相对分子质量大小 为40.4kD，理论等电点为8.65，其Genbank登录号为KC422718.1 sYTOSOl-Sfal基因的DNA序 列长度为lieibp，相对分子质量大小为41kD，理论等电点为6.51，其Genbank登录号为 KC491734.1。
[0148] 材料：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株和大肠杆菌化scherichia coli)菌株DH5a，常规菌株，可W使用其他实验室常规实验使用的菌株，本实施例使用的菌 株为本实验室常规保存的实验用菌株。克隆载体pGEM-T Easy Vector，Promega公司产品。
[0149] TakaRaEx Taq酶购自大连宝生物工程有限公司；普通琼脂凝胶DNA回收试剂盒和 质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司;常规试剂均为国产分析纯。
[0150] 根据已报道的目的基因序列信息，利用primer 5和oligo 6.0设计特异性引物，由 上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列信息见表5。
[0151] 表巧I物序列信息表
[0152]
[0153]
[0154] 酿酒酵母的培养及总DNA的提取：
[01巧]分别从不同酿酒酵母菌株中提取基因组DNA，参照蜗牛酶过夜处理法（王萍等， 2008;赵宏宇等，2011)。W酿酒酵母总DNA为模板，利用上述特异性引物进行PCR反应扩增目 的基因的DNA全长片段，PCR扩增反应体系为：
[0156]
[0157] PCR 反应参数：94°C 预变性 5min，94°C 变性 453,46。(：退火453,72。(：延伸9〇3;共33个 循环;72°C延伸10min，PCR产物4°C下保存。
[0158] 目的片段PCR扩增产物的回收:扩增PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的 条带，用TIANGEN普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。
[0159] PCR产物的连接：回收的PCR产物与载体T-easy Vector连接，重组质粒转化大肠杆 菌E.coli D册α。连接反应体系如下；
[0160]
[0161] 连接混合物在4°C下连接过夜，转化大肠杆菌感受态D册a(&Cl2法）。
[0162] 连接产物的转化和大肠杆菌感受态细胞的制备参照现有常规技术。
[0163] 连接产物的转化包括W下步骤：
[0164] 步骤一:大肠杆菌感受态细胞的制备
[0165] (1)从37°C培养1加的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到装有lOOmL LB培养基的 250mLS角瓶中，于37°C剧烈摇动化(220巧m)。
[0166] (2)在无菌条件下将大肠杆菌转移到一个无菌、一次性使用的预冷的50mL离屯、管 中，冰上放置lOmin。
[0167] (3)于4°C用GS3转头W4000巧m，离屯、lOmin收集细胞。
[0168] (4)倒出培养液，将管倒置Imin，使最后残留的痕量培养液流尽。
[0169] (5)Wl0mL用冰预冷的0.1M CaCb重悬每份沉淀，冰浴30min后，再W4000巧m离屯、 lOmin收集细胞。
[0170] (6)弃尽上清，并W2mL冰预冷的0.1M CaCb重悬沉淀，4°C放置，7化W内使用；或 在0.1M化C1盛础上添加甘油至终浓度20%，分装后于-70°C保存，长期备用。
[0171 ]步骤二:大肠杆菌感受态细胞的鉴定
[0172] (1)吸取10化L感受态细胞的悬浮液，加入化L不带目的基因的质粒(抗Amp)，混匀， 冰浴30min。同时作空白对照一个，即另外吸取10化L感受态细胞的悬浮液，不加质粒。
[0173] (2) 42 °C水浴放置90s，快速转移到冰上，使细胞迅速冷却1~2min。
[0174] (3)加入400化的LB液体，37°C水浴恢复5min，转入37°C摇床200rpm振荡培养 45min。
[0175] (4)在lOOmL冷却至46°C的LB固体培养基中，加入200化的Amp(50ygAiL)，混合均 匀，注入平皿。
[0176] (5)加入 100μLΧ3)，均匀涂布。
[0177] (6)待惊干后，倒置平板，37°C培养过夜，观察结果。
[0178] (7)不加质粒的对照无菌落产生;加质粒的有均匀密布的菌落产生。说明感受态细 胞有较好的转化能力，且无抗Amp的杂菌。
[0179] 步骤Ξ:连接产物的转化
[0180] (1)从-70°C冰箱中取2(Κ)化感受态细胞悬液，室溫下使其解冻，解冻后立即置于冰 上；
[0181] (2)加入连接混和液10化，轻轻摇匀，冰上放置30min;
[0182] (3)42°C水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3~5min;
[0183] (4)加入ImL不含Amp的LB液体培养基，混匀后37°C振荡培养比，使细菌恢复正常生 长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp+);
[0184] (5)将上述菌液摇匀后取100化均匀涂布于含Amp+的筛选平板上，正面向上放置 0.化W便液体被吸收；
[0185] (6)待菌液完全被培养基吸收后，倒置平板，于37°C培养16~24h;
[0186] (7)待菌落充分显色后，挑取带重组质粒的克隆（白斑)作培养，用无菌牙签在LB固 体培养基中挑转化后的白色单菌落，接种到2mL含有抗生素氨节青霉素的LB液体培养基中， 37°(：振荡培养8~12}1。
[0187] 重组质粒的提取:参照说明书用TIANGEN质粒小提试剂盒对转化菌株进行重组质 粒提取。
[0188] 重组质粒的酶切鉴定:酶切反应体系为：
[0189]
[0190] 37 °C保溫化，进行1.0 %琼脂糖凝胶电泳。
[0191] PCR鉴定和酶切鉴定无误的克隆携带菌株，由北京六合华大基因科技股份有限公 司广州分公司测序。
[0192] 核酸序列比对在NCBI BLAST化ttp://blast .ncbi .]11111.]1化.邑〇￥)上进行，氨基酸 序列比对在邸I-BLAST化ttp://www. ebi .ac.址)上进行，核酸序列分析用丽assist 2.0和 NCBI Spidey完成，核酸与氨基酸序列绘制用DNAMAN完成，蛋白质结构与功能的预测在 Swissprot化t1:p: //www. expasy. ch/sprot/)网站上提供链接的平台上进行。
[0193] 本实施例分别提取17个不同酿酒酵母菌株的总DNA，WAR08F和AR08R为引物进行 PCR扩增，结果从3个酵母菌株中得到的PCR产物大小都约为1500bp，与预期相符。转化 E.coli D册α，提取阳性重组质粒，经EcoRI酶切鉴定，插入片段大小约1500bp，与预期目标 基因接近，见图26所示。其中图26中，左(a)为Aro8基因 PCR产物的电泳分析结果;右图（b)为 重组质粒的酶切鉴定结果。M:Maker虹；1 ~3:￥1'0801-4'〇8、6(：1118-4'〇8和0￥10-4'〇8的口〇? 产物；1〇~3〇:重组质粒；li~33:1〇~3〇号质粒的酶切产物。
[0194] 本实施例提取17株不同酿酒酵母菌株的总DNA，WAR010F和AR010R为引物进行PCR 扩增。结果从3株酵母菌株中得到的PCR产物大小都约为1900bp，与预期相符。回收PCR产物， 转化D册α感受态细胞，在含Amp+的LB平板上进行蓝白斑筛选。提取阳性重组质粒，EcoRI酶 切鉴定。酶切结果显示电泳条带清晰，插入片段大小约1900bp，与预期目标基因接近，见图 27所示，图中，左图（a)为ArolO基因 PCR产物的电泳分析;右图（b):重组质粒的酶切鉴定。M: Maker虹；1~3:YT0801-Arol0、ECm8-Arol0和DV10-Arol0的PCR产物；l日~3日：重组质粒；ll ~33:1〇~3〇号质粒的酶切产物。
[0195] 本实施例提取17个不同酿酒酵母菌株的总DNA，进行PCR扩增。从2株酵母中得到与 Adhl基因大小相符的PCR产物(约1050bp)，由1株酵母得到与Adh2基因大小相符的PCR产物 (约1050bp)，由1株酵母得到与A化3基因大小相符的PCR产物(约1150bp)，由1株酵母得到与 Sf曰1基因大小相符的PCR产物（约1150bp)。回收PCR产物，转化E. CO1 i D册α，进行蓝白斑筛 选，提取阳性重组质粒，经EcoRI酶切鉴定，插入片段大小都与预期目标基因接近，见图28所 示。图28中，左图（a)为PCR产物的电泳分析;右图（b)为重组质粒的酶切鉴定，Μ: Maker虹；1 ~5: DV10-A化 1、EC1118-A化 1、DV10-A化 2、YT0801-A化 3和 YT0801-Sf 曰1 的PCR产物；1〇 ~5〇: 重组质粒;h~5s: 1〇~5〇号重组质粒的酶切产物。
[0196] 二、利用大肠杆菌化2UDE3)分别对3个关键酶基因所编码的蛋白进行原核表达， 经SDS-PAGE检测，3种蛋白的分子量大小与采用生物信息学方法预测的大小基本一致。
[0197] (1)将YT0801-Aro8基因克隆到表达载体祀T-32a( + )上，构建了芳香族氨基转氨酶 I基因工程菌株。30°C下，经IPTG诱导化，工程菌株能表达重组酶AR08。经纯化，融合蛋白 AR08的浓度为462.3mg/L。经SDS-PAGE检测，其分子大小约为70kDa。
[0198] (2)将YT0801-Arol0基因克隆到表达载体祀T-32a( + )上，构建了苯丙酬酸脱簇酶 基因工程菌株。28 °C下，经IPTG诱导化，工程菌株能表达重组酶AR010。经纯化，融合蛋白 AR010的浓度为202.2mg/L。经SDS-PAGE检测，其分子大小约为90kDa。
[0199] (3)将DV10-A化1基因克隆到表达载体祀T-3 2a (+)上，构建了醇脱氨酶基因工程菌 株。28 °C下，经IPTG诱导3h，工程菌株能表达重组酶ADH1。经纯化，融合蛋白ADH1浓度为 252.6mg/L。经SDS-PAGE检测，其分子大小为61kDa。
[0200] 材料:质体转化受体菌E.coli D册cuE.coli BL2UDE3)由中山大学生命科学院刘 玉焕教授馈赠，也可W采用本领域常规使用的该种受体菌。PMD18-T载体购自Promega公司， 祀T-32a( + )载体由中山大学生命科学院刘玉焕教授馈赠，也可W采用本领域常规使用的该 载体。
[0201] 氨节青霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖巧（IPTG)、5-漠 -4-氯-3-吗I噪-β-D-半乳糖 巧(X-gal)、；^甲基氨基甲烧(Tris)、丙締酷胺(Acrylamide)、甲叉双丙締酷胺(BIS)、β- 琉基乙醇、漠酪蓝(ΒΡΒ)、琼脂糖、琼脂粉均为进口分装，购自北京普博欣生物科技有限公 司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司；蛋白纯化树 脂化S · bind resin及纯化柱购于Merck公司（德国）；各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、低 分子量蛋白标准，购自宝生物（大连）工程有限公司。DNAMarker虹、化b plus DNA Ladder (MD113)
[0202] 、蛋白质Marker,购自天根生化科技(北京)有限公司。心苯丙氨酸、草酷乙酸、天冬 氨酸、苯丙酬酸、苯乙醒、2-苯乙醇等化学标准品购自美国Sigma-Al化ich公司。其他化学试 剂均为国产分析纯或色谱纯。
[0203] 培养基：LB(Lur ia-Bertani )培养基（1000ml): lOg膜蛋白腺，5g酵母提取物， lOgNaCl，抑自然（固体培养基需另加入20g琼脂粉），12rC下灭菌15min。冷却至室溫加入氨 节青霉素到培养基中，终浓度为Ig/ULB培养基-X-gal-IPTG(lOOOml): lOg膜化蛋白腺，5g 酵母提取物，lOg化Cl，抑自然，20g琼脂粉，121°C下灭菌15min。冷却至室溫加入10化L的氨 节青霉素（lOOmg/mL)，在培养基中加入10化的IPTG( 24mg/mL)，200化的X-gal (20mg/mL)。 [0204] (1)引物设计
[020引根据目的序列两端的已知序列信息，设计PCR扩增引物，如表6所示。
[0206] 表6引物序列信息表
[0207]
[020引引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。DNA测序由华大基因有限公司完成。
[0209] (2)克隆基因的PCR扩增
[0210] W提取的克隆质粒为模板，进行PCR扩增反应，反应体系如下：
[0211]
[0212] YT0801-Aro8基因 PCR反应参数：94°C预变性5min，94°C变性45s，59°C退火45s，72 。(:延伸90s;共33个循环;72°C延伸10min，PCR产物4°C保存。
[0213] YT0801-Arol0 基因 PCR 反应参数：94°C 预变性 5min，94°C 变性 453,60°(：退火453,72 。(:延伸120s;共35个循环;72°C延伸10min，PCR产物4°C保存。
[0214] DV10-A 化 1 基因 PCR 反应参数:94°C 预变性 5min，94°C 变性 45s，58°C 退火 45s，72°C 延伸60s;共33个循环;72°C延伸10min，PCR产物4°C保存。
[0215] (3 )PCR扩增产物的回收、连接与转化
[0216] PCR扩增产物回收后，在4°C下连接PMD18-T载体过夜，转化E.coli D册α。连接反应 体系如下：
[0219] (4)重组质粒的双酶切鉴定与序列测定[0220] 提取重组质粒，进行双酶切鉴定，酶切体系如下：
[0217]
[021 引
[0221]
[0222] 本实施例所设及的含Aro8基因的重组质粒用EcoR I和趾0 I酶切鉴定，含ArolO和 A化1基因的重组质粒用BamH I和化0 I酶切鉴定，产物应为大小两个片段，将酶切鉴定无误 的重组质粒测序。
[0223] (5)载体祀T-32a( + )和重组质粒的连接与转化
[0224] 双酶切载体祀T-32a( + )和重组质粒，37°C水浴化，电泳。酶切体系如下：
[0225]
[0226] 用琼脂糖凝胶分别回收小、大DM片段，建立连接体系，插入片段的量与载体的量 视片段的大小及其DNA浓度而定，一般采取比例3:1。加入T4连接酶(350UAiL，1.0yL)及连接 酶缓冲液（1.0化），W去离子水补充体系至10化，轻弹混匀，16°C连接过夜，转化E.coli D册 曰，提取重组质粒，经双酶切鉴定和序列测定。根据基因的来源，表达载体质粒分别命名为 p32-YT0801-Aro8、p32-YT0801-Arol0 和 P32-DV10-A化 1。电泳分析如图 29、图 30 和图 31 所 示。并将此重组质粒进行测序鉴定，测序结果与目的基因序列完全一致。表明表达载体p32- YT0801-Aro8、p32-YT0801-Arol0 和 P32-DV10-A化 1 已构建成功。图29中，M:Maker虹；1:质 粒;2:酶切产物。图30中，~6:质粒；1〇,5〇:1号和5号质粒的酶切产物。图31中，1~ 5:质粒；1〇2，2〇，4〇: 1、2和4号质粒的酶切产物。
[0227] (6)表达载体的转化:表达载体质粒转化表达菌株大肠杆菌E.coli化2UDE3)。提 取重组质粒，经双酶切鉴定。
[022引重组蛋白的诱导表达及纯化：
[0229] (1)重组蛋白的诱导表达，主要包括W下步骤：（1)取保存的重组阳性克隆子于含 有10化g/mLAmp的LB平板划线，37°C培养过夜。（2)挑取单菌落，接种到含有l(K)yg/mLAmp的 15mL液体LB培养基中，37 °C，200r/m培养过夜。（3)取50化L菌液转接到含有Amp的50mLLB培 养基中（1:100)，37°C，200巧m扩大培养至0D为0.8(约2.化），添加 lOOmM的IPTG至其终浓度 为ImM。在一定溫度下诱导表达一定时间。（4)8000巧m离屯、15min，分别收集菌体和上清液，- 20°C保存备用。（5)超声破碎并进行蛋白电泳，观察蛋白表达情况。
[0230] (2)重组蛋白的提取:用PBS洗涂菌体2~3次，按原菌液体积~1/10的比例加入 裂解液，进行菌体重悬。采用冰浴超声破碎菌体，超声条件是功率400W，超声3s，间隔2s，破 碎60次。12000巧m离屯、5min，将上清用离屯、管收集，进行SDS-PAGE分析。
[0231] (3)重组蛋白的纯化，主要包括W下步骤：（1)将lmL50%Ni-NTA化S · bind树脂悬 液加入到4mLl XNi-NTA结合缓冲液中，轻柔混匀。（2)待树脂自然沉降后，用枪头吸取4mL上 清，加入4mL制备好的上清液，轻柔混匀，4°C结合60min。
[0232] (3)将裂解液Ni-NTAHis · Bind树脂混合物加入下端封闭的空色谱柱中，除去下端 封闭盖子，收集流出液(穿过峰），保存，用于SDS-PAGE电泳分析。（4似4mLlXNi-NTA漂洗缓 冲液漂洗两次，收集漂洗组分，用于SDS-PAGE电泳分析。（5) W0.5mLl X Ni-NTA洗涂缓冲液 洗脱目的蛋白4次，将洗脱组分分为4部分收集，并进行SDS-PAGE电泳分析各保存组分，最后 确定目的蛋白。（4)重组蛋白的SDS-PAGE电泳分析:本发明中重组蛋白的电泳分析，根据其 分子量选用8%的SDS-PAGE(〉10kDa)的电泳方案。电泳凝胶的配方，电泳参数及凝胶的染 色、脱色方法均参照标准实验方法进行。
[0233] (5)参考奥斯伯的方法(1998)测定重组蛋白的浓度：
[0234] 重组蛋白AR08浓度的测定:制作牛血清标准曲线，方程为Υ = 0.0009Χ-0.0086,方 程校正系数为0.9967,线性拟合较好。测定上清总蛋白和纯化后目的蛋白的浓度，分别为 1149.2mg/L和462.3mg/L，目的蛋白占总蛋白的40.2 %。
[0235] 重组蛋白AR010浓度的测定：测定上清液总蛋白和纯化后AR010蛋白的吸光度值， 根据BSA标准曲线，计算得知总蛋白和纯化后AR010的浓度，分别为789.9mg/L和202.2mg/L， 目的蛋白占总蛋白的25.6%。
[0236] 重组蛋白ADH1浓度的测定：测定上清液总蛋白和纯化后ADH1蛋白的吸光度值，根 据BSA标准曲线，计算得知总蛋白和纯化后AD化的浓度，分别为880.1 mg/L和252.6mg/L，目 的蛋白占总蛋白的28.7%。
[0237] Ξ、鉴定了巧巾重组酶的生物活性，并分别研究重组酶的酶学性质。
[0238] (1)经HPLC和LC-MS检测，重组酶AR08具有芳香族转氨酶I的正常生物活性，能够催 化心苯丙氨酸生成苯丙酬酸。AR08的最适溫度和最适抑分别为30°C和7.0,热稳定性较好。 其催化活性需要Mgh的参与，Fe3+、Fe2+和加2+抑制其活性。低浓度甲醇和DMS0等有机溶剂对 其酶活具促进作用。在30°C、pH7.0条件下，重组酶AR08作用于^phe的米氏常数Km为 6.577mM，最大反应速率Vmax为10.352μΜ/π?η;作用于草酷乙酸的米氏常数Km为15.779mM，最 大反应速率Vmax为16.863μΜ/π?η。最适条件下的酶活力为0.87皿olAmin · mL)。
[0239] (2)经GC-FID和GC-MS检测，重组酶AR010具有苯丙酬酸脱簇酶的正常生物活性，能 够催化苯丙酬酸生成苯乙醒。AR010的最适溫度和最适抑分别为37°CW及6.0,热稳定性良 好。AR010需WThPP和Mgh作为辅助因子，Cu2+和Mn2+对酶活有促进作用，Fe 3+等金属离子抑制 酶活。甲醇等有机溶剂都抑制其酶活。在37°C、pH6.0条件下，重组AR010作用于苯丙酬酸的 Km为8.239mM，最大反应速率Vmax为2.994μΜ/π?η。最适条件下的酶活力为0.22μπιο 1/(min · mL)。
[0240] (3)经册LC和LC-MS检测，重组醇脱氨酶AD化具有该酶的正常生物活性，能够将苯 乙醒还原为2-苯乙醇。ADH1的最适溫度和最适抑分别为35°C和6.0,对热敏感。Zn2+和Mgh促 进其活性，而化等金属离子抑制其活性。有机溶剂甲醇和低浓度的乙醇也能促进酶活。在 PH6.0和35°C条件下，ADH1作用于苯乙醒的米氏常数Km为3.612mM，最大反应速率Vmax为 18.587yM/min。最适条件下的酶活力为1.75皿ol/(min · mL)。
【主权项】
1. 一种2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，是在同一反应体系内通 过重组转氨酶I AR08、苯丙酮酸脱羧酶AR010和醇脱氢酶ADH1组成的共催化体系催化转化 L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸经由苯丙酮酸、苯乙醛转化为2-苯乙醇;其中，所述反应体系内，是 以L-苯丙氨酸和草酰乙酸为底物，重组酶AR08、AR010和ADH1按酶活力以1:0.25:1、1:1:1、 1:0.5:1或1:0.25:20J/U/U)配比确定，在pH值为5.5~7.5、Mg 2+浓度为1.0~5mM的反应体系 中，水浴温度为30~40°C条件下，反应转化4~7min后，以等体积的乙腈终止反应，即制得2-苯乙醇。2. 根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述L-苯 丙氨酸和草酰乙酸的摩尔比为0.75:1。3. 根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述 AR08、AR010 和 ADH1 的配比为1:0 · 25:1。4. 根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述Mg2+ 浓度为1 · 〇~2 · 5mM;优选为1 · 5mM。5. 根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述水浴 温度为33~40°C ;反应时间为5min。6. 根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述pH值 为5.5~6.5;优选所述pH值为6。7. 根据权利要求1所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，是先将所 述重组转氨酶I AR08、苯丙酮酸脱羧酶AR010和醇脱氢酶ADH1通过共固定方法制得共催化 体系Combi-CLEAs，然后利用Combi-CLEAs对L-苯丙氨酸进行催化转化，经由苯丙酮酸、苯乙 醛转化为2-苯乙醇。8. 根据权利要求7所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述反应 体系内，pH值为5.0、Mg2+浓度为1.0~5mM，水浴温度为40°C，反应转化时间为5min。9. 根据权利要求7所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述共催 化体系 Combi-CLEAs的制备方法为:将AR08、AR010 和ADH1按照1:1:1、1:0.5:1或1:0.25:1配 比后，经沉淀剂硫酸铵沉淀后形成多酶聚集体，加入戊二醛对多酶聚集体进行交联，制得多 酶共固定体系；其中，硫酸铵的饱和度为60~90 %，pH值为4~6，戊二醛的加入量按照其终 浓度为〇. 05~0.25 %确定。10. 根据权利要求9所述2-苯乙醇的非细胞合成生物学制备方法，其特征在于，所述沉 淀剂硫酸铵的饱和度70% ;沉淀剂硫酸铵的pH值为5;AR08、AR010和ADH1的酶配比为1:0.5: 1;所述戊二醛的加入量按照其终浓度为〇. 1 %确定;所述交联的温度为20~35°C ;所述交联 的时间为30~150min。
【文档编号】C12N11/18GK106011184SQ201610464256
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】林俊芳, 郭丽琼, 刘晓蓉, 云帆
【申请人】华南农业大学