N-氨甲酰-d-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体及其工程菌的构建的利记博彩app
【专利摘要】N?氨甲酰?D?对羟基苯甘氨酸水解酶突变体及其工程菌的构建，通过定向进化技术获得的5个突变体与N?氨甲酰?D?对羟基苯甘氨酸水解酶的区别分别为：N?氨甲酰?D?对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第193位的半胱氨酸突变为天冬酰胺；第200位的苏氨酸突变为丙氨酸；第226位的天冬酰胺突变为酪氨酸；第243位的半胱氨酸突变为天冬酰胺；第250位的半胱氨酸突变为酪氨酸；并进行工程菌构建，将其应用于D?对羟基苯甘氨酸的生产中，和野生酶相比，在对氧气的耐受性、酸碱的耐受性及酶活方面有很大提升。
【专利说明】
N-氨甲醜-D-对超基苯甘氨酸水解酶突变体及其工程菌的 构建
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程领域，尤其设及一种编码N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解 酶突变体及其工程菌的构建。
【背景技术】
[0002] D-氨基酸及其衍生物是医药及食品领域的重要原材料，被广泛地用于半合成抗 生素、多肤激素、拟除虫菊醋、杀虫剂和甜味剂等的中间物，因而引起越来越多的兴趣，特别 是作为半合成抗生素的侧链原料一一D-型氨基酸更受到人们的关注。D-对径基苯甘氨酸 值-P-HPG)是制备β-内酷胺类抗生素（如青霉素、头抱菌素）的重要原料W及合成多种多 肤类激素和农药的主要侧链，广泛用于药学领域。
[0003] D-对径基苯甘氨酸作为非天然氨基酸，它不能利用自然微生物发酵生产，目前其 制备方法主要有化学法和生物酶法两大类。化学制备反应条件相对比较剧烈、污染大、产 率低并且费用高，已逐渐被反应条件溫和，无需高溫高压，成本低，无污染，底物转化率和光 学活性都较高的生物酶法所代替。酶法的技术原理是：用D-乙内酷脈酶（也称为D-海因 酶）将Dk对径基苯海因不对称水解成Ν-氨甲酯基-D-对径基苯甘氨酸，然后在Ν-氨甲 酷-D-对径基苯甘氨酸水解酶（简称DCase)的作用下，将N-氨甲酯基-D-对径基苯甘氨 酸不可逆水解成D-p-HPG(D-对径基苯甘氨酸）。
[0004] 但工业生产中发现，从微生物细胞中分离、提取N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水 解酶制成固定化酶的技术已有使用，但酶的成本过高，且产品收率也偏低，而且由于细胞含 酶活力偏低，采用常规细胞固定化技术可增加酶活稳定性，但固定化细胞酶活降得更低而 难W使用。因此，在生产D-对径基苯甘氨酸的过程中，由于DCase催化效率低、稳定性差的 缺点，导致中间物N-氨甲酯基-D-对径基苯甘氨酸大量积累，终产物D-对径基苯甘氨酸产 率低。
[0005] 虽然天然酶分子在自然条件下已进化了千百万年，但是因为天然酶分子存在的环 境与实际应用环境的不同，酶分子仍然藏着巨大的进化潜力。运用分子定向进化技术比如 易错PCR技术、DNA改组技术和定点突变技术等对微生物来源的酶进行分子改性和人工进 化在近些年中取了令人瞩目的进展，运种分子水平上的人工定向进化技术是通过体外重组 来改造祀基因，并定向筛选具有预期性状的突变体，从而改造具有新功能的改性的酶，大大 加速了蛋白质的进化进程。其中，突变作为蛋白质工程中的一种重要手段，在转氨酶的改 造中已经发挥了重要的作用，不仅可W阐明转氨酶的一些特殊机理，而且能够在一定程度 上改良转氨酶的动力学活性。因此，在生物工程中，利用突变来解决相关问题的做法日益受 到重视，本发明旨在制得N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的突变体，W提高酶活及氧 气、酸碱耐受性，并将其应用于D-对径基苯甘氨酸的生产中，从而创造具有新功能的改性 的酶，W大大加速蛋白质的进化进程。
【发明内容】
[000引本发明的一个目的在于提供N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体，其中相 比于野生酶，所述N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体的基因表达的突变酶，在对 氧气的耐受性、对酸碱的耐受性及酶活方面有显著提升。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体的 DNA序列。
[0008] 本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体的 突变酶的氨基酸序列。
[0009] 本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体的 基因编码序列。
[0010] 本发明的另一目的在于提供一种包含有突变水解酶基因的重组质粒的构建方法。
[0011] 本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体的 重组表达质粒。
[0012] 本发明的另一目的在于提供N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体构建的 工程菌。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体在 D-对径基苯甘氨酸的生产中的应用。
[0014] 本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体在 D-对径基苯甘氨酸生产中的应用。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体的 编码基因在D-对径基苯甘氨酸生产中的应用。
[0016] 本发明的另一目的在于提供一种重组表达质粒及其在D-对径基苯甘氨酸生产中 的应用。
[0017] 本发明的另一目的在于提供所述基因工程菌在D-对径基苯甘氨酸生产中的应 用。
[001引为达到上述目的W及本发明的其他目的和优势，本发明先采用易错PCR技术和 DNA改组技术相结合的方法，W从海洋链霉菌中筛选的N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解 酶基因作为模板基因，对其进行随机突变。N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的序列与 Genebank的登陆号为AF320814的酶序列同源性为97%，因此可W认定为同一种酶，其是由 304个氨基酸组成，其编码DNA的序列包括9巧bp，其编码DNA序列及氨基酸序列如SEQ ID NO. 1和沈Q ID NO. 2所示。
[0019] 本发明的筛选体系是W反应体系的抑升高引起指示剂颜色变化作为筛选指标将 正突变检出。氨甲酯水解酶催化反应后，使反应体系的抑得到提高，而该方法使用的酪红 指示剂能在抑大于6. 3时由黄色变为红色。
[0020] 通过上述方法，本发明筛选到了 5个酶活性及氧气受耐性、酸碱耐受性均较高的 突变体，本发明所获得的5个突变体与N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的区别分别 为：
[0021] N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第193位的半脫氨酸突变为 天冬酷胺；
[0022] N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第200位的苏氨酸突变为丙 氨酸；
[0023] N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第226位的天冬酷胺突变为 酪氨酸；
[0024] N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第243位的半脫氨酸突变为 天冬酷胺；
[0025] N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第250位的半脫氨酸突变为 酪氨酸；
[0026] 根据本发明，重组质粒克隆上述的所述N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变 体的编码序列。
[0027] 根据本发明所述的N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体的DNA序列克隆 入宿主细胞，并将所述宿主细胞的发酵菌体用于D-对径基苯甘氨酸的生产中。
[0028] 根据本发明，将所述重组质粒转化入宿主细胞获得基因工程菌。
[0029] 相比于野生型N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶（野生酶），本发明的5个突 变体的酶活、抗氧化性和耐高溫性均得到提高，显示出在D-对径基苯甘氨酸生产中的潜在 应用价值。因此，适于将本发明提供的N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体、N-氨 甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体的编码基因、N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶 突变体的重组质粒、N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体的基因工程菌应用于D-对 径基苯甘氨酸的生产制造中。
【具体实施方式】
[0030] W下描述用于掲露本发明W使本领域技术人员能够实现本发明。W下描述中的优 选实施例只作为举例，本领域技术人员可W想到其他显而易见的变型。在W下描述中界定 的本发明的基本原理可W应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案W及没有背 离本发明的精神和范围的其他技术方案。
[0031] W下实施例中，所使用的基因-pET28a-D化se是指从海洋链霉菌Streptomyces sp. 7-145(CGMCC NO. 7914)中筛选出的EH：ase基因和祀T28a组建的重组子，其N-氨甲 酷-D-对径基苯甘氨酸水解酶基因序列及编码的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示。
[0032] 实施例1、N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶基因的克隆
[0033] 1. 1PCR 扩增
[0034] 引物设计
[0035] DCase-Fl :CGGGATCC GCTCGTCAGATGATATTCGCAG
[0036] DCase-Rl :CTTACGATACTTGCCGACGATCTTG
[0037] DCase-F2 :CAAGATCGTCGGCAAGTATCGTAAG
[0038] DCase-R2 :GAGATGGTGGAAGGACGTCAGGTGG
[0039] DCase-F3 :CCACCTGACGTCCTTCCACCATCTC
[0040] DCase-R3 :CCCAAGCTTGAGTTCCGCGATCAGACC
[0041] W祀T28a-DCase质粒为模板，使用引物DCase-Fl和DCase-R3进行PCR扩增。扩 增体系：2XPCRmix 10μ1，(Μ &0 8μ1，模板 DM 1μ1(约 50ng-200ng)，上、下游引物各 0. 5 μ 1 (浓度为 20 μ Μ)。
[004引 PCR反应条件为：96 °C，2min预变性；96 °C，Imin变性，50 °C，30S退火，72 °C延伸 lmin(30个循环）；最后72°C延伸5min，4°C下保存。
[0043] 1. 2含N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的质粒构建
[0044] PCR扩增结束后，先使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120伏，割胶后，用胶 回收试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）回收900bp左右的目的DNA片段，接着用 BamHI和Hindlll进行双酶切，将所获得的DNA片段和载体祀T-28a连接（宝生物工程有 限公司），之后将链接产物转化入大肠杆菌D册a感受态细胞（北京全式金生物技术有限公 司），在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选。
[0045] 重组子用限制性内切酶BamHI和Hindlll进行双酶切验证。酶切产物在此进行电 压为120伏的琼脂糖凝胶电泳，验证片段大小分别为900bp左右的片段和5300bp左右的载 体。
[0046] 1. 3表达N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的基因工程菌株构建
[0047] 用质粒提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）提取重组子质粒，然后按 常规方法转化入E. coli BL21 (北京全式金生物技术有限公司），即获得N-氨甲酯水解酶基 因的大肠杆菌工程菌。
[0048] 实施例2、N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶表达基因的定向突变
[004引 2.1引物设计
[0050] DCase-Fl :CGGGATCC GCTCGTCAGATGATATTCGCAG
[0051] DCase-Rl :CTTACGATACTTGCCGACGATCTTG
[0052] DCase-F2 :CAAGATCGTCGGCAAGTATCGTAAG
[0053] DCase-R2 :GAGATGGTGGAAGGACGTCAGGTGG
[0054] DCase-F3 :CCACCTGACGTCCTTCCACCATCTC
[00巧]DCase-R3 :CCCAAGCTTGAGTTCCGCGATCAGACC
[0056] W祀T28a-DCase重组子为模板，用引物DCase-F2和DCase-R2进行易错PCR扩增， 易错PCR反应体系巧Oul):模板基因20ng，上下引物各300pmol，dATPO. 2mm，dGTPO. 2mm， dCTPlmm，dTTPlmm，MgClz 7mm，MnClz 0. 1mm，Taq 酶 2.抓（天根生化科技有限公司）。
[0057] PCR 条件为：96°C，5min 预变性；96°C，30s 变性，50°C，30s 退火，72°C延伸 30s(30 个循环）；最后72°C延伸5min，4°C下保存。
[0058] 2. 2含N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变基因的质粒构建
[0059] PCR扩增结束后，先使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120伏，割胶后，用胶 回收试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）回收400bp左右的目的DNA片段，将所获 得的DNA片段和载体PMD18-T载体连接（宝生物工程有限公司），之后将链接产物转化入大 肠杆菌D册a感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），在含氨节青霉素的LB平板上筛 选。之后挑取单菌落，确定突变率。
[0060] 2. 3N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变库的构建
[0061] W 祀T28a-DCase 重组子为模板，分别用引物 DCase-Fl、DCase-Rl 和 DCase-F3、 DCase-R3进行PCR扩增，PCR反应体系（50ul):模板基因20ng，上下引物各300pmol，M拆〇4 1mm. KOD-PIUS 聚合酶 lU (Toyobo 公司）。
[0062] PCR 条件为：95°C，5min 预变性；95°C，30s 变性，54°C，30s 退火，68°C延伸 30s(30 个循环）；最后68°C延伸5min，4°C下保存。
[0063] 段基因的PCR结果为混合模板，用引物DCase-Fl和DCase-R3进行PCR扩 增，PCR扩增体系为：模板基因2化g，上下引物各3(K)pmol，Μ拆〇4 1mm，K0D-P1US聚合酶 llKToyobo 公司）。
[0064] PCR 条件为：95°C，5min 预变性；95°C，30s 变性，54°C，30s 退火，68°C延伸 lmin(30 个循环）；最后68°C延伸5min，4°C下保存。
[0065] 2. 4含N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变基因的质粒构建
[0066] PCR扩增结束后，先使用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，电压为120伏，割胶后，用胶 回收试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）回收900bp左右的目的DNA片段，接着用 BamHI和Hindlll进行双酶切，将所获得的DNA片段和载体祀T-28a连接（宝生物工程有 限公司），之后将链接产物转化入大肠杆菌D册a感受态细胞（北京全式金生物技术有限公 司），在含卡那霉素抗生素的LB平板上筛选。
[0067] 重组子用限制性内切酶BamHI和Hindlll进行双酶切验证。酶切产物在此进行电 压为120伏的琼脂糖凝胶电泳，验证片段大小分别为900bp左右的片段和5300bp左右的载 体。
[0068] 实施例3、N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变库的筛选
[0069] 3. 1含N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变库的工程菌构建
[0070] 用质粒提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）提取重组子质粒，然后按 常规方法转化入E.coli BL2U北京全式金生物技术有限公司），转化细胞涂于含氨节抗生 素的LB平板（膜蛋白腺1%，酵母提取物0.5%，氯化钢1%，琼脂1.5% )上，37°C培养。
[0071] 3. 2N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶突变体筛选与鉴定
[007引挑取单菌落培养于含200ul含卡那抗生素巧Oug/ml)的96孔板上，当0D600达到 0. 6时，加入1MIPTG使其终浓度为0. 2mM，18°C培养过夜。
[0073] 每孔取出150ul菌液与96孔板上，放置-80°C，冰冻1.化，随后放置室溫解冻比。
[0074] 取解冻好的菌液20ul转移入96孔板中，分别进行抗氧化（双氧水终浓度2mM处 理20min，25°C )和耐高溫（65°C处理30min)处理。
[00巧]在处理好的菌液中加入200ul反应液巧g/L N-氨甲酯基-D-对径基苯甘氨酸，ImM 邸ΤΑ和0. 01 %的酪红，P册.0)充分混合，分别用没处理的N-氨甲酯水解酶和d地2〇作为阳 性跟阴性对照，37°C解育30min，发生颜色从淡黄色变成红色的即为阳性菌落。
[0076] 3. 3筛选结果
[0077] 通过上述筛选，我们共获得五个重组蛋白抗氧化性和热稳定性提高的突变体，通 过测序，发现它们的突变位点分别是C193N、T200A、N226Y、C243N和C250Y。具体内容见表 1 ：
[0078] 表1五个DCase突变体的氨基酸序列和基因序列变化的结果
[0079] 1_0080」
[0081] 实施例4、突变重组酶与未突变酶抗氧化性和耐高溫性的对比
[0082] 4.1目的蛋白的富集
[0083] 分别将实施案例3. 2中的菌液转接到LB液体培养基中进行种子培养，待种子成 熟后按4%接种量转接至20〇111比日（卡那抗生素终浓度5〇11肖/1111)培养基中，随后实时监控 0D600,待0D600到0. 6时，加入1MIPTG使其终浓度为0. 2mM，18°C诱导表达1地。
[0084] 4. 2粗酶的制备
[00财将4. 1所得菌液进行离屯、处理，去除上清。用lOOmM，PH7. 5的憐酸盐缓冲液重悬， 于高压均质破碎仪（美国P皿）进行破碎。将得到粗酶液与4°C，13000巧m/min离屯、30min， 取上清，置于4°C备用。
[0086] 4. 3粗酶液的抗氧化处理和热处理
[0087] 分别取4. 2中制得的粗酶液500ul与1. 5ml离屯、管中，一式五份，同时平行做Ξ组 实验。
[0088] 处理一：在离屯、管中，依次加入双氧水使其终浓度为lmM，2mM，3mM，4mM，5mM，处理 比后，放置4°C备用。具体结果见表2:
[0089] 表2经双氧水处理后DCase和突变体酶的酶活情况比较
[0090]
[0091] 处理二：将所得的酶液置于65°C的金属浴（北京康润诚业生物科技有限公司）中 分别处理0min，30min，60min，90min，120min，之后放置4°C备用。具体结果见表3 :
[0092] 表3经65°C高溫处理后DCase和突变体酶的酶活情况比较
[0093]
[0094] 4. 4酶促水解反应
[0095] 将4. 3中处理过的粗酶液500ul加入400ul的lOOmM的N-氨甲酯-D-对径基苯 甘氨酸，进行水解反应，37°C，200巧m。30min后，加入500ul的10%盐酸终止反应。
[0096] 4. 5、酶活的测定
[0097] 将4. 4中的反应物稀释3倍后，13000巧m/min离屯、lOmin，取上清进行高效液相色 谱检测。
[0098] HPLC测定方法如下：甲醇（含0. 01 % TFA)和水（含0. 01 % TFA)为流动相，比例 为5:95,流速为1.0ml/min，检测波长为267nm。检测不同物质峰面积和保留时间及相同物 质的不同峰面积，同时绘制标准曲线，然后根据测定的标准品值计算样品酶活的绝对数值。
[0099] 1U酶活定义为1分钟产生lumol D-对径基苯甘氨酸所需的酶量。
[0100] 剩余酶活力计算公式=酶经抗氧化或者高溫处理后的酶活^酶在零度保溫后的 酶活X 100%。
[0101] 通过上述数据比较可W发现，相比于野生酶，N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解 酶的突变体在对氧气的耐受性、对酸碱的耐受性及酶活方面有很大提升。
[0102] 上述实施例显示，N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸水解酶的5个突变酶在可溶性表 达和单位菌体酶活方面都优于野生型，同时也进一步表明，N-氨甲酯-D-对径基苯甘氨酸 水解酶的突变体在D-对径基苯甘氨酸的生产中具有很大的应用潜力。因此，采用定性进化 技术改造工业用酶是一个十分有效的手段。
[0103] 本领域的技术人员应理解，上述描述中所示的本发明的实施例只作为举例而并不 限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例 中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可W有任何变形或修改。
[0104]
[0105]
[0106]
【主权项】
1. 一种N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的突变体，其特征在于，所述突变体的氨 基酸序列由以下任一项所述的氨基酸序列组成： N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第193位的半胱氨酸突变为天冬 酰胺； N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第200位的苏氨酸突变为丙氨 酸； N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第226位的天冬酰胺突变为酪氨 酸； N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第243位的半胱氨酸突变为天冬 酰胺； N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列中第250位的半胱氨酸突变为酪氨 酸； 其中所述N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的氨基酸序列为如SEQ ID NO. 2所示 的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶序列。2. -种编码权利要求1所述的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的DNA序 列。3. 根据权利要求2所述的DNA序列，其特征在于，由以下任一项所述的DNA序列组成： A、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第577bp~ 579bp的TGC突变为AAT ; B、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第598bp~ 600bp的ACC突变为GCT ; C、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第676bp~ 678bp的AAC突变为TAT ; D、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第727bp~ 729bp的TGC突变为AAC ; E、 SEQ ID NO. 1所示的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的基因序列中第748bp~ 750bp的TGC突变为TAT。4. 一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒克隆有如权利要求1所述的N-氨甲 酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶的突变体的编码序列。5. -种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将权利要求4中所述的重组质粒 转化入宿主细胞而获得。6. 根据权利要求1所述的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体在D-对羟基苯 甘氨酸生产中的应用。7. 根据权利要求2所述的N-氨甲酰-D-对羟基苯甘氨酸水解酶突变体的编码基因在 D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。8. 根据权利要求4所述的重组质粒在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。9. 根据权利要求5所述的工程菌在D-对羟基苯甘氨酸生产中的应用。10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将如权利要求2所述的DNA序列克隆入 宿主细胞，并将所述宿主细胞的发酵菌体用于D-对羟基苯甘氨酸的生产。
【文档编号】C12N1/21GK106011117SQ201510457039
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2015年7月30日
【发明人】赵德, 杨兆勇, 任丽, 任敏, 李亚东, 金媛媛, 王国勤, 罗尚菊, 易丹, 王翠娟
【申请人】重庆桑禾动物药业有限公司