一株重金属铬单克隆抗体杂交瘤细胞株c2及其应用
【专利摘要】一株重金属铬单克隆抗体杂交瘤细胞株C2及其应用，属于食品安全检测技术领域。本发明通过铬完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠，经过间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到重金属铬单克隆抗体杂交瘤细胞株C2。此细胞株分泌的单克隆抗体可识别重金属三价铬离子，特异性好和灵敏度高，可以用于食品安全中重金属铬的残留检测。本发明获得的抗三价铬离子单克隆抗体细胞株C2，对Cr3+?EDTA有较好的检测灵敏度和特异性（IC50值为5ng/mL）。该细胞株C2分泌的抗体稳定性好：杂交瘤细胞冻存于液氮中至少保存5年，纯化的抗体在?20℃冰箱中至少可存放2年；抗体特异性高：其与Fe3+的交叉反应率为1.12%，与其他金属离子暂未发现交叉反应。CGMCC No.1202020160120
【专利说明】
一株重金属铬单克隆抗体杂交瘤细胞株C2及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及一株重金属铬单克隆抗体杂交瘤细胞株C2及其应用，属于食品安全检测技术领域。
【背景技术】
[0002]络(chromium，Cr)是一种过渡元素，自然界中不存在游离态的络，主要以三价和六价铬盐的形式存在。三价铬是人体必需的微量元素，铬缺乏会增加患心血管疾病的风险，但过量的铬会损害人体健康。六价铬的毒性是三价铬的100倍。六价铬进入人体后，会引发氧化应激、染色体畸变、细胞凋亡、多种DNA损伤，从而造成机体多处组织、器官、系统损伤。六价铬还被认为是一种强致癌物。因此，我国《生活饮用水卫生标准》规定饮用水铬离子含量不得超过SOng/mUGB 2762-2012《食品中污染物限量》中规定粮食食品络离子含量不超过1000ng/mL，果蔬类不超过500ng/mL，动物性肉蛋不超过1000ng/mL。
[0003]铬化合物广泛应用于制革、冶金、纺织品生产以及镀铬行业中，环境中的铬污染日趋严重，铬超标事件屡有发生。重金属铬的检测受到广泛关注。
[0004]目前常用的铬检测方法有电感耦合等离子体质谱法、电化学分析法、石墨炉原子吸收光谱法等仪器检测方法，检测耗时长、费用高，难以用于现场检测。因此建立一种快速简便的铬化合物检测方法具有重要意义。酶联免疫法(ELISA)是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高检测灵敏度和高特异性的单克隆抗体是免疫学检测的前提。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株对铬离子具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株C2。
[0006]本发明的技术方案，一株重金属铬单克隆抗体杂交瘤细胞株C2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.12020。
[0007]重金属铬单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCCN0.12020的重金属铬单克隆抗体杂交瘤细胞株C2分泌产生。
[0008]所述重金属铬单克隆抗体的应用，其可用于食品安全中重金属铬的残留检测。
[0009]本发明提供的细胞株C2的制备基本步骤为:
I)完全抗原的合成:取卜(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸1mg溶于ImL二甲基亚砜中形成A液；1mg牛血清蛋白溶于ImL pH9.0的1mM HBS缓冲液中形成B液；取10yL A液逐滴加入B液中，调节pH9.0，搅拌24h;用超滤管离心，得到1_(4_异硫氰苄基)乙烯基二胺_N，N，N’，N’_四乙酸-牛血清蛋白；取150yL lmg/mL硝酸铬标液逐滴加入到1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N ’，N ’ -四乙酸-牛血清蛋白中，调节pH6?7搅拌5h;用超滤管离心，得到检测抗原(包被原)铬-卜(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸-牛血清蛋白。用双功能螯合剂1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸将铬离子偶联到匙孔血蓝蛋白上，制成免疫抗原；
2)小鼠的免疫:三价铬离子免疫抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用完全免疫原(不含佐剂)冲击免疫;通过间接ELISA检测血清效价和抑制；
3)细胞融合与细胞株建立:通过聚乙二醇(PEG4000)法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株C2;
4)杂交瘤细胞株性质的鉴定:通过ELISA法测定灵敏度和特异性。
[0010]本发明的有益效果:本发明获得的抗三价铬离子单克隆抗体杂交瘤细胞株C2，对Cr3+-EDTA有较好的检测灵敏度和特异性(IC5q值为5yg/L)。该细胞株C2分泌的抗体稳定性好:杂交瘤细胞冻存于液氮中至少保存5年，纯化的抗体在-20°C冰箱中至少可存放2年;抗体特异性高:其与Fe3+的交叉反应率为1.12%，与其他金属离子暂未发现交叉反应。
[0011 ]生物材料样品保藏:单克隆细胞株C2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.12020，保藏日期2016年I月20日。
【具体实施方式】
[0012]本发明下面的实施例仅作为本
【发明内容】
的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
[0013]本发明通过用三价铬离子免疫原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELI SA和间接竞争ELI SA筛选细胞上清，最终得到了对Cr3+-EDTA有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株C2。
[0014]实施例1:杂交瘤细胞株C2的制备
(I)完全抗原的合成:取1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸1mg溶于ImL二甲基亚砜中形成A液；1mg牛血清蛋白溶于ImL pH9.0的1mM HBS缓冲液中形成B液；取10yL A液逐滴加入B液中，调节pH9.0，搅拌24h;用超滤管离心，得到1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺_N，N，N’，N’_四乙酸-牛血清蛋白；取150yL lmg/mL硝酸铬标液逐滴加入到1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N ’，N ’ -四乙酸-牛血清蛋白中，调节pH6?7搅拌5h;用超滤管离心，得到检测抗原(包被原)铬-1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸-牛血清蛋白。用双功能螯合剂1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N，N，N’，N’_四乙酸将铬离子偶联到匙孔血蓝蛋白上，制成免疫抗原。
[0015](2)动物免疫:选择健康的6?8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取三价铬离子免疫抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。
[0016](3)细胞融合:在冲击免疫三天后，按照常规PEG(聚乙二醇，分子量为4000)方法进行细胞融合，具体步骤如下:
a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPM1-1640基础培养液中，进行细胞计数；
C、将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比1:10的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间Imin，之后按照从慢到快，加入RPM1-1640基础培养液，离心后悬浮于含20%胎牛血清、2%的50\似1'的1?^1-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37°(:、5%0)2的培养箱中培养。
[0017](4)细胞筛选与细胞株建立:在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPM1-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100XHT的RPM1-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。
[0018]筛选分两步:第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用Cr3+-EDTA为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对Cr3+-EDTA标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株C2o
[0019](5)单克隆抗体的制备与鉴定:取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油ImL; 7天后每只小鼠腹腔注射I X 16杂交瘤细胞C2，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20°C保存。
[0020]使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体对Cr3+-EDTA的IC5q分别为:5yg/L，说明对Cr3+-EDTA有很好的灵敏度，可用于三价铬离子免疫分析检测。
[0021](6)抗体应用:将杂交瘤细胞株C2通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于水中三价铬离子的间接竞争酶联免疫检测，具体步骤如下:
6.1包被:将包被原(Cr3+-1TCBE-BSA)用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液稀释为1.0yg/mL，I OOyL/孔加入酶标板，37 °C反应2h ；
6.2洗涤:将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min ；
6.3封闭:拍干后，加入200yL /孔封闭液，37°C反应2h;洗涤后烘干备用；
6.4加样:加入Cr3+-EDTA和抗体:用含ImM EDTA的ΙΟμΜ HBS缓冲液倍比逐级稀释Cr3+，每孔加入50yL，再加入稀释一定倍数的抗体溶液50yL，37 °C反应0.5h;充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠 IgG，10yL /孔，37°C 反应0.5h ；
6.5显色:将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入10yL的TMB显色液，37 °C避光反应15min；
6.6终止和测定:每孔加入50yL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD45Q值；
6.7结果判读:以OD45q值大于或等于阴性对照孔的2.1倍(S卩P/N彡2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELI SA效价，计算抑制率。抗体I C5o=5ng/ mL。结果表明，制备的抗体能较好的识别Cr3+-EDTA。
[0022](7)溶液的配置:
碳酸盐缓冲液(CBS):称取Na2CO3 1.59g,NaHCO3 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至I OOOmL，4 °C贮存备用；
磷酸盐缓冲液(PBS):8.0Og NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4.12 H2O,溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2?7.4，定容至100mL; PBST:含0.05% 吐温 20的PBS;
HBS 缓冲液:8.0Og NaCl, 0.2g KCl，HEPES(4_ 羟乙基哌嗪乙磺酸)2.386g，溶于 800mL 纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2?7.4，定容至100mL;
TMB显色液:A液:Na2HPO4.12H20 18.43g，柠檬酸9.33g，纯水定容至 1000mL;B液:60mgTMB溶于10mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
[0023]综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术。
【主权项】
1.一株重金属铬单克隆抗体杂交瘤细胞株C2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC N0.12020。2.重金属铬单克隆抗体，其特征在于:它由所述保藏编号为CGMCCN0.12020的重金属铬单克隆抗体杂交瘤细胞株C2分泌产生。3.权利要求2所述重金属铬单克隆抗体的应用，其特征在于:用于食品安全中重金属铬的残留检测D
【文档编号】C12N5/20GK106011077SQ201610480745
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】胥传来, 邹淑珍, 匡华, 徐丽广, 刘丽强, 吴晓玲, 宋珊珊, 胡拥明, 马伟
【申请人】江南大学