一株具有益生作用的凝结芽孢杆菌hew-b379及其应用
【专利摘要】本发明提供了一株具有益生作用的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，该菌株命名为HEW?B379，保藏编号为CGMCC No.12553。本发明的凝结芽孢杆菌HEW?B379具有显著的益生性，可有效抑制肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌的生长繁殖。本发明凝结芽孢杆菌HEW?B379具有较强的抗逆性，可以耐高温、耐模拟胃液、模拟胆盐环境，且能保持99％?100％的存活率，该菌可有效调节动物肠道微生物平衡，抑制有害微生物生长，促进动物对营养的吸收，提高饲料转化率，提高动物生产性能。CGMCC No.1255320160527
【专利说明】
-株具有益生作用的凝结芽抱杆菌HEW-B379及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于微生物学领域，具体地说，设及一种具有益生作用的凝结芽抱杆菌 HEW-B379及其应用。
【背景技术】
[0002] 随着人们对畜产品安全和环境保护意识的不断加强，作为抗生素的替代品，益生 菌越来越多的应用于动物营养和饲料中。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有 益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂。其主要作用效果体现在改善动物新陈代 谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。
[0003] 由于芽抱杆菌对干燥、高溫、高压、氧化等不良环境抵抗力很强，运种稳定性增加 了它作为益生菌的潜力。因此，获得新型具有益生特性的芽抱杆菌的研究具有重大意义。分 离和筛选抗病原菌且具有益生效果的凝结芽抱杆菌，可W更好的应用于饲料添加剂，W代 替抗生素。但凝结芽抱杆菌作为益生菌制剂或饲料添加剂的研究与应用较少，尤其是在替 代饲养抗生素和促进动物对营养的吸收，提高动物生产性能等方面。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种具有益生作用的凝结芽抱杆菌肥W-B379及其应用。
[0005] 为了实现本发明的目的，本发明的凝结芽抱杆菌肥W-B379(Bacillus coagulans) 是从健康猪肠道内容物中分离的芽抱杆菌菌株，通过菌落形态观察、发酵性能检测、抑菌性 能检测、16S rDNA基因序列分析和体外益生效果评价得到，该菌株抗逆性强，耐酸碱及耐高 溫强、益生性更加显著。其16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。该菌株已于2016年5月27日保 藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为凝结芽抱杆菌 (Bacillus coagulans),保藏编号为CGMCC No. 12553。
[0006] 本发明提供的凝结芽抱杆菌(Bacillus coagulans)皿W-B379具有W下微生物学 特征：凝结芽抱杆菌皿W-B379是革兰氏阳性杆菌，在MRS培养基上生长良好，白色菌落、圆 形、有光泽、边缘整齐，菌落直径为2~3mm，菌落形态如图1，显微镜下菌体呈直杆状，芽抱短 生，兼性厌氧生长，经革兰氏染色后菌株形态如图2;凝结芽抱杆菌肥W-B379生长适宜溫度 范围：4Γ-65°C，最适生长溫度:20°C-45°C ;生长适宜pHl. 5-10，最适pH值为6-8。部分生理 生化特性如表1。
[0007] 本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No. 12553的凝结芽抱杆菌HEW-B379的菌剂。 [000引本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No. 12553的凝结芽抱杆菌肥W-B379的饲料 添加剂。
[0009] 饲料添加剂中凝结芽抱杆菌HEW-B379的活菌数为1.0X 106~1.0X lO^CFU/g。优 选地，饲料添加剂中凝结芽抱杆菌HEW-B379的活菌数为1 X 107CFU/g。
[0010] 本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No. 12553的凝结芽抱杆菌肥W-B379的动物 饲料。
[0011]本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No. 12553的凝结芽抱杆菌肥W-B379的药物， 所述药物为预防或治疗动物腹泻的药物。
[0012]本发明提供了含有保藏编号为CGMCC齡.12553的凝结芽抱杆菌肥胖-8379或含有 其的菌剂在提高饲料转化率，提高动物生产性能中的应用。
[0013]本发明提供了含有保藏编号为CGMCC齡.12553的凝结芽抱杆菌肥胖-8379或含有 其的菌剂在制备微生态益生制剂中的应用。
[0014]本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No.l2553的凝结芽抱杆菌肥W-B379或含有 其的菌剂在制备预防或治疗动物腹泻的药物中的应用。
[001日]本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No. 12553的凝结芽抱杆菌肥W-B379或含有 其的菌剂在制备广谱抗菌剂中的应用。
[0016]所述广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗W下菌:大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙口氏 菌、沙口氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌。
[0017]本发明提供了含有保藏编号为CGMCC No. 12553的凝结芽抱杆菌肥W-B379或含有 其的菌剂在食品制造中的应用。优选地，所述的食品为动物用食品。
[0018] 本发明中所述凝结芽抱杆菌HEW-B379的培养方法如下：
[0019] 取凝结芽抱杆菌皿W-B379种子液l-5mL(种子液是挑取的单个菌落在种子液培养 基中培养的，其活菌浓度Wl〇9CFU/mL计;种子液的培养基和培养条件与发酵的培养基和培 养条件相同），接种到300mL培养基中，进行摇瓶发酵培养。
[0020] 所述培养基由如下组分组成：可溶性淀粉0.5-5 %，薦糖0.5-5 %，酵母浸粉0.5- 3%，蛋白腺0.1-1.0%，憐酸氨二钟0.05-0.5%，硫酸儀0.05-0.5%，氯化钢0.1-2.0%，碳 酸巧0.1-1.0%，余量为水，pH6.8±0.2;其中，优选为：可溶性淀粉1.2%，薦糖1.8%，酵母 浸粉1.0%，蛋白腺1.5%，憐酸氨二钟0.08%，硫酸儀0.2 %，氯化钢0.5 %，碳酸巧0.2 %，余 量为水，P册.8±0.2。
[0021] 所述摇瓶发酵的条件为:发酵溫度25-45 °C，发酵时间8-2地，pH值6.0-8.0，转速为 100-30化/m;优选为:发酵溫度为40°C、pH值6.8、揽拌转速20化/m，发酵时间1 Oh。
[0022] 5化种子罐罐培养基与摇瓶发酵培养基相同。5化发酵罐发酵条件为:装液量为20- 4化培养基，接种量为500-1000mL摇瓶种子液，发酵溫度为25-45°C，发酵时间5-20h，pH值 6.0- 8.0，揽拌转速100-30化/min。其中，优选为:装液量为3化培养基，接种量为600mL，发酵 溫度为40°C，发酵时间1 Oh，pH值6.8，揽拌转速15化/min。
[0023] 50化发酵罐中试培养基及发酵条件为：1-25 %教皮浸出液、1-5 %淀粉、1-5 %豆 巧、1-5 %玉米浆干粉、0.05-0.1 %憐酸氨二钟、0.05-0.5 %硫酸儀、0.1-2.0 %氯化钢、 0.01-0.05%硫酸儘、0.1-1.0%碳酸巧，余量为水，pH6.0-8.0,控制罐压0.02-0.05MpB，装 液量250-30化、接种量25-3化，发酵溫度为25-45°C，发酵时间5-20h，pH值6.0-8.0，揽拌转 速100-30化/min，其中，优选为:装液量为30化培养基，接种量为35mL，发酵溫度为40°C，发 酵时间15h，pH值6.8，揽拌转速150r/min。
[0024] 5T发酵罐培养基与50化发酵罐中试培养基相同，其发酵条件为：控制罐压0.02- 0.05MpB，装液量2.5T-3.5T、接种量250-350L，发酵溫度为25-45°C，发酵时间20-3化，抑值 6.0- 8.0，揽拌转速100-30化/min，其中，优选为:装液量为3T培养基，接种量为300mL，发酵 溫度为40°C，发酵时间30h，pH值6.8，揽拌转速15化/min。
[00巧]本发明凝结芽抱杆菌HEW-B379的益生性的检验方法如下：
[0026] 在无菌操作台上，将病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙口氏菌、 沙口氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌)浓度为109CFU/mL的菌悬 液lOmL与90血与冷却至50°C的营养琼脂(灭菌后)混匀，制备成厚度4mm左右的病原菌平板， 将灭菌的牛津杯（内径6mm、外径8mm、高10mm的圆形小管，管的两端要光滑)放置在培养基 上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别向各小管中滴加2(Κ)化的本发明 制备的发酵液，勿使其外溢，25 °C -45 °C培养20-3化，然后测量抑菌圈直径。每个实验Ξ个重 复，取平均值。
[0027] 其中，所述病原菌平板是将12rC高溫灭菌后的营养琼脂与病原菌菌悬液混匀后， 倒入灭菌后的平板，冷却后形成表面光滑的4mm厚的病原菌营养琼脂平板。
[00%]本发明凝结芽抱杆菌HEW-B379抗逆性的检验方法如下：
[0029] 1、高溫耐受试验:取lOmL本发明制备得到的发酵液注入到试管1中，采用十倍逐级 稀释，根据对发酵液活菌的估计，选择适当稀释倍数的稀释液进行涂布。再将装有lOmL本发 明制备得到的发酵液的试管2置于90°C水浴锅中加热15min，取加热后的凝结芽抱杆菌HEW- B379发酵液进行十倍逐级稀释，选择适当稀释倍数的稀释液进行涂布。最后将加热前和加 热后的平板均在4(TC条件下培养2地，计算凝结芽抱杆菌肥W-B379加热前后的数量。
[0030] 2、模拟胃液及肠液的耐受试验：取lOOg/L的盐酸16.4mL加蒸馈水稀释，使pH值分 别为1.5、2.5和3.5，取1 OOmL稀盐酸溶液，分别加入1 g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃 液，微孔滤膜除菌(0.22皿)备用。取憐酸二氨钟6.8g，加水500mL使溶解，用0.1 moL/L氨氧化 钢溶液调节pH值至6.8;另取膜蛋白酶lOg，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至 1000ml，得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μπι)备用。取ImL凝结芽抱杆菌肥W-B379发酵液加 入到9mL的模拟胃液中（即十倍逐级稀释），并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于40°C静置 培养2-地。分别在化、2h、化、地的时候取出培养液并立即检测残存活菌数，与原活菌数进行 比较。
[0031] 3、模拟胆盐的耐受试验:用膜液素制成Ig/L的溶液，并在溶液中加入0.3%的猪胆 盐，用10 %的化0H调整抑为8.0，然后用0.45μπι微滤膜过滤并除菌。将1血凝结芽抱杆菌肥W- Β379发酵液接种到9mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，检测残存凝结芽抱杆菌皿W- B379的活菌数，与原活菌数进行比较。
[0032] 模拟胃液及肠液和模拟胆盐耐受试验中的计数方法：
[0033] 样品用无菌生理盐水十倍梯度稀释，选择合适的稀释度用于计数。涂布时用移液 枪准确吸取0.1 mL稀释液于营养琼脂平板中间位置，用无菌涂布器涂布均匀。4(TC倒置培养 2地。
[0034] 本发明凝结芽抱杆菌HEW-B379预防和治疗腹泻的检验方法：
[0035] 选取普通昆明小白鼠90只，雌性，18-20g，常规饲养。随机分为Ξ组，每个处理饲喂 基础日粮，饲喂1周，使小鼠尽快适应。开始正式试验，对照组每日无菌生理盐水20化L，试验 I组灌胃凝结芽抱杆菌发酵液20化L，试验Π 组灌胃大肠杆菌发酵液20化L，每天早晨9:00灌 胃，连续两周，试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食和饮水。环境溫度控制在25 ±2°C，湿度60%，试验前后分别称重1次。试验期间观察小鼠生长、腹泻和排便情况;每5天 测各组小鼠粪便大肠杆菌数量，取小鼠粪便约Ig，于无菌操作台内加入玻璃珠，震荡混匀， 稀释并接种麦康凯琼脂培养基，计算每克湿便中的大肠杆菌数。
[0036] 本发明的有益效果体现在：
[0037] (1)本发明的凝结芽抱杆菌皿W-B379耐热性强（生长溫度:4°C-65°C，最适生长溫 度:20°C-45°C);耐酸碱范围宽泛（生长适宜pHl.5-10,最适pH值为6-8);发酵力强、生长旺 盛;经发酵培养基和工艺优化，发酵液活菌数可达到6.1 X lO^CFU/mL，更加适合饲料工业和 畜禽养殖业发展，在畜牧养殖可大大降低生产成本、提高经济效益，为W后发展奠定了坚实 的菌种基础。
[0038] (2)本发明的凝结芽抱杆菌皿W-B379具有显著的益生性，能显著抑制肠道致病大 肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙口氏菌、沙口氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、 铜绿假单胞菌等病原菌的生长繁殖，具有广谱抑菌性。
[0039] (3)本发明的凝结芽抱杆菌HEW-B379具有较强的抗逆性，能够耐受模拟胃酸、模拟 胆盐W及高溫环境，并且能保持较高的活菌存活率，其活菌存活率可达到99-100%，更加适 合饲料工业和畜牧养殖业的要求。
[0040] (4)本发明中凝结芽抱杆菌皿W-B379可有效维持动物肠道菌群平衡，改善肠道性 能，提高动物生产性能。经小鼠腹泻试验，肥W-B379试验组小鼠体重平均增长率显著高于对 照组和大肠杆菌组(P<〇.05)，且未出现腹泻情况;大肠杆菌组试验小鼠灌胃凝结芽抱杆菌 发酵液后，小鼠精神状态好转，且腹泻情况减少。表明饲喂HEW-B379可有效预防和治疗小鼠 腹泻，并能够促进小鼠生长。
[0041] (5)本发明的凝结芽抱杆菌HEW-B379不但可促进动物对饲料消化吸收，节约成本， 同时改善了动物体内环境的微生态平衡，从而促进动物生长，显著提高了动物的生产性能 等，降低了生产成本。具体表现在：107CFU/mL凝结芽抱杆菌可显著提高仔猪平均日增重 13.85% (P<0.05)，腹泻率和死亡率分别降低了53.23%、5.8%。凝结芽抱杆菌既有与普通 乳酸菌十分相似的特征，又因属于芽抱杆菌而可W体现芽抱杆菌抗逆性强、耐酸耐碱、耐高 溫和易于储藏等优良特性，可W抵抗胃酸和生物酶作用，顺利在肠道萌发并发挥其对肠道 的有利作用。
【附图说明】
[0042] 图1是凝结芽抱杆菌肥W-B379在营养琼脂培养基上的菌落形态。
[0043] 图2是凝结芽抱杆菌HEW-B379经革兰氏染色显微镜下的菌株形态。
【具体实施方式】
[0044] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神 和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0045] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0046] 实施例1凝结芽抱杆菌HEW-B379的分离和鉴定
[0047] 1、芽抱杆菌的分离纯化:在无菌条件下采集健康猪肠道内容物Ig，置于盛有4.5mL 灭菌生理盐水的离屯、管中，充分震荡混匀，于85°C水浴锅中水浴15min，然后吸取0.5血混合 液于盛有4.5血灭菌生理盐水的离屯、管中，此稀释度为ΙΟΛ重复W上过程做10倍梯度稀释， 至10-6稀释浓度，选择10-4~10-6Ξ个稀释度，吸取0.1 mL涂布于营养琼脂平板上，平板涂布 后4(TC倒置培养2地，用接种环挑取疑似芽抱杆菌的菌落在营养琼脂平板上进行划线分离 培养，经2地培养后，挑取分离效果较好的菌落，用接种环转接于营养琼脂斜面上作纯培养， 重复传代纯培养3次，而后置于4°C冰箱保存备用。
[0048] 2、菌落形态的观察将步骤1保存的斜面菌种，经2-3次活化，取干净的载玻片进行 革兰氏染色，镜检，观察菌株显微形态，选取革兰氏染色为阳性的产芽抱杆菌作为备用。
[0049] 3、抑菌性芽抱杆菌的筛选:取致病菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙口氏菌、肺炎 克雷伯氏菌、志贺氏菌属、韦荣氏球菌、绿脈杆菌、嗜水气单胞菌、多杀性己氏杆菌)浓度为 109CFU/mL的菌悬液O.lmL均匀涂布在营养琼脂平板上，制备成致病菌平板若干个，在超净 工作台上每个病原菌营养琼脂平板用无菌綴子夹取2个灭菌牛津杯对称放在平皿上，使其 与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别吸取2(Κ)化疑似芽抱杆菌菌株发酵液于牛津杯中， 另一个牛津杯中加入等量的YPD培养基作为对照，于4(TC下恒溫培养4她。每个菌株至少做3 个重复，观察并测量抑菌圈大小，选择抑菌圈大的菌株8株，并分别标号为皿W-B10-1、皿W- B10-2、肥 W-B10-3、皿 W-B10-4、肥 W-B10-5、肥 W-B10-6、皿 W-B10-7、皿 W-B10-8。用接种环转 接于MRS斜面上作纯培养，重复传代纯培养3次，而后置于4Γ冰箱保存备用，进行下一步的 研究。
[0050] 4、产细菌素芽抱杆菌的筛选
[0051] 1)目标菌株的确定：
[0052] 将步骤3中筛选获得的8个芽抱杆菌于YTO斜面培养基上进行菌种活化3-4次，取1- 2环转接于装有300mL YPD液体培养基的摇瓶中40°C培养1她，转速为18化/m，调节pH值至 7.0，然后分别吸取200化芽抱杆菌发酵液，进行抑菌试验，选择抑菌性能最好的芽抱杆菌 HEW-B10-2为本发明筛选的目标芽抱杆菌，其在营养琼脂培养基上的菌落形态见图1，其经 革兰氏染色显微镜下的菌株形态见图2,将该菌暂时命名为芽抱杆菌HEW-B379。
[0053] 2)抑菌蛋白的确认：
[0054] 将步骤1)皿W-B10-2培养液中加入硫酸锭至到培养液中不再有沉淀析出，收集沉 淀和上清液，将沉淀透析、去盐后溶于与上清液等体积的超纯水，均匀混合，得溶解液，取适 量溶解液加入0.1 mg/mL的蛋白酶37 °C酶解化。取培养液、上清液、溶解液、酶解液做抑菌试 验。最终确定芽抱杆菌HEW-B379发酵产生的抑菌物质为抑菌蛋白。
[0055] 5、菌株属的鉴定对肥W-B379菌株进行生理生化鉴定，氧化酶、接触酶、明胶液化试 验、吗I噪试验和淀粉水解均为阳性，表明皿W-B379菌株为芽抱杆菌属。通过厌氧生长试验、 65°C生长试验及糖醇发酵试验，结果与《常见细菌系统鉴定手册》对照。鉴定结果显示皿W- B379菌株为凝结芽抱杆菌。
[0化6] 表1凝结芽抱杆菌HEW-B379部分生理生化特性
[0化7]
[0化引
[0059] 注：V'表示反应阳性；表示反应阴性。
[0060] 6、16S rDNA测序测定采用细菌DNA提取的试剂盒提取肥W-B379菌株基因组DNA。通 过引物F和R对HEW-B379菌株的16S rDNA基因片段进行测序，将所测得的序列与GenBank中 的16S rDNA序列进行化AST分析比对，可W看出菌株皿W-B379与凝结芽抱杆菌的同源性达 到99.98 %。通过菌株皿W-B379的形态特征、生理生化特征、16SrDNA特征，确定菌株皿W- B379为凝结芽抱杆菌(Bacillus coagulans)。
[0061 ] 7 .菌株保藏上述经分离、纯化、筛选得到的凝结芽抱杆菌(Bacillus coagulans) 肥W-B379已于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简 称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码： 100101)，保藏编号为CGMCC NO. 12553,分类命名为凝结芽抱杆菌(Bacillus coagulans)。
[0062] 实施例2凝结芽抱杆菌HEW-B379发酵液的制备
[0063] 取凝结芽抱杆菌皿W-B379(保藏编号为CGMCCNo.l2553)种子液（活菌浓度为 10化即/mL)3mL，接种于300mL培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵溫度为40°C、pH6.8、200r/ min,发酵时间1 Oh。
[0064] 其中，摇瓶发酵培养基由下述组分组成:可溶性淀粉1.2%，薦糖1.8%，酵母浸粉 1.0%，蛋白腺1.5%，憐酸氨二钟0.08%，硫酸儀0.2%，氯化钢0.5%，碳酸巧0.2%，余量为 水，P册.8 ± 0.2。
[0065] 摇瓶发酵结束后进行发酵罐一级种子培养，取0.化摇瓶发酵种子液接种到50L发 酵罐中装液量为3化培养基，接种量为600mL，发酵溫度为40°C，发酵时间1 Oh，pH值6.8，揽拌 转速15化/min。5化发酵罐培养基组成同摇瓶发酵。
[0066] 将50L发酵的一级种子液3化接种于50化二级种子罐中，500L发酵罐的培养基成分 及发酵条件为：1-25 %教皮浸出液、1-5 %淀粉、1-5 %豆巧、1-5 %玉米浆干粉、0.05-0.1 % 憐酸氨二钟，0.05-0.5 %硫酸儀，0.1-2.0 %氯化钢，0.01-0.05 %硫酸儘0.1-1.0 %碳酸巧， 余量为水，pH6.0-8.0，装液量为30化培养基，接种量为35mL，发酵溫度为40°C，发酵时间 1化，pH值6.8，揽拌转速150r/min。
[0067] 5T发酵罐培养基与500L发酵罐二级种子培养基相同，其发酵条件为：控制罐压 0.02-0.05MpB，装液量为3T培养基，接种量为300mL，发酵溫度为40°C，发酵时间30h，pH值 6.8，揽拌转速15化/111111。
[0068] 发酵结束后，检测发酵液活菌数为6.1 X l〇WCFU/mL，发酵液于4°C保存在冰箱内备 用。
[0069] 实施例3凝结芽抱杆菌HEW-B379益生性验证
[0070] 在无菌操作台上，将病原菌(肠道致病大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙口氏菌、 沙口氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞菌)浓度为109CFU/mL的实施 例2制得的凝结芽抱杆菌HEW-B379菌悬液0.1 mL均匀涂布在营养琼脂平板上，制备成致病菌 平板若干个，在超净工作台上每个病原菌营养琼脂平板用无菌綴子夹取2个灭菌牛津杯对 称放在平皿上，使其与培养基接触无空隙，待数分钟后，分别向各小管中滴加2(Κ)化的本发 明制备的发酵液，勿使其外溢，25°C-45°C培养20-3化，然后测量抑菌圈直径。每个实验立个 重复，取平均值。结果如表2。
[0071 ] 表2凝结芽抱杆菌HEW-B379对病原菌的抑菌效果
[0072]
[0073] 实施例4凝结芽抱杆菌HEW-B379抗逆性验证
[0074] 1、耐高溫试验:取本发明实施例2制备得到的凝结芽抱杆菌皿W-B379发酵液lOmL 于试管1中，置于90°C水浴锅中处理15min，计算凝结芽抱杆菌肥W-B379发酵液加热前后的 数量。
[0075] 结果表明，活菌存活率达到了 100%。
[0076] 2、模拟胃液及肠液的耐受试验：取lOOg/L的盐酸16.4mL加蒸馈水稀释，使pH值分 别为1.5、2.5和3.5，取1 OOmL稀盐酸溶液，分别加入1 g胃蛋白酶，使其充分溶解，得模拟胃 液，微孔滤膜除菌(0.22皿)备用。取憐酸二氨钟6.8g，加水500mL使溶解，用0.1 moL/L氨氧化 钢溶液调节pH值至6.8;另取膜蛋白酶lOg，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至 1000ml，得模拟肠液，微孔滤膜除菌(0.22μπι)备用。取ImL凝结芽抱杆菌肥W-B379发酵液加 入到9mL的模拟胃液中（即十倍逐级稀释），并迅速在振荡器上充分混匀，然后置于40°C静置 培养2-地。分别在化、2h、化、地的时候取出培养液并立即计数残存活菌数，与原活菌数进行 比较，结果表明活菌存活率为99%。
[0077] 3、模拟胆盐的耐受试验:用膜液素制成Ig/L的溶液，并在溶液中加入0.3%的猪胆 盐，用10 %的化0H调整抑为8.0，然后用0.45μπι微滤膜过滤并除菌。将1血凝结芽抱杆菌肥W- Β379发酵液接种到9mL模拟胆盐中，培养24h后得到培养液，计算残存凝结芽抱杆菌皿W- B379的活菌数，与原活菌数进行比较。结果表明活菌存活率为99%。
[0078] 模拟胃液及肠液和模拟胆盐耐受试验中的计数方法：
[0079] 样品用无菌生理盐水十倍梯度稀释，选择合适的稀释度用于计数。涂布时用移液 枪准确吸取0.1 mL稀释液于营养琼脂平板中间位置，用无菌涂布器涂布均匀。4(TC倒置培养 2地。
[0080] 实施例5凝结芽抱杆菌CGMCC NO. 12553急性毒性试验
[0081] 凝结芽抱杆菌的安全性评价采用急性毒性试验，参照国标GB15193.3-2003最大耐 受剂量法进行。取普通昆明小白鼠60只，雌雄各半，18-20g，常规饲养1周后，一日分Ξ次对 小白鼠进行灌胃，〇.25g/mL凝结芽抱杆菌皿W-B379菌液(相当于15000mg/kg体重），连续灌 月良2周，观察小鼠是否有中毒或死亡的现象。
[0082] 试验期间，小鼠均无中毒和死亡现象，因此本发明菌株的急性毒性试验最大耐受 剂量MTD> 15000mg/kg，根据分级标准，可确定该菌种为无毒级，具有较高的安全性。
[0083] 实施例6小鼠腹泻试验
[0084] 选取普通昆明小白鼠90只，雌性，18-20g，常规饲养。随机分为Ξ组，每个处理饲喂 基础日粮，饲喂1周，使小鼠尽快适应。开始正式试验，对照组每日无菌生理盐水20化L，试验 I组灌胃实施例2制得的凝结芽抱杆菌发酵液2(K)yL，试验Π 组灌胃大肠杆菌发酵液2(K)yL， 每天早晨9:00灌胃，连续两周，试验期间小鼠同室分笼饲养，自然光照，自由采食和饮水。环 境溫度控制在25±2°C，湿度60%，试验前后分别称重1次。试验期间观察小鼠生长、腹泻和 排便情况，计算各组体重平均增长率，结果如表3;每5天测各组小鼠粪便大肠杆菌数量，取 小鼠粪便约Ig，于无菌操作台内加入玻璃珠，震荡混匀，稀释并接种麦康凯琼脂培养基，计 算每克湿便中的大肠杆菌数，结果如表4。
[0085] 表3小鼠增重情况
[0086]
[0087]表4小鼠粪便中大肠杆菌数的情况 [008引
[0089] 试验期间，试验I组小鼠精神较好，表现活跃，皮毛鲜亮，且平均增重显著高于对照 组，粪便中大肠杆菌数显著降低，基本没有腹泻情况;试验Π 组小鼠精神萎靡，不活跃，皮毛 颜色发暗，粪便较湿，且粪便中大肠杆菌数显著增多，出现严重腹泻情况。将试验Π 组小鼠 随机分为两组，一组进行灌胃凝结芽抱杆菌发酵液20化L。另一组进行灌胃无菌生理盐水 200化作为对照组，灌胃1周，观察小鼠生长和粪便状况。发现灌胃凝结芽抱杆菌发酵液组的 小鼠精神状态转好，且小鼠开始活跃，皮毛色泽转好，而对照组小鼠状态仍萎靡不振，食欲 不振，减少腹泻情况。结果说明，本发明的凝结芽抱杆菌发酵液能够抑制小时腹泻，并促进 小鼠生长。
[0090] 实施例7哺乳仔猪试验
[0091] 选24头分娩母猪，随机分为四组，并W分娩母猪所产仔猪为试验对象。分为1个对 照组和Ξ个试验组(试验组1总活菌数为107c化疑结芽抱杆菌HEW-B379、试验组2总活菌 数为108c化/mL凝结芽抱杆菌皿W-B379、试验组3总活菌数为109c化/mL凝结芽抱杆菌皿W- B379)。试验组凝结芽抱杆菌制剂溶解于无菌水中，用于试验。试验组仔猪在吃初乳前分别 灌服2mL凝结芽抱杆菌水溶液，对照组仔猪则灌服2mL生理盐水。W后在7d和14加寸再次W同 样剂量灌服。仔猪出生时称初重，28d断奶时再次称重，记录数据进行分析，期间观察仔猪腹 泻及死亡情况。
[0092] 表5凝结芽抱杆菌制剂对哺乳仔猪体重的影响
[0093]
[0094] 注：同列数字肩标小写字母相同表示差异不显著(P〉0.05)，小写字母不同的表示 差异显著(P<〇.05)，大写字母不同的表示差异极显著(P<0.01)。
[00M]由表5可见，试验组1~3平均增重均高于对照组，分别比对照组提高了 13.85 %、 20.77%、20.45%。。试验组1~3的增重分别与对照组相比差异极显著(P<0.01)，试验组1~ 3之间增重差异不显著(P〉0.05)。试验数据显示，凝结芽抱杆菌可有效提高哺乳期仔猪的体 重。
[0096]表6凝结芽抱杆菌制剂对哺乳仔猪腹泻及死亡率的影响
[0097]
[0099] 由表6可见，哺乳期仔猪腹泻主要出现在一周左右。试验组1~3的腹泻率分别比对 照组降低了53.23 %、54.79 %和55.04%。复合益生菌对于仔猪死亡率的影响，试验组1和试 验组3分别死亡1头，试验组2未出现死亡的情况，对照组死亡4头。实验组1~3死亡率分别比 对照组降低5.8%、7.55%和5.83%。实验结果显示，凝结芽抱杆菌可有效降低哺乳期仔猪 的腹泻率和死亡率。
[0100] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一株凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans)HEW-B379,其保藏编号为CGMCC No.12553。2. 含有权利要求1所述凝结芽孢杆菌HEW-B379的菌剂。3. 含有权利要求1所述凝结芽孢杆菌HEW-B379的饲料添加剂。4. 如权利要求3所述的饲料添加剂，其特征在于，饲料添加剂中凝结芽孢杆菌HEW-B379 的活菌数为1.0 X 1〇6~1.0 X l〇1()CFU/g。5. 含有权利要求1所述凝结芽孢杆菌HEW-B379的药物，所述药物为预防或治疗动物腹 泻的药物。6. 权利要求1所述的凝结芽孢杆菌HEW-B379或权利要求2所述的菌剂在提高饲料转化 率，提高动物生产性能中的应用。7. 权利要求1所述的凝结芽孢杆菌HEW-B379或权利要求2所述的菌剂在制备微生态益 生制剂中的应用。8. 权利要求1所述的凝结芽孢杆菌HEW-B379或权利要求2所述的菌剂在制备广谱抗菌 剂中的应用。9. 如权利要求8所述的应用，所述广谱抗菌剂的抗菌谱包括抗以下菌:大肠杆菌、金黄 色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、变形杆菌、腐败希瓦氏菌、铜绿假单胞 菌。10. 权利要求1所述的凝结芽孢杆菌HEW-B379或权利要求2所述的菌剂在食品制造中的 应用。
【文档编号】A61P1/12GK106011036SQ201610633178
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月4日
【发明人】李雪平
【申请人】北京好实沃生物技术有限公司