一种巨大芽孢杆菌t317及其菌剂和菌剂制备方法
【专利摘要】本发明涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌T317及其菌剂和菌剂制备方法，所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015753。所述菌剂制备方法包括以下步骤：（1）分离、筛选；（2）纯化、保存；（3）固体发酵培养时；（4）菌剂制备，即得到巨大芽孢杆菌T317菌剂。本发明以巨大芽孢杆菌T317为出发菌株，对其固氮酶活性以及分泌生长素能力进行测定，发现菌株T317具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力。巨大芽孢杆菌T317的固氮酶活性为800?900nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300?400mg/L。CCTCCM 201575320151215
【专利说明】
-种巨大芽抱杆菌T317及其菌剂和菌剂制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及微生物菌剂技术领域，具体设及一种巨大芽抱杆菌T317及其菌剂和菌 剂制备方法。
【背景技术】
[0002] 农业生产长期过分依赖化学肥料和农药，已经造成了农田±质和肥力下降，农作 物品质降低，食品和地下水等环境污染也日趋严重。随着生态农业和绿色食品生产的兴起 和发展，加之我国大多数±壤中速效憐、钟及其他一些养分的缺乏，微生物肥料作为生物技 术发展和农业生产的一类重要肥源逐渐引起了人们的关注。
[0003] 巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)是一种好氧产抱革兰氏阳性细菌，至今已 有一百多年的研究历史。近年来，随着微生物肥料的研究，巨大芽抱杆菌作为解憐菌被广泛 应用于解憐细菌肥料生产。目前，国内对巨大芽抱杆菌在微生物肥料上的研究主要集中在 菌株选育、解憐效果、发酵条件优化及与解钟菌相互作用等方面，而对巨大芽抱杆菌的固氮 作用却不多见。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽抱杆菌T317,其具 有固氮酶活性和分泌生长素吗I噪乙酸的功能。
[0005] 本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽抱杆菌T317菌 剂，该具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，农业应用范围广，经济效益高。
[0006] 本发明的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽抱杆菌T317菌 剂制备方法，工艺简单成熟，可规模化生产。
[0007] 本发明的目的通过W下技术方案实现。
[000引一种巨大芽抱杆菌T317,所述巨大芽抱杆菌T317保藏于中国典型培养物保藏中屯、 (化ina Center for Type Collection),地址为中国武汉大学，分类命名为巨大芽抱杆菌 T317 Bacillus megaterium T317,保藏号为CCTCCM 2015753,保藏日期：2015年 12月15日。
[0009] 所述巨大芽抱杆菌T317具有序列表NO. 1的DNA序列。
[0010] 所述巨大芽抱杆菌T317的固氮酶活性为800-900nmol/(mL . h)，其在生长代谢过 程中可W产生吗I噪乙酸，吗I噪乙酸的分泌量为300-400mg/L。
[0011] 固氮酶活性测定
[0012] 1、试验方法
[0013] 采用乙烘还原法对各菌株的固氮酶活性进行测定。将保存的各菌株用VM-Ethanol 固体培养基活化，用接种环挑取1环菌体于1.5mL的无菌离屯、管中，用无菌水稀释，按相同接 种量接入装有5mL半固体培养基的lOmL试管中，用反口橡胶塞密封。37°C培养24h后，注入1/ 10体积的10%乙烘气体，继续培养2地，从试管中抽取0.5mL气体注入气相色谱仪(北京天普 分析仪器厂SP-2100)中，测定乙烘、乙締的含量。按下列公式计算固氮酶活性大小(北京农 业大学微生物专业编，1986):
[0014] C=(hxXcXV)/(24.9XhsXt) (2.1)
[001引其中，hx为样品峰面积值;hs为标准C2H4峰面积值;C为标准C2H4浓度(nmol/mU ;
[0016] V为培养容器体积(mL); t为样品培养时间化）；C为产生的C2出浓度[nmo 1 /(mL · h)]。
[0017] 2、试验结果
[0018] 结合公式(2.1)和固氮酶活性测定图4得知，固氮酶活性为800-900nmol/(血· h)。 由此可W说明，巨大芽抱杆菌T317在代谢过程中可W产生特定的固氮酶，可W自生固定大 气中的氮气。
[0019] 生长素定性含量测定
[0020] (1)挑取菌株分别接种(〇〇6日日=1.0，0.5mL菌悬液)到盛有50血King液体培养基的 250mLS角瓶中，每组3个重复。
[00別](2)接种完毕后，将立角瓶置于摇床上，28°C，125巧m，培养3d，待测。
[0022] (3)将上述在King液体培养基上生长3d的菌悬液SOiiL置于透明离屯、管中，同时加 50yL比色液。
[0023] (4)设阳性对照和阴性对照，阳性对照中加入50化浓度为lOmg/L的植物生长激素 (IAA)，同时加 SOiiL比色液。阴性对照中加50yLKing液体培养基，同时加 SOiiL比色液。
[0024] (5)将阳性对照液、阴形对照液和测定液置于白陶瓷板并置于室溫下15min，观察 其颜色变化，颜色变红者为阳性，表示能够分泌IAA，且颜色越深表示分泌IAA的能力越强； 若不变色则为阴性，表示该菌株不能分泌IAA，由此作为判断依据进行判断分析。
[0025] 培养基为King培养基（1L);试剂配方为：蛋白腺20g，K2HP〇4 1.725g，MgS〇4 · 7此0 1.5g，丙Ξ醇15mL，色氨酸0.1 g，蒸馈水lOOOmL。
[002引生长素定量测定
[0027] 参照Riberio等的方法略加改动。菌株T317接种到含有Ig/L色氨酸的LB液体培养 基中，30°C，180r/min，振荡培养4她。将培养液lOOOOr/min离屯、5min，取100血上清液加到96 孔板中，与lOOmL Sa化owski's试剂（ImL 0.5mol/L FeCb和49mL 35%高氯酸）混匀，室溫 静置30min，在波长530nm下用酶标仪测定吸光度。用不同浓度的IAA标准品制作标准曲线， 测定结果见表1。
[0028] 表1菌株T317 IAA测定结果
[0029]
[0030] 从表1和图5可W看出，巨大芽抱杆菌T317的生长素浓度(分泌量)为312.48mg/L， 因此，可W判断巨大芽抱杆菌T317在生长代谢过程中可W产生IAA，具有促进作物生长的功 能。
[0031] -种巨大芽抱杆菌T317的菌剂制备方法，包括W下步骤：
[0032] (1)分离、筛选
[0033] 选取含有巨大芽抱杆菌T317的固氮菌菌落的±样，经分离筛选培养基培养得到固 氮菌菌落；
[0034] (2)纯化、保存
[0035] 在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得 到巨大芽抱杆菌T317单菌落，保存该单菌落备用；巨大芽抱杆菌T317单菌落如图1所示。
[0036] 具体地，在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，3(TC恒溫培 养36-48小时分离得到巨大芽抱杆菌T317单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30 °。直溫培养36-48小时，置于4°C冰箱中保存。
[0037] (3)固体发酵培养
[0038] 选取上述巨大芽抱杆菌T317,用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1-7.4,接 种量0.5-1.0%，培养溫度为30-37°C，培养时间为48-60小时。
[0039] (4)菌剂制备
[0040] 将发酵后产物于5(TC烘干后用小型粉碎机打碎，设定最终产品活菌数为5亿/g，进 行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-10亿/g，产品活菌数完全符合国家标准《微 生物菌剂》GB20287-2006要求2亿/gW上，即得到巨大芽抱杆菌T317菌剂。
[0041 ]固体发酵培养中固体培养基的配方优化实验
[0042] (3.1)菌种由实验室自行分离，经鉴定为芽抱杆菌属中的Bacillus megaterium， 编号为T317。
[0043] (3.2)固体培养基为
[0044] 培养基一:LB培养基化ysogeny化oth，即溶菌肉汤培养基，是培养细菌最基础最 常见的培养基）；
[0045] 培养基二:种子培养基配方(g/L):淀粉16,酵母抽提粉4瓜册〇4 0.5，MgS〇4 0.5， 培养基二的抑为7.0;
[0046] 培养基发酵培养基配方（g/L):淀粉15,豆巧25，KH2P04 2，Na油P〇4 0.5， CaC〇3〇.5，MgS〇4 0.5，MnS〇4 0.5,培养基Ξ的抑为7.0。
[0047] 上述发酵培养基配方一和Ξ的缺陷是发酵成本高，不适宜生产。培养基二的种子 培养基配方发酵用量少，发酵效果好。
[0048] (3.3)固体发酵产抱条件的单因素试验
[0049] ①淀粉原料对产抱量的影响：选用小麦粉、面粉和教皮为淀粉原料，按照豆巧：淀 粉原料=4: 的比例，在料水比为1.0:0.3(m:m)，接种量为1.0% (V:m)，37°C条件下发 酵4她，测定产抱量如表2所示。
[0050] 表2淀粉原料对产抱量的影响
[0化1 ]
[0052] ~②发酵溫度对产抱量的影响：将豆巧和小麦粉W4:l(m:m)的比例混合，按照料水' 比1.0:0.3(m:m)制作固体培养基，种子液添加量为1.0% (V:m)，在不同的发酵溫度下（30、 35、37、40、45 °C)发酵4她，测定产抱量如表3所示。
[0053] 表3发酵溫度对产抱量的影响
[0化4]
[0化5]③发酵时间对产抱量的影响：将豆巧和教皮W4:l(m:m)的比例混合，按照料水比 1.0:0.3(m:m)制作固体培养基，种子液添加量为1.0 % (V:m)，在37°C下发酵不同时间（24、 48、72、9化），测定产抱量如表4所示。
[0056]表4发酵时间对产抱量的影响 「0化71
[0058] ④接种量对产抱量影响:将豆巧和教皮W4:1 (m:m)的比例混合，W料水比1.0:0.3 (m:m)制作固体培养基，分别添加 W0.5% ,1.0% ,2.0% ,3.0% ,5.0% (V/m)的比例往培养 基中添加种子液，37 °C条件下发酵4她，测定产抱量如表5所示。
[0059] 表5接种量对产抱量影响
[0060]
[0061 ]⑤料水比对产抱量影响：将豆巧和教皮W4:1 (m:m)的比例混合，按照不同的料水 tt (1.0:0.1,1.0:0.2,1.0:0.3,1.0:0.4,1.0:0.5，m:m)制作发酵培养基，固定种子液接种 量为1.0%(V:m)，在37°C下发酵4她，测定产抱量如表6所示。
[0062] 表6料水比对产抱量影响
[0063]
[0064] (3.4)利用响应面法分析确定最佳配方及发酵环境参数
[0065] (3.5)培养基优化结果验证试验用优化后的培养基组分配制发酵培养基，W5%接 种量接入装液量为20血的SOOmLS角瓶中，于30°C、18化/min条件下培养30h。发酵结束后测 定发酵液中的芽抱量。
[0066] 所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由W下重量份的原料组成:教皮65-75%，豆 巧20-28%，NaCl 4-5%，CaC〇3 1-2%，MnS〇4·出0 0.01-0.05%，MgS〇4*7H2〇 0.03- 0.08%，培养基的抑为7.1-7.4。该培养基的优势是可显著地增加产抱量，减少生产成本。
[0067] 发酵培养基配方及环境参数
[0068] 结合单因素试验，响应面法分析和培养基优化结果验证得出巨大芽抱杆菌最佳发 酵培养基配方及环境参数：
[0069] ①培养基
[0070] 优选为，教皮70%，豆巧24%，NaCl 4.3%，CaC〇3 1.6%，MnS〇4 ·出0 0.04%， 1邑5〇4*7出00.06%。
[0071] ②发酵环境参数抑7.1-7.4,接种量0.5-1.0%，培养溫度30-37°C，培养时间48-60 小时。
[0072] 所述步骤（1)分离、筛选的具体方法为:选取±样，加入含吐溫80的无菌水，震荡， 静置，取上清液离屯、，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的无菌水，悬浮，离屯、，去沉淀， 将上清液离屯、，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用憐酸缓冲液悬浮，得到样品液;在上述样 品液中加入憐酸缓冲液，悬浮混合，得到稀释菌悬液;将稀释菌悬液水浴加热，自然冷却后 吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。
[0073] 更具体地，分离、筛选的方法为：
[0074] 从广东省东竞市常平镇黄泥塘农场采取500肖±样，加入化含0.01 %吐溫80的无菌 水，震荡lOmin，静置半个小时，取上清液于20°C下4820rpm离屯、20min。弃上清液，保留沉淀 物，加入30-50血含0.01 %吐溫80的无菌水悬浮，液体于20 °C下5000rpm离屯、5秒钟，去沉淀， 将上清液倒入一个干无菌离屯、管中于20°C下4820rpm离屯、lOmin，弃上清液，保留沉淀物，将 沉淀物用lOmL的pH7.0憐酸缓冲液悬浮，得到样品液;取ImL上述样品液与9mL憐酸缓冲液悬 浮混合，即为10倍稀释菌悬液。将稀释菌悬液置于75°C水浴加热15min，自然冷却后吸取100 yL涂布于无氮培养基，30°C培养36-48小时获得含巨大芽抱杆菌T317的固氮菌菌落。
[0075] 所述步骤（1)中，分离筛选培养基由W下质量的原料制成：CaC〇3 1.0-1.4g， MgS〇4*7H2〇 0.6-1.2g，K2HP〇4 1.0-2. Og，化 Cl 0.1-0.4g，FeS〇4*7H2〇 0.001-0.005g， ΝειΜ〇4 · 2此0 0.05-0.1旨，薦糖5-10旨，琼脂18-20旨，蒸馈水10001111，分离筛选培养基的口出％ 7.1-7.4。本发明的分离筛选培养基属于改良无氮培养基。
[0076] 所述纯化保存的具体方法为:在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行 划线纯化，3(TC恒溫培养36-48小时分离得到枯草芽抱杆菌Τ317单菌落。将平板上出现的单 菌落保存在试管中，30°C恒溫培养36-48小时，置于4°C冰箱中保存。巨大芽抱杆菌T317保藏 于中国典型培养物保藏中屯、（畑ina Center for Type Col lection),保藏号码为： CCTCCM2015753。
[0077] (2)纯化保存培养基的配方为：牛肉膏3 . Og，蛋白腺10 . Og，氯化钢5 . Og，琼脂 18. Og，蒸馈水1000ml，纯化保存培养基的抑为7.0-7.4。
[007引所述步骤（3)培养基培养中，培养基由W下质量的原料制成：Ca(X)3 1.0-1.4g， MgS04*7H20 0.6-1.2g，K2HP04 1.0-2. Og，化 Cl 0.1-0.4g，FeS04*7H20 0.001-0.005g， NaM04 · 2出0 0.05-0.1 g，薦糖5-lOg，琼脂 18-20g，蒸馈水 1000ml，培养基的pH为7.1-7.4。
[0079] 所述步骤(2)和步骤(3)之间还包括有W下步骤：
[0080] (S1)革兰氏染色:将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；
[0081] (S2)芽抱染色:将阳性菌进行芽抱染色，筛选得到含有芽抱的革兰氏阳性菌单菌 落。
[0082] 芽抱染色及其革兰氏染色
[0083] 革兰氏染色和芽抱染色是两种细菌鉴定的常规方法，染色可W缩小鉴定范围。未 经染色的细菌与周围环境折光率差别甚小，在显微镜下极难观察。革兰氏染色后细菌与环 境形成鲜明对比，可W清楚地观察到细菌的形态、排列及某些菌种属于革兰氏阳性(G+)或 者革兰氏阴性菌(G1，用W分类鉴定。革兰氏阴性菌普遍存在安全隐患，在农业微生物应用 过程中直接高溫灭菌后舍弃结构特征。芽抱染色将菌体内的芽抱进行染色，可W直观观察 芽抱的大小、位置、形状等特点，进一步缩小其鉴定范围。芽抱杆菌具有保质期长，易于存放 的特点，在农业微生物产品具有广泛的应用基础。
[0084] 1、革兰氏染色
[0085] (1)涂片：在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂 质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将 样品载玻片在火灯上方来回过3次，W固定细胞。
[0086] (2)初染:滴加2-5滴草酸锭结晶紫染液，染Imin，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
[0087] (3)媒染:先用新配的舰液(舰l.Og、舰化钟2.Og、蒸馈水300.OmU冲去残水，再用 舰液覆盖涂面Imin，后水洗。
[0088] (4)脱色:除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15-20秒后，立即用流水冲洗。
[0089] (5)复染:滴加1滴番红染色液，染3-5min，水洗后用吸水纸吸干。
[0090] (6)镜检:将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。
[0091] 2、芽抱染色
[0092] 在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻 片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在 火灯上方来回过3次，W固定细胞。在涂布菌体的区域滴加1~2滴石碳酸碱性复红染液，染 色3min。用蒸馈水冲洗掉染液，风干后，将载玻片置于光学显微镜下观察。
[0093] 如图2和图3所示，通过革兰氏染色和芽抱染色结果可W看出，巨大芽抱杆菌T317 为革兰氏阳性菌，杆状，含有芽抱。
[0094] 一种巨大芽抱杆菌T317的菌剂，由所述的一种巨大芽抱杆菌T317的菌剂制备方法 制备而成。
[0095] 本发明的有益效果：
[0096] (1)本发明W巨大芽抱杆菌T317为出发菌株，对其固氮酶活性W及分泌生长素能 力进行测定，发现菌株T317具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力。巨大芽抱杆菌T317的固 氮酶活性为800-90化mol/(血· h)，其在生长代谢过程中吗I噪乙酸的分泌量为300-400mg/ L。
[0097] (2)通过单因素和正交试验进行固体发酵的培养基和培养条件的优化，W提高巨 大芽抱杆菌T317产抱量。优化后的固体配料，能直接应用于巨大抱杆菌T317发酵，大大提高 生产的优质化。作为一种新的微生物菌剂，巨大芽抱杆菌T317在未来的农业生产中，将有良 好的应用前景。
[0098] (3)本发明针对巨大芽抱杆菌T317的发酵配方进行优化从而制备巨大芽抱杆菌 T317菌剂，大大提高了产抱量，增强了巨大芽抱杆菌T317的应用效果，且能够有效地降低生 产成本。
【附图说明】
[0099] 利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制， 对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据W下附图获得其 它的附图。
[0100] 图1为分离得到的巨大芽抱杆菌T317单菌落在显微镜下放大10X100倍的菌落图。 [0101 ]图2为巨大芽抱杆菌T317革兰氏染色结果图。
[0102] 图3为巨大芽抱杆菌T317芽抱染色结果图。
[0103] 图4为巨大芽抱杆菌T317固氮酶活性测定结果图。
[0104] 图5为巨大芽抱杆菌T317IAA比色效果图。
【具体实施方式】
[0105] 结合W下实施例对本发明作进一步描述。
[0106] 实施例1
[0107] 本实施例的一种巨大芽抱杆菌T317,所述巨大芽抱杆菌T317保藏于中国典型培养 物保藏中屯、，保藏号为CCTCCM 2015753。所述巨大芽抱杆菌T317具有序列表N0.1的DNA序 列。
[0108] 所述巨大芽抱杆菌T317的固氮酶活性为800nmol/(mL . h)，其在生长代谢过程中 吗I噪乙酸的分泌量为312.48mg/L。
[0109] -种巨大芽抱杆菌T317的菌剂制备方法，包括W下步骤：
[0110] (1)分离、筛选
[0111] 选取含有巨大芽抱杆菌T317的固氮菌菌落的±样，经分离筛选培养基培养得到固 氮菌菌落；
[0112] (2)纯化、保存
[0113] 在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到巨 大芽抱杆菌T317单菌落，保存该单菌落备用；
[0114] (3)固体发酵培养
[0115] 选取上述巨大芽抱杆菌T317,用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1，接种量 0.5%，培养溫度为30°C，培养时间为60小时；
[0116] (4)菌剂制备
[0117] 将发酵后产物烘干后打碎，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4亿/ g，即得到巨大芽抱杆菌T317菌剂。
[0118] 所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由W下重量份的原料组成:教皮70%，豆巧 24%，化(：14.3%，〔曰(：03 1.6%，]\111504*此0 0.04%，]\%504.7此0 0.06%，培养基的抑为 7.1。
[0119] 所述步骤（1)分离、筛选的具体方法为:选取±样，加入含吐溫80的无菌水，震荡， 静置，取上清液离屯、，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的无菌水，悬浮，离屯、，去沉淀， 将上清液离屯、，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用憐酸缓冲液悬浮，得到样品液;在上述样 品液中加入憐酸缓冲液，悬浮混合，得到稀释菌悬液;将稀释菌悬液水浴加热，自然冷却后 吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。
[0120] 所述步骤（1)中，分离筛选培养基由W下质量的原料制成：Ca(X)3 1.0g，MgS化· 7此0 0.6g，K2HP04l.0g，NaC10.1g，FeS04·7此0 0.001g，NaM04·2出0 0.05g，薦糖5g，琼 脂18g，蒸馈水1000ml，分离筛选培养基的抑为7.1。
[0121] 实施例2
[0122] 本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例的所述步骤(2)和步骤(3)之间还 包括有W下步骤：
[0123] (S1)革兰氏染色:将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌；
[0124] (S2)芽抱染色:将阳性菌进行芽抱染色，筛选得到含有芽抱的革兰氏阳性菌单菌 落。
[0125] 具体地，革兰氏染色方法为：
[0126] (1)涂片：在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂 质。在载玻片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落于水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将 样品载玻片在火灯上方来回过3次，W固定细胞。
[0127] (2)初染:滴加2-5滴草酸锭结晶紫染液，染Imin，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
[01%] (3)媒染:先用新配的舰液(舰l.Og、舰化钟2.Og、蒸馈水300.OmL)冲去残水，再用 舰液覆盖涂面Imin，后水洗。
[0129] (4)脱色:除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15-20秒后，立即用流水冲洗。
[0130] (5)复染:滴加1滴番红染色液，染3-5min，水洗后用吸水纸吸干。
[0131] (6)镜检:将载玻片置于光学显微镜下观察染色结果。
[0132] 具体地，芽抱染色方法为：
[0133] 在无菌操作台中，取一块载玻片，在火焰灯上方略烤，去除玻片上的杂质。在载玻 片中央滴一滴无菌水，挑取单个菌落水滴中，用灼烧过的接种环涂抹均匀。将样品载玻片在 火灯上方来回过3次，W固定细胞。在涂布菌体的区域滴加1~2滴石碳酸碱性复红染液，染 色3min。
[0134] 本实施例的其余内容与实施例1相同，运里不再寶述。
[0135] 实施例3
[0136] 本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的所述巨大芽抱杆菌T317的固 氮酶活性为830nmol/(mL · h)，其在生长代谢过程中吗I噪乙酸的分泌量为340mg/L。
[0137] 步骤(3)固体发酵培养
[0138] 选取上述巨大芽抱杆菌T317,用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.2,接种量 0.6%，培养溫度为32°C，培养时间为58小时。
[0139] 所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由W下重量份的原料组成:教皮70%，豆巧 24%，化(：14.3%，〔曰(：03 1.6%，]\111504*此0 0.04%，]\%504.7此0 0.06%，培养基的抑为 7.2。
[0140] 所述步骤（1)中，分离筛选培养基由W下质量的原料制成：Ca(X)3 1.2g，MgS化· 7此0 0.8g，K2HP04l.5g，NaC10.2g，FeS04·7此0 0.002g，NaM04·2出0 0.06g，薦糖6g，琼 脂18g，蒸馈水1000ml，分离筛选培养基的抑为7.2。
[0141 ]本实施例的其余内容与实施例1或2相同，运里不再寶述。
[0142] 实施例4
[0143] 本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的所述巨大芽抱杆菌T317的固 氮酶活性为885nmol/(mL · h)，其在生长代谢过程中吗I噪乙酸的分泌量为375mg/L。
[0144] 步骤(3)固体发酵培养
[0145] 选取上述巨大芽抱杆菌T317,用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.3,接种量 0.8%，培养溫度为35°C，培养时间为54小时。
[0146] 所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由W下重量份的原料组成:教皮65%，豆巧 28%，船(：14%，(：曰(：03 1%，]?11504.出0 0.01%，]\%504*7出0 0.03%，养基的口出％7.3。
[0147] 所述步骤（1)中，分离筛选培养基由W下质量的原料制成：Ca(X)3 1.3g，MgS化· 7此0 1.0g，K2HP04l.8g，NaC10.3g，FeS04·7此0 0.004g，NaM04·2出0 0.09g，薦糖8g，琼 脂19g，蒸馈水1000ml，分离筛选培养基的抑为7.3。
[014引实施例5
[0149] 本实施例与实施例1或2的不同之处在于，本实施例的所述巨大芽抱杆菌T317的固 氮酶活性为900nmol/(mL · h)，其在生长代谢过程中吗I噪乙酸的分泌量为400mg/L。
[0150] 步骤(3)固体发酵培养
[0151] 选取上述巨大芽抱杆菌T317,用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.4,接种量 1.0%，培养溫度为37°C，培养时间为48小时。
[0152] 所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由W下重量份的原料组成:教皮75%，豆巧 20%，船(：15%，(：曰(：03 2%，]\111504.出0 0.05%，]\%504*7出0 0.08%，培养基的口出％7.4。
[0153] 所述步骤（1)中，分离筛选培养基由W下质量的原料制成：Ca(X)3 1.4g，MgS化· 7此0 1.2g，K2HP04 2.0g，NaC10.4g，FeS04·7此0 0.005g，NaM04·2出0 0.1g，薦糖10g，琼 脂20g，蒸馈水1000ml，分离筛选培养基的pH为7.4。
[0154] 本发明的巨大芽抱杆菌T317的16S rDNA序列菌种鉴定
[01W]细菌的个体微小，形态简单，传统方法鉴定细菌常根据它们在生理生化上的不同 反应作为分类鉴定的主要依据。20世纪70年代后期W来，国际上通用的"正式的"或"官方 的"细菌分类方法是W《伯杰氏鉴定细菌学手册》为依据。在生理生化鉴定中，通常会出现一 个或者几个生理指标不符合该菌种所具有的独特性质，难W明确对该菌株进行鉴定。目前， 细菌鉴定的方法通常将菌株的生理生化指标与分子生物学特性相结合，得出较为可靠地结 论。其中DNA序列分析的16S rRNA基因进化发育系统已经成为目前国际上细菌多相分类鉴 定常用的技术手段化im et al，2004;Prap et al，1997)。
[0156] 核糖体16S rDNA基因序列全长约1550bp，是由交替的保守区和可变区组成。利用 保守区域设计的通用引物，可W扩增出所有细菌的16S rDNA片段。16S rDNA序列分析技术 的基本原理是从微生物样本中提取16S rDNA片段，通过克隆、测序或酶切、探针杂交获得 16S rDNA的序列信息，再与16S rDNA数据库的序列数据或者其他数据进行比较，确定其在 进化树中的位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类。利用16S rDNA片段保守区域设 计的通用引物，不会对非细菌的DNA互补，而细菌的16S rDNA可变区的差异可W用来区分 不同的菌。因此通过对某菌株16S rDNA序列测定来获得最终鉴定证明的做法是被普遍认可 的。
[0157] 1、方法：
[015引（1化0?反应体系（2化1^: lOXPCRBttffer 2.5 u：L dNTP 化瓦福) 2. 0 μ L 引物 (10 μ Μ) ：Q.5uL
[0159] 引物 1 勉述 αΟ ?? Μ) Q,扫 UL DNA模板化日打哲 Tag 醋瓣 μ L) Θ. S u L 加也0 巧u L
[0160] (2化0?反应条件:95°(：预变性5111111，95°(：变性3〇3,58°(：退火3〇3,72°(：延伸8〇3,35 个循环，72°C延伸lOmin。使用ABI 3730x1 DM分析仪(应用生物系统公司）进行DM测序。
[0161] 2、测序结果
[0162]
[0163]
[0164] 3、同源性分析
[01化]鉴定本细菌为Bacillus megateri皿，巨大芽抱杆菌。
[0166] 本发明由广东省引进创新创业团队项目资助研发，制得的巨大芽抱杆菌T317及其 菌剂具有广阔的市场前景，经济效益高。
[0167] 最后应当说明的是，W上实施例仅用W说明本发明的技术方案，而非对本发明保 护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应 当理解，可W对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实 质和范围。
【主权项】
1. 一种巨大芽孢杆菌T317,其特征在于:所述巨大芽孢杆菌T317保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015753。2. 根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌T317,其特征在于:所述巨大芽孢杆菌T317 具有序列表NO. 1的DNA序列。3. 根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌T317,其特征在于:所述巨大芽孢杆菌T317 的固氮酶活性为800-900nm〇V(mL · h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为300-400mg/L〇4. 权利要求1-3任意一项所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于： 包括以下步骤： (1) 分离、筛选 选取含有巨大芽孢杆菌T317的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌 菌落； (2) 纯化、保存 在培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌 T317单菌落，保存该单菌落备用； (3) 固体发酵培养 选取上述巨大芽孢杆菌T317单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1-7.4， 接种量0.5-1.0%，培养温度为30-37°C，培养时间为48-60小时； (4) 菌剂制备 将发酵后产物烘干后打碎，进行活菌数检测，检测结果显示该活菌数范围是4-10亿/g， 即得到巨大芽孢杆菌T317菌剂。5. 根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于:所述步 骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成:麸皮65-75份，豆柏20-28份，NaCl 4-5份，CaC0 3 1-2份，MnS〇4.H20 0.01-0.05份，MgS〇4.7H20 0.03-0.08份，培养基的pH为7.卜7.4。6. 根据权利要求5所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于:所述步 骤(3 )固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮70份，豆柏24份，NaCl 4.3 份，CaC03 1.6份，MnS〇4 · H2O 0.04份，MgS〇4 · 7H20 0.06份。7. 根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于:所述步 骤(1)分离、筛选的具体方法为:选取土样，加入含吐温80的无菌水，震荡，静置，取上清液离 心，弃上清液，保留沉淀物，加入含吐温80的无菌水，悬浮，离心，去沉淀，将上清液离心，弃 上清液，保留沉淀物，将沉淀物用磷酸缓冲液悬浮，得到样品液;在上述样品液中加入磷酸 缓冲液，悬浮混合，得到稀释菌悬液;将稀释菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取涂布于无氮 培养基，培养获得固氮菌菌落。8. 根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于:所述步 骤（1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成< &(：031.0-1.48，1^304.7!120 0.6-1.2g，K2HP〇4 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，FeS〇4· 7H20 0.001-0.005g，NaM〇4· 2H20 0· 05-〇. lg，鹿糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000ml，分离筛选培养基的pH为7.1-7.4。9. 根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法，其特征在于:所述步 骤(2)和步骤(3)之间还包括有以下步骤： (51) 革兰氏染色:将纯化后的单菌落进行革兰氏染色，筛选得到阳性菌； (52) 芽孢染色:将阳性菌进行芽孢染色，筛选得到含有芽孢的革兰氏阳性菌单菌落。10.-种巨大芽孢杆菌T317的菌剂，其特征在于：由权利要求4-9任意一项所述的一种 巨大芽孢杆菌T317的菌剂制备方法制备而成。
【文档编号】A01P21/00GK106011002SQ201610345378
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】沈世华, 杨国平, 林敏 , 孙旭生, 王亚君, 尹坤, 杨盼盼, 张学贤, 陈三凤, 谭志远, 燕永亮
【申请人】东莞市保得生物工程有限公司