一种生产蜜环菌种的方法
【专利摘要】本发明涉及一种生产蜜环菌种的方法。该生产蜜环菌种的方法包括以下步骤：(1)将蜜环菌菌种接种到三角瓶液体培养基，经培养得到种子液体菌种；(2)将所述种子液体种接种到发酵罐液体培养基中，经培养得到蜜环菌液体菌种；(3)将发酵罐培养的液体菌种接种于固体培养基，培养获得蜜环菌固体栽培种。本发明的方法中，直接利用蜜环菌液体菌种，接种于聚乙烯塑料袋盛装的固体培养基，培养获得蜜环菌固体栽培种。提高了蜜环菌制种的成品率，同时也缩短了培养周期，降低了产品的生产成本。
【专利说明】
一种生产蜜环菌种的方法
技术领域
[0001]本发明涉及微生物生产的技术领域，具体而言，涉及一种生产蜜环菌种的方法。
【背景技术】
[0002]食用菌液体菌种生产技术是综合食用菌及工业发酵技术的一门交叉学科。1948年，最早利用食用菌液体发酵技术的是美国的Humfeld等对蘑菇进行的液体深层发酵研究，从此，食用菌的发酵生产在世界范围内兴起。90年代末，日本与韩国的可动发酵罐培养的液体菌种，称为“第二世代菌种”，被用于金针菇的工厂化栽培。在国内，2009年，黄爱荣利用全自动发酵罐对双孢菇液体发酵工艺进行了研究，2010年，沈敏等对杏孢菇的液体种进行了研发工作，并成功应用到工厂化栽培，并实现了高产、优质、高效的目标。
[0003]中国食用菌品种繁多，产量和种类居世界首位，先进的制种技术对我国食用菌生产和国际贸易具有重要的影响。当前，国际上食用菌制种业已走上产业化、专业化、工厂化大规模生产的道路。液体菌种以其具有培养时间短，发菌快，菌龄整齐，接种方便且污染率低等特点，并有利于食用菌规模化、周年化、工厂化生产，使其越来越受到食用菌生产企业的青睐，已成为食用菌制种业的发展趋势。
[0004]蜜环菌(学名:Armillaria mellea(Vahl)P.Kumm.)属于伞菌目、蜜环菌属，子实体一般中等大。是一种药、食兼用菌类。蜜环菌菌种主要用于著名中药材猪苓、天麻的栽培，市场需求量大。目前，国内外食用菌液体发酵技术的应用还仅限于杏孢菇、金针菇、蟹味菇等少数品种的工厂化栽培和食(药)用菌液体发酵提取多糖及代谢产物，在食(药)用菌纯粹制种上的应用还较少。
[0005]现有技术中，蜜环菌种生产，通常是一级蜜环菌试管种扩繁二级广口玻璃瓶蜜环菌固体原种(木肩麸皮培养料)，二级固体原种再扩繁三级小口玻璃瓶固体栽培种(木肩料)ο以上传统方法生产蜜环菌菌种，由于瓶口小，装料难，接种后透气性差，封口棉塞容易受潮污染杂菌，导致菌种培养周期长、成品率低、生产成本高。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明在于提供一种生产蜜环菌种的方法，该方法具有较短的培养周期和较高的成品率。
[0007]—种生产蜜环菌种的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0008](I)将蜜环菌菌种接种到置有液体培养基的三角瓶，经培养得到蜜环菌种子液体菌种；
[0009](2)将所述种子液体菌种接种到置有液体培养基的发酵罐中，经培养得到蜜环菌液体种；
[0010](3)将所述蜜环菌液体菌种接种到固体培养基上，经培养得到蜜环菌固体栽培种。[0011 ]进一步地，所述液体培养基组成包含:豆柏微粉0.5?1.5份、芝麻饼微粉0.5?1.5份、葡萄糖I?3份、磷酸二氢钾0.05?0.15份、硫酸镁0.02?0.08份、水94?102份。
[0012]进一步地，所述固体培养基包含固体培养料与水，按照重量百分数计，固体培养料包括:阔叶树木肩70?90%、麸皮10?20%、豆柏粉0.5?1.5%、芝麻饼粉0.5?1.5%、玉米粉0.5?1.5%、葡萄糖0.5?1.5%、石霄粉0.5?1.5%
[0013]进一步地，所述固体培养料与水的重量比为1:2?3。
[0014]进一步地，所述三角瓶培养的时间为5?7天。
[0015]进一步地，所述发酵罐培养的时间为5?7天，培养的温度为22?28°C，培养的压力为0.02?0.04MPa。
[0016]进一步地，步骤(3)所述固体菌种培养的时间为27?33天。
[0017]进一步地，步骤(3)所述培养的温度为22?28°C。进一步地，步骤(3)所述固体培养基置入聚乙烯料袋中。
[0018]进一步地，步骤(3)所述培养之前还包括:先常压灭菌，而后冷却，再臭氧消毒。
[0019]本发明的方法中，直接利用蜜环菌液体菌种，接种于固体培养基，保证了较高的成品率，同时也缩短了培养周期。
【具体实施方式】
[0020]为了便于理解本发明，下面结合实施例来进一步说明本发明的技术方案。
[0021]本发明生产蜜环菌种的方法，其特征在于，包括以下步骤:
[0022](I)将蜜环菌菌种接种到置有液体培养基的三角瓶中，经培养得到种子液体菌种；
[0023](2)将所述种子液体菌种接种到置有液体培养基的发酵罐中，经培养得到蜜环菌液体菌种；
[0024](3)将所述蜜环菌液体种接种于固体培养基，经培养获得蜜环菌固体栽培种。
[0025]上述液体培养基的种类不做特别严苛的要求。可列出一种对于蜜环菌具有适宜营养的液体培养基。其原料包含:豆柏微粉0.5?1.5份、芝麻饼微粉0.5?1.5份、葡萄糖I?3份、磷酸二氢钾0.05?0.15份、硫酸镁0.02?0.08份，例如豆柏微粉可为0.5份、0.55份、0.6份、0.8份、I份、1.2份、1.4份或1.5份等;芝麻饼微粉可为0.5份、0.55份、0.6份、0.8份、I份、1.2份、1.4份或1.5份等;葡萄糖可为I份、1.2份、1.5份、2份、2.5份、2.8份、2.9份或3份等；磷酸二氢钾可为0.05份、0.06份、0.08份、0.1份、0.12份、0.14份或0.15份等;硫酸镁可为0.02份、0.025份、0.03份、0.05份、0.07份、0.075份或0.08份等。较好地，该液体培养基豆柏微粉I份、芝麻饼微粉I份、葡萄糖2份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.05份、水94-102份
[0026]上述固体培养基的种类不做特别严苛的要求。可列出一种对于蜜环菌具有适宜营养的固体培养基。该固体培养基包含固体培养料和水，按照重量百分数计，，所述固体培养料包含:阔叶树木肩70?90 %、麸皮10?15 %、豆柏粉0.5?1.5 %、芝麻饼粉0.5?1.5 %、玉米粉0.5?1.5%、葡萄糖0.5?1.5%、石膏粉0.5?1.5%，例如阔叶树木肩可为70%、72%、75%、80%、85%、88%、89%或90%等；麸皮可为10%、11%、12%、12.5%、13%、14%、14.5%或15%等；豆柏粉可为0.5%、0.55%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.455或1.5%等；芝麻饼粉可为0.5%、0.55%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.45%或1.55%等；玉米粉可为0.5%、0.55%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.45%或1.5%等；葡萄糖可为0.5%、0.55%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.45%或1.5%等;石膏粉可为0.5%、0.55%、0.6%、0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.45%或1.5%等。较好地，固体培养料包含:阔叶树木肩80%、麸皮15%、豆柏粉I %、芝麻饼粉I %、玉米粉I %、葡萄糖I %、石膏粉I % ；
[0027]上述固体培养基中，固体培养料与水的用量比可参考性地为1:2?3，例如水的用量为2、2.2、2.5、2.8或3等。
[0028]上述步骤(I)的液体培养基的培养可采用不同的培养设备进行培养。可列举出一种实现方式为，可先将蜜环菌菌种接种到置有所述液体培养基的三角瓶中进行培养以得到三角瓶蜜环菌种子液体菌种，再将所述三角瓶种子液体菌种接种到置有所述液体培养基的发酵罐进行蜜环菌液体菌种培养。
[0029]上述三角瓶可采用100ml三角瓶，其可置入500ml液体培养基。三角瓶培养可置入摇床中。三角瓶培养的时间以三角瓶内充满大量细小菌球为培养的终点，可参考性地为5?7天，例如5天、5.5天、6天或7天等。三角瓶培养完毕后，在接种到种子罐之前，可提前半天在电磁搅拌器上高速搅拌3?4小时。
[0030]发酵罐的液体菌种培养条件为:温度可为22?28°(:，例如22°(:、23°(:、24°(:、25°(:、26°(:、27°(:、27.5°(:或28°(:;培养的压力可为0.02?0.04]\0^，如0.0210^、0.02 5MPa、0.03MPa、0.035MPa、0.038MPa或0.04MPa等。至于培养的时间，于上述温度和压力下，培养的时间可为5?7天，例如5天、5.5天、6天或7天等。
[0031]步骤(3)中培养的固体培养基可置入聚乙烯料袋中。此处，聚乙烯塑料袋的规格可以为(12?18cm) X (28?35cm)，且中间打孔，与传统方法的小口玻璃瓶(盐水瓶)相比，如果装料同量，容器成本由原来的0.55元下降至0.1元。与现有技术中的三角瓶的封口塞相比，本发明采用塑胶套环配合无棉塑料盖封口，可大幅降低污染率。
[0032]固体菌种培养的温度以22?28°C为宜，例如22 V、23°C、25°C、27 °C、28 °C等。固体菌种培养的时间以至菌丝长满培养料即可，例如培养时间为27?33天，例如27天、28天、29天、30天、32天或33天，优选为30天。
[0033]在培养之前还可以包括:先常压灭菌，而后冷却，再臭氧消毒灭菌。这里，常压灭菌的方式常用常规的公知方式灭菌，在此不赘述。此处，臭氧消毒是利用臭氧的强氧化性，其机理以下3种形式:1、臭氧能氧化分解细菌内部葡萄糖所需的酶，使细菌灭活死亡。2、直接与细菌、病毒作用，破坏它们的细胞器和DNA、RNA，使细菌的新陈代谢受到破坏，导致细菌死亡。3、透过细胞膜组织，侵入细胞内，作用于外膜的脂蛋白和内部的脂多糖，使细菌发生通透性畸变而溶解死亡。过滤除菌法是利用细菌不能通过致密具空滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。常用于热不稳定的药品溶液或原料的除菌;此处紫外线灭菌是利用紫外线照射杀灭物体表面的各种微生物，及穿透空气和对物品表面消毒能力强的特点。当然消毒还可采用本领域公知的方式来进行，可列举出气体灭菌、过滤除菌法等，气体灭菌是用化学消毒剂形成的气体来杀灭微生物的方法，常用的化学消毒剂有过氧乙酸、甲醛等。臭氧消毒安全环保。
[0034]上述臭氧消毒的时间可为3?511，例如311、3.511、411、4.511或511等，优选为411。步骤
(3)所述固体培养基的接种量，可每袋固体培养料(按培养料干物质重为250克计)接液体菌种20晕升的用量进行。
[0035]步骤(3)中固体培养基的接种设备，可采用自动接种生产线。该接种生产线可由不锈钢滚筒输送装置及顶置空气过滤除菌层流罩组成，工作人员在层流罩下的无菌区域操作；接种操作前开机2小时预除菌;液体菌种通过灭菌后的耐高压管道加压输送至接种工位;接种时将培养料从输送装置里端输送至接种工位，接种人员打开管道开关，利用脚踩电磁阀开关控制设定流量，再将连接管道的接种枪喷嘴对准打开的袋口，喷雾接种，然后快速封口即可。
[0036]采用自动接种生产线，可减少菌种生产的用工投入，提高劳动效率，传统工艺每人每天接种1200瓶左右，利用液体菌种扩繁，每人每天可扩繁接种4000袋以上。
[0037]实施例1
[0038]本例的蜜环菌种生产方法包括以下步骤:
[0039](I)配制液体培养基和固体培养基。
[0040]液体培养基按照如下组份制成，包含:豆柏微粉0.5份、芝麻饼微粉0.5份、葡萄糖I份、磷酸二氢钾0.05份、硫酸镁0.02份、水97.93份
[0041]固体培养基包含固体培养料和水，按照重量百分数计，固体培养料包含:阔叶树木肩75 %、麸皮22.5 %、豆柏粉0.5 %、芝麻饼粉0.5%,玉米粉0.5%、葡萄糖0.5%、石膏粉
0.5% ;料:水= 1:3
[0042](2)、以优良蜜环菌菌株“M-6”为供试菌株。
[0043](3)、在1000毫升三角瓶盛装500毫升培养液;接种试管菌种后，首先在电磁搅拌器上高速搅拌I小时后转入180转/分钟摇床培养，5天达到发酵终点，充满大量细小菌球，扩接前半天再次在电磁搅拌器上高速搅拌3?4小时，即可使用;直接将三角瓶蜜环菌液体种接入大型发酵罐，保压0.02Mp，恒温28 °C充气进行液体种培养，经过5天培养，液体菌种即可用于固体培养基的扩繁接种;每袋固体培养料(培养料干物质重为250克)接液体菌种20毫升。
[0044](4)、将灭菌预冷后的固体栽培种培养料送进接种室，经过3小时的高浓度臭氧消毒，再经I小时紫外线空间消毒，最后等待2小时后即可进行下一步的接种;接种生产线由不锈钢滚筒输送装置及顶置空气过滤除菌层流罩组成，工作人员在层流罩下的无菌区域操作；接种操作前开机2小时预除菌;液体菌种通过灭菌后的耐高压管道加压输送至接种工位;接种时将培养料从输送装置里端输送至接种工位，接种人员打开管道开关，利用脚踩电磁阀开关控制设定流量，再将连接管道的接种枪喷嘴对准打开的袋口，喷雾接种，然后快速封口即可;接种后的培养料输出后送进培养室，适温培养29天。
[0045]实施例2
[0046]本例的蜜环菌种生产方法包括以下步骤:
[0047](I)配制液体培养基和固体培养基。
[0048]液体培养基按照如下组份制成，包含:豆柏微粉1.5份、芝麻饼微粉1.5份、葡萄糖3份、磷酸二氢钾0.15份、硫酸镁0.08份、水93.77份
[0049]固体培养基包含固体培养料和水，按照重量百分数计，固体培养料包含:阔叶树木肩80%、麸皮12.5%、豆柏粉1.5%、芝麻饼粉1.5%、玉米粉1.5%、葡萄糖1.5%、石膏粉1.5% ;料:水= 1:2
[0050](2)、以优良蜜环菌菌株“M-6”为供试菌株。
[0051 ] (3)、在1000毫升三角瓶盛装500毫升培养液;接种试管菌种后，首先在电磁搅拌器上高速搅拌I小时后转入180转/分钟摇床培养，7天达到发酵终点，充满大量细小菌球，扩接前半天再次在电磁搅拌器上高速搅拌3?4小时，即可使用;直接将三角瓶蜜环菌液体种接入大型发酵罐，保压0.04Mp，恒温22°C充气进行液体种培养，经过7天培养，液体菌种即可用于固体培养基的扩繁接种;每袋固体培养料(培养料干物质重为250克)接液体菌种20毫升。
[0052](4)、将灭菌预冷后的固体栽培种培养料送进接种室，经过5小时的高浓度臭氧消毒，再经3小时紫外线空间消毒，最后等待2小时后即可进行下一步的接种;接种生产线由不锈钢滚筒输送装置及顶置空气过滤除菌层流罩组成，工作人员在层流罩下的无菌区域操作；接种操作前开机2小时预除菌;液体菌种通过灭菌后的耐高压管道加压输送至接种工位;接种时将培养料从输送装置里端输送至接种工位，接种人员打开管道开关，利用脚踩电磁阀开关控制设定流量，再将连接管道的接种枪喷嘴对准打开的袋口，喷雾接种，然后快速封口即可;接种后的培养料输出后送进培养室，适温培养30天。
[0053]实施例3
[0054]本例的蜜环菌种生产方法包括以下步骤:
[0055](I)配制液体培养基和固体培养基。
[0056]液体培养基按照如下组份制成，包含:豆柏微粉I份、芝麻饼微粉I份、葡萄糖2份、磷酸二氢钾0.1O份、硫酸镁0.05份、水95.85份
[0057]固体培养基包含固体培养料和水，按照重量百分数计，固体培养料包含:阔叶树木肩80 %、麸皮15 %、豆柏粉I %、芝麻饼粉I %、玉米粉I %、葡萄糖I %、石膏粉I %，料:水=1:
2.5
[0058](2)以优良蜜环菌菌株“M-6”为供试菌株。
[0059](3)在1000毫升三角瓶盛装500毫升培养液;接种试管菌种后，首先在电磁搅拌器上高速搅拌I小时后转入180转/分钟摇床培养，6天达到发酵终点，充满大量细小菌球，扩接前半天再次在电磁搅拌器上高速搅拌3?4小时，即可使用;去除二级种子罐培养环节，直接将三角瓶蜜环菌液体种接入大型发酵罐，保压0.03Mp，恒温25 V充气进行液体种培养，经过6天培养，蜜环菌液体菌种即可用于固体培养基的扩繁接种;每袋固体培养料(培养料干物质重为250克)接液体菌种20毫升。
[0060](4)、将灭菌预冷后的固体栽培种培养料送进接种室，经过4小时的高浓度臭氧消毒，再经2小时紫外线空间消毒，最后等待2小时后即可进行下一步的接种;接种生产线由不锈钢滚筒输送装置及顶置空气过滤除菌层流罩组成，工作人员在层流罩下的无菌区域操作；接种操作前开机2小时预除菌;液体菌种通过灭菌后的耐高压管道加压输送至接种工位;接种时将培养料从输送装置里端输送至接种工位，接种人员打开管道开关，利用脚踩电磁阀开关控制设定流量，再将连接管道的接种枪喷嘴对准打开的袋口，喷雾接种，然后快速封口即可;接种后的培养料输出后送进培养室，适温培养27天。
[0061 ] 实施例4
[0062 ]本例的蜜环菌种生产方法包括以下步骤:
[0063](I)配制液体培养基和固体培养基。
[0064]液体培养基按照如下组份制成，包含:豆柏微粉I份、芝麻饼微粉I份、葡萄糖2份、磷酸二氢钾0.1份、硫酸镁0.05份。
[0065]固体培养基包含固体培养料和水，按照重量百分数计，固体培养料包含:阔叶树木肩85 %、麸皮10 %、豆柏粉I %、芝麻饼粉I %、玉米粉I %、葡萄糖I %、石膏粉I %，料:水=1:
2.5
[0066](2)、以优良蜜环菌菌株“M-6”为供试菌株。
[0067](3)、在1000毫升三角瓶盛装500毫升培养液;接种试管菌种后，首先在电磁搅拌器上高速搅拌I小时后转入180转/分钟摇床培养，7天达到发酵终点，充满大量细小菌球，扩接前半天再次在电磁搅拌器上高速搅拌3?4小时，即可使用;直接将三角瓶蜜环菌液体种接入大型发酵罐，保压0.04Mp，恒温28 °C充气进行液体种培养，经过7天培养，液体菌种即可用于固体培养基的扩繁接种;每袋固体培养料(培养料干物质重为250克)接液体菌种20毫升。
[0068](4)、将灭菌预冷后的固体栽培种培养料送进接种室，经过5小时的高浓度臭氧消毒，再经3小时紫外线空间消毒，最后等待2小时后即可进行下一步的接种;接种生产线由不锈钢滚筒输送装置及顶置空气过滤除菌层流罩组成，工作人员在层流罩下的无菌区域操作；接种操作前开机2小时预除菌;液体菌种通过灭菌后的耐高压管道加压输送至接种工位;接种时将培养料从输送装置里端输送至接种工位，接种人员打开管道开关，利用脚踩电磁阀开关控制设定流量，再将连接管道的接种枪喷嘴对准打开的袋口，喷雾接种，然后快速封口即可;接种后的培养料输出后送进培养室，适温培养33天。
[0069]本发明具有以下优势:
[0070]A、利用液体菌种萌发快，封口快，降低杂菌污染率，提高固体菌种生产的成品率，成品率由传统工艺的85%提高到99%以上。
[0071]B、培养料中间打孔接种，上下菌种同时萌发生长，缩短菌种培养时间，由传统方法的80天左右，缩短到40天左右。
[0072]C、将原来的小口玻璃瓶(盐水瓶)盛装培养料改用加厚聚乙烯塑料袋，装料同量，容器成本由原来的0.55元下降至0.1元。棉塞封口改为无棉塑料盖封口，大幅降低了污染率。
[0073]D、液体菌种分散性好，萌发点多，发菌快，菌龄上下整齐一致，菌种活力强，能够克服传统工艺接种后培养时间长、菌种上部分菌龄过长、易失水老化、活力差的弱点，对天麻种植确保高产、稳产、优质具有重要意义。
[0074]E、采用自动接种生产线，减少菌种生产的用工投入，提高劳动效率，传统工艺每人每天接种1200瓶左右，利用液体菌种扩繁，每人每天可扩繁接种4000袋以上。
[0075]由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。
[0076]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。
【主权项】
1.一种生产蜜环菌种的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)将蜜环菌菌种接种到置有液体培养基的三角瓶中，经培养得到种子液体菌种； (2)将所述种子液体菌种接种到置有液体培养基的发酵罐中，经培养得到蜜环菌液体菌种； (3)将所述蜜环菌液体种接种到固体培养基，经培养获得蜜环菌固体栽培种。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基按照如下组份制成:豆柏微粉0.5?1.5份、芝麻饼微粉0.5?1.5份、葡萄糖I?2.5份、磷酸二氢钾0.05?0.15份、硫酸镁0.02?0.08份、水94?102份。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固体培养基包含固体培养料及水，按照重量百分数计，固体培养料包括:阔叶树木肩70?90 %、麸皮10?20 %、豆柏粉0.5?1.5%、芝麻饼粉0.5?1.5%、玉米粉0.5?1.5%、葡萄糖0.5?1.5%、石膏粉0.5?1.5%。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述固体培养料与水的重量比为:1:2?3。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(I)中三角瓶培养的时间为5?7天。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵罐液体菌种培养的时间为5?7天，培养的温度为22?28°C，培养的压力为0.02?0.04MPa。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养的时间为27?33天。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养的温度为22?28°C。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述固体培养基置入聚乙烯料袋中。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养之前还包括:先常压灭菌，而后冷却，再臭氧消毒。
【文档编号】C12R1/645GK106010975SQ201610343820
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】张顺凯, 周伟, 焦海涛, 杨先新, 王群
【申请人】湖北森源生态科技股份有限公司