一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法
【专利摘要】一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，包括如下步骤：第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附；第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩；第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂对Fe3+进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。本方法能够降低乳铁蛋白中Fe3+离子含量，使铁饱和度降低至5?8%，明显提高乳铁蛋白的抗菌活性和产品品质的标准化与一致性；通过调整Fe3+螯合树脂吸附的时间、搅拌速度以及媒介的浓度、pH，可以对乳铁蛋白中铁的饱和度进行控制，满足不同产品功能对乳铁蛋白饱和度的要求。
【专利说明】
一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，属于蛋 白提取与制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳铁蛋白具有抗微生物活性是由于它具有结合对于某些细菌生长必需的铁的能 力。一些研究者(Bishop等，1977 ;Payne等，1990)的研究证实乳铁蛋白的抗微生物活性依赖 于它的铁饱和度。Batish等人(1988)还发现低铁饱和度乳铁蛋白的抗菌活性比高铁饱和度 乳铁蛋白的抗菌活性高。中国专利CN200510095244.3公开了一种从牛奶或者乳清水中提取 与制备高纯度乳铁蛋白的方法，其中制备的乳铁蛋白纯度虽然较高，但是由于奶源的产地 不同，比如奶牛的品种、饲养地以及所用饲料均存在一定的区别，因此导致牛奶中乳铁蛋白 的铁饱和度具有较大的随机性，难以满足其标准化、规模化应用的需要。为拓宽乳铁蛋白应 用，为了保证功效的一致性，需要乳铁蛋白保持稳定一致的饱和度；目前将铁饱和度保持一 致的高饱和度可以通过加入铁离子的方式;但是在抗菌类药物的生产过程中为了保证功效 的稳定性，需要乳铁蛋白保持稳定一致的低铁饱和度，从而实现药物的标准化、规模化生 产;但是目前还未见将乳铁蛋白实现一致低铁饱和度的生产工艺，导致药物抗菌活性未能 达到最佳效果；因此，如何实现乳铁蛋白低铁饱和度，满足其做为药品原料标准化的要求， 即成为亟待解决的问题。
【发明内容】
[0003] 本发明涉及一种用阳离子交换树脂及不溶性Fe3+螯合树脂提取与制备与制备高纯 度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，解决现有技术制备的乳铁蛋白铁饱和度较高且随机而影响 抗菌性能的缺陷。
[0004] 技术方案是： 一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，包括如下步骤： 第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附； 第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩； 第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂对Fe3+进行吸附，再对浓缩液进行 浓缩。
[0005] 所述的第1步中，解附过程是采用二级解附，第一级解附是采用1~2.5%的盐溶液 解附，解附液是乳过氧化物酶蛋白，另用;第二级解附是采用3.5~7%的盐溶液解附，解附液 送入第2步处理。
[0006] 所述的盐溶液是指钠盐、钾盐或者钙盐溶液。
[0007] 所述的第2步中，采用分离膜对解附液进行浓缩;所述的分离膜是截留分子量在 1000~50K的超滤膜。
[0008] 所述的第3步中，不溶性Fe3+螯合树脂是指D403螯合树脂等系列树脂。
[0009] 所述的第3步中，所述的第3步中，吸附操作时需要在浓缩液中加入醋酸、醋酸盐以 及枸橡酸盐，配制其吸附环境中枸橡酸盐浓度为0.05mol/L~1. Omol/L，并调节pH至4.0~ 6.7;枸橼酸盐可以选择为枸橼酸钠;醋酸、醋酸盐建立缓冲体系，比如醋酸-醋酸钠缓冲液。
[0010] 所述的第3步中，树脂的吸附时间10~150分钟，吸附时搅拌桨转速速率为10~ 150rpm，吸附温度在3~30°C 所述的第2步得到的浓缩液在送入第3步之前，需要再经过一次弱酸型阳离子树脂的吸 附、解附和超滤膜的浓缩处理。
[0011] 所述的弱酸型阳离子树脂是指CM树脂等阳离子树脂。
[0012] 所述的第3步中，采用分离膜对浓缩液进行浓缩;所述的分离膜是截留分子量在 1000~50K的超滤膜。
[0013] 所述第1步中，阳离子交换树脂的制备步骤为： 第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体PS-acyl-Cl，加入60ml四氢呋喃 溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比PS-acyl-Cl:乙二胺:碳酸氢钠为1:8:0.7，依 次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80°C下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中， 用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体； 第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加 入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺3g、丙烯酸双环戊烯基酯、 K2C03 5g、四丁基溴化铵12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物 转移至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干， 真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
[0014] 所述牛乳可以是鲜牛乳、牛初乳、乳清或转基因牛乳。
[0015] 有益效果 本发明提供的方法具有乳铁蛋白提取与制备纯度高的优点，同时能够降低乳铁蛋白中 Fe3+离子含量，使铁饱和度降低至5-8%，从而明显提高了乳铁蛋白的抗菌活性。此外通过调 整Fe 3+螯合树脂吸附的时间、搅拌速度以及媒介的浓度、pH，可以对乳铁蛋白处理后的铁饱 和度进行控制，以满足不同产品应用对乳铁蛋白铁饱和度的要求。
【具体实施方式】
[0016] 本发明提供的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，它分别用 放置阳离子交换树脂的搅拌罐来吸附、解附牛乳中乳铁蛋白，并辅以膜分离技术将其分离、 浓缩，可以实现对乳铁蛋白的高度纯化;接下来，将所得乳铁蛋白浓缩液放置不溶性Fe 3+螯 合树脂(如D403螯合等系列树脂）的搅拌罐来吸附铁离子使其失去铁离子变为不饱和状态， 并辅以膜分离将其浓缩纯化。
[0017] 在使用阳离子交换树脂对乳铁蛋白进行吸附、解吸时，搅拌罐可调搅拌桨转速速 率为20~lOOrpm;罐内侧壁有增涡流挡板，罐底设置带过滤板的树脂床，在树脂床上的树脂 层上方8~12cm高度处设置快速导流抽滤管。罐内设置供自动控制的各种传感器pH计，重量 计，电导率计及温度计，罐内液体保温温度为3~60°C。乳铁蛋白吸附树脂为阳离子交换树 月旨，树脂吸附解附的次数和条件可以根据不同产品和产品纯度的要求设定;树脂的吸附时 间为20~120分钟，吸附温度在3~30°C。树脂的解附采用两级盐浓度分别解附乳过氧化物 酶蛋白、乳铁蛋白。第一级盐浓度为1~2.5%，解附乳过氧化物酶蛋白，解附时间为20~120 分钟;第二级盐浓度为3.5~7%，解附乳铁蛋白，解附时间为20~120分钟;解附的搅拌速率 为20~150rpm。树脂解附的时间为20~120分钟，树脂解附所用的盐为钠盐、钾盐、钙盐;乳 铁蛋白解附液通过0.05~1.4微米的微滤膜将乳铁蛋白解附液除菌，去残余的脂肪与其他 小颗粒;再用1K~50K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。
[0018] 在一个实施方式中，为了提高乳铁蛋白的纯度，可以对经上述工艺吸附解附脱盐 浓缩的乳铁蛋白浓液再经过一次弱酸型阳离子树脂(如CM树脂)的吸附、解附和超滤膜的浓 缩获得的。
[0019] 上述得到的浓缩液再放置于不溶性Fe3+螯合树脂如D403螯合树脂，加入醋酸溶液、 醋酸盐、枸橼酸盐作为媒介，配制其吸附环境浓度为〇 · 〇5mol/L~1 · Omol/L，调pH4 · 0~6 · 7， 加以搅拌吸附乳铁蛋白中铁离子，树脂吸附搅拌时间、媒介浓度、转速、pH可根据产品对铁 饱和度的要求设定(经实验测定，吸附时间对铁饱和度影响最大，拟取10~150分钟）；树脂 的吸附时间10~150分钟，搅拌桨转速速率为10~150rpm，吸附温度在3~30 °C。吸附后清液 用1K-50K分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。将乳铁蛋白浓液进行真空冷冻干燥制成冻 干粉。
[0020] 树脂经吸附工艺过程后，所吸附的铁离子用ImoVL~3mol/L盐酸浸泡即可将树脂 解附再生，再用R0水冲洗即可供下一批次吸附之用。
[0021] 实施例1阳离子交换树脂的制备 本发明所使用的阳离子交换树脂可以通过如下的方法制备得到： 第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体(PS-acyl-Cl)，加入60ml四氢呋 喃溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl):乙二胺(EDA):碳酸氢钠为1: 8:0.7,依次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80°C下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂 芯漏斗中，用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体； 第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加 入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸(AMPS)16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺(NBMA)3g、丙烯酸双 环戊烯基酯(DCPA)、K 2C03 5g、四丁基溴化铵(TBAB) 12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流 反应，反应结束后将反应产物转移至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至 中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
[0022]实施例2阳离子交换树脂的制备 与实施例1的区别在于第2步中未加入NBMA。
[0023]本发明所使用的阳离子交换树脂可以通过如下的方法制备得到： 第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体(PS-acyl-Cl)，加入60ml四氢呋 喃溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比(PS-acyl-Cl):乙二胺(EDA):碳酸氢钠为1: 8:0.7,依次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80°C下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂 芯漏斗中，用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体； 第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加 入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸(AMPS)16g、丙烯酸双环戊烯基酯(DCPA)、K2C03 5g、四丁 基溴化铵(TBAB) 12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物转移 至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干，真空 干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。
[0024] 实施例3乳铁蛋白的吸附、解附试验 配备3份100ml 1.6wt%乳铁蛋白溶液于250ml烧杯中，各取20μ1进高效液相色谱仪检 测，峰面积分别为1240.0034(万）、1241.6533(万）和1240.0535(万），分别将100gSPC70树 月旨、实施例1和实施例2中的阳离子交换树脂分别100g置于上述盛有250ml乳铁蛋白溶液的 烧杯中，吸附搅拌速率为60rpm，每lOmin取样一次进行检测，实验数据如下表看出实施例1 和2中阳离子树脂提高生产回收率，改善吸附解附所消耗的时间。另外，再经过盐溶液淋洗、 解附后计算蛋白含量。
[0025] 淋洗、解附的操作是:采用两级盐浓度分别解附乳过氧化物酶蛋白、乳铁蛋白。第 一级盐浓度为1.5%，采用的是NaCl水溶液，解附乳过氧化物酶蛋白，解附时间为70分钟;第 二级盐浓度为5.0%，采用的是NaCl水溶液，解附乳铁蛋白，解附时间为80分钟;解附的搅拌 速率为l〇〇 rpm。乳铁蛋白解附液通过0.2微米的微滤膜将乳铁蛋白解附液除菌，去残余的脂 肪与其他小颗粒;再用2000分子截留量的超滤膜进行脱盐和浓缩。
[0020」 从工衣H」以有m，术州們服、头她头她wjzTtfJPH 1??丁乂伏树脂者P可以 较好地获得乳铁蛋白的吸附、解附效果，不过回收率上还是有所区别。
[0027] 实施例4乳铁蛋白的提取与制备试验 半脱脂牛奶1890L，pH6.7，总蛋白为3.38g/L，乳铁蛋白浓度为126mg/L，将SPC70树脂加 入搅拌罐，吸附80min，搅拌速率为60rpm，收集已吸附后的牛奶并用R0水冲洗树脂，加入第 一级100L 2.5%NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用R0水淋洗收集;加 入第二级100L 5.5%NaCl水溶液解附40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用R0水淋洗收集 树脂3次。第二级的解吸液以及第二次R0淋洗液合并收集共180L，输送到0. Ιμπι的微滤膜设 备中进行除菌、除杂；用30Κ分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，取样检测其铁饱和度 为20%;将乳铁蛋白浓液输入到装有CM树脂罐中除去杂蛋白，收集已吸附杂蛋白后的乳铁蛋 白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，将其中的少量浓液进行冷冻干 燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0%，灰分1.1%，总蛋白为96.3%，铁饱和度20%;再将剩余的 乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进行脱铁，加入O.lmol/L枸橼酸盐，并醋 酸-醋酸钠缓冲液调pH至6.0，加以搅拌吸附铁离子，树脂吸附时间120分钟，搅拌桨转速速 率60rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱 盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.0%，灰分1.0%，总蛋白为 96.3%，铁饱和度7%。
[0028] 实施例5乳铁蛋白的提取与制备试验 半脱脂牛奶1890L，pH6.7,总蛋白为3.38g/L，乳铁蛋白浓度为126mg/L，采用实施例1中 描述的步骤操作生产阳离子交换树脂，将树脂加入搅拌罐，吸附80min，搅拌速率为60rpm， 收集已吸附后的牛奶并用R0水冲洗树脂，加入第一级100L 2.5%NaCl水溶液解附40min，搅 拌转速40rpm，收集解附液后用R0水淋洗收集；加入第二级100L 5.5%NaCl水溶液解附 40min，搅拌转速40rpm，收集解附液后用R0水淋洗收集树脂3次。第二级的解吸液以及第二 次R0淋洗液合并收集共180L，输送到0. Ιμπι的微滤膜设备中进行除菌、除杂；用30K分子截留 量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，取样检测其铁饱和度为20%;将乳铁蛋白浓液输入到装有CM 树脂罐中除去杂蛋白，收集已吸附杂蛋白后的乳铁蛋白溶液继续用10K分子截留量的超滤 膜设备进行脱盐浓缩，将其中的少量浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水量3.2%， 灰分1.1%，总蛋白为96.7%，铁饱和度20%;再将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯 合树脂罐中进行脱铁，加入O.lmol/L枸橼酸盐，并调pH至6.0,加以搅拌吸附铁离子，树脂吸 附时间120分钟，搅拌桨转速速率60rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用10K分 子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末含水 量3.1 %，灰分1.0%，总蛋白为96.7%，铁饱和度7%。
[0029] 实施例6乳铁蛋白的提取与制备试验 与实施例4的区别在于:将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进 行脱铁，加入1. Omol/L枸橼酸盐，并醋酸-醋酸钠缓冲液调pH至4.0，加以搅拌吸附铁离子， 树脂吸附时间20分钟，搅拌桨转速速率150rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续 用10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉 末含水量3.0%，灰分1.0%，总蛋白为96.4%，铁饱和度7%。
[0030] 实施例7乳铁蛋白的提取与制备试验 与实施例5的区别在于:将剩余的乳铁蛋白浓液输入到装有放置D403螯合树脂罐中进 行脱铁，加入0.3mol/L枸橼酸盐，并醋酸-醋酸钠缓冲液调pH至6.7，加以搅拌吸附铁离子， 树脂吸附时间70分钟，搅拌桨转速速率80rpm。收集以吸附铁离子后的乳铁蛋白溶液继续用 10K分子截留量的超滤膜设备进行脱盐浓缩，收集浓液进行冷冻干燥所得淡粉色干粉。粉末 含水量3.0%，灰分1.0%，总蛋白为96.5%，铁饱和度8%。
【主权项】
1. 一种从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其特征在于，包括如 下步骤： 第1步，使用阳离子交换树脂对牛乳中的乳铁蛋白进行吸附、解附； 第2步，对第1步得到的解附液进行浓缩； 第3步，第2步得到的浓缩液采用不溶性Fe3+螯合树脂进行吸附，再对浓缩液进行浓缩。2. 根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其 特征在于，所述的第1步中，解附过程是采用二级解附，第一级解附是采用1~2.5%的盐溶液 解附，解附液是乳过氧化物酶蛋白，另用;第二级解附是采用3.5~7%的盐溶液解附，解附液 送入第2步处理;所述的盐溶液是指钠盐、钾盐或者钙盐溶液。3. 根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其 特征在于，所述的第2步中，采用分离膜对解附液进行浓缩;所述的分离膜是截留分子量在 1000~50K的超滤膜。4. 根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其 特征在于，所述的第3步中，不溶性Fe3+螯合树脂是指D403螯合树脂。5. 根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其 特征在于，所述的第3步中，吸附操作时需要在浓缩液中加入醋酸、醋酸盐以及枸橼酸盐，配 制其吸附环境中枸橡酸盐浓度为〇. lmol/L~1 .Omol/L,并调节pH至4.0~6.7。6. 根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其 特征在于，所述的第3步中，树脂的吸附时间10~150分钟，吸附时搅拌桨转速速率为10~ 150rpm，吸附温度在3~30°C。7. 根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其 特征在于，所述的第2步得到的浓缩液在送入第3步之前，可再经过一次弱酸型阳离子树脂 的吸附、解附和超滤膜的浓缩处理;所述的弱酸型阳离子树脂是指CM树脂。8. 根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其 特征在于，所述的第3步中，采用分离膜对浓缩液进行浓缩;所述的分离膜是截留分子量在 1000~50K的超滤膜。9. 根据权利要求1所述的从牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，其 特征在于，所述第1步中，阳离子交换树脂的制备步骤为： 第1步，取10g氯乙酰化聚苯乙烯-二乙烯基苯微球载体PS-acyl-Cl，加入60ml四氢呋喃 溶胀12 h，再加入40ml甲醇，然后按照重量比PS-acyl-Cl:乙二胺:碳酸氢钠为1:8:0.7，依 次加入乙二胺和碳酸氢钠，在于80°C下搅拌反应24h，反应结束后，将产物倒入砂芯漏斗中， 用蒸馏水洗至中性，甲醇洗滤3遍真空干燥至恒重，得到交联EDA微球载体； 第2步，称60g取交联EDA微球载体，置于三颈烧瓶中，加入二甲基甲酰胺溶胀12 h后，加 入2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸16g、N-丁氧基甲基丙烯酰胺3g、丙烯酸双环戊烯基酯、 K2C03 5g、四丁基溴化铵12g，搅拌下于一定温度的油浴中回流反应，反应结束后将反应产物 转移至沙芯漏斗中，用5wt%的HC1清洗4遍后用蒸馏水滤洗至中性，最后用甲醇洗滤后抽干， 真空干燥至恒重，得到阳离子交换树脂。10. 根据权利要求1所述的牛乳中提取与制备高纯度低铁饱和度乳铁蛋白的方法，所述 牛乳可以是鲜牛乳、牛初乳、乳清或转基因牛乳。
【文档编号】C07K1/34GK106008703SQ201610526579
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】方雅悯, 陈新凯, 方存林
【申请人】方雅悯, 方存林