信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin及其在制备治疗肿瘤药物中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin及其在制备治疗肿瘤药物中的应用，属于含肽的医药配置品领域。所述的信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin是胰岛素原前体的突变体，突变位点为胰岛素原前体核苷酸序列的第73、74位碱基；所述F25P preproinsulin的核苷酸序列如序列表Sequence 1所示。本发明所述的信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin 能较好地并特异性的抑制肿瘤细胞的信号肽酶活性，有效的抑制外分泌蛋白的合成，抑制肿瘤的转移和进展，起到了抗肿瘤的作用。本发明提供了一种全新的治疗肿瘤的药物，具有极大的临床意义。
【专利说明】
信号肽酶抑制剂F25P prepro i nsu I i η及其在制备治疗肿瘤药 物中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于含肽的医药配置品领域，具体是一种信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin及其在制备治疗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 细胞的外分泌现象在免疫监视、炎症反应及癌症发生发展等生理和病理过程中起 着重要的作用，尤其在肿瘤细胞之间的交流，周围肿瘤细胞的生长支持，肿瘤细胞外基质的 改变，靶细胞中的基因重编码以及肿瘤的发生发展和侵袭转移等方面尤为重要。目前研究 发现，肿瘤细胞的外分泌功能在不同的肿瘤中以及在同一肿瘤的不同区域中存在着特异性 的差异。因此，肿瘤细胞外分泌功能的探索在肿瘤的发病机制、早期诊断以及寻找新的治疗 策略的研究中意义重大。
[0003] 肿瘤细胞外分泌功能异常是肿瘤的重要特征之一，与许多种肿瘤的发生发展，侵 袭转移密切相关。以胶质瘤为例，Xandra 0. Breakefield等人通过实验验证了胶质瘤中 EGFRvIII阳性表达的肿瘤细胞能通过外分泌的方式向细胞外分泌带有蛋白质的微小囊泡， 从而来促进肿瘤的转移及进展，并且证明了该外分泌的蛋白质可以作为诊断肿瘤的特异性 指标。肿瘤细胞中外分泌蛋白是在细胞中内质网上合成，前蛋白原通过信号肽的引导到达 内质网内膜上，然后通过信号肽酶的剪切作用，前蛋白原在内质网上组装、成熟，从内质网 上释放到细胞质内，从而分泌到细胞外发挥作用。因此，如果能有效调控肿瘤细胞外分泌过 程中的信号肽酶，则极其有助于推动肿瘤的治疗发展。目前，还没有确切有效的药物能抑制 肿瘤细胞的外分泌作用，并且从外分泌蛋白合成角度研究肿瘤的治疗也尚未报道。因此，发 现新的靶点以及药物来调控肿瘤细胞的外分泌过程，成为极为迫切的研究领域。
【发明内容】
[0004] 本发明就是为了解决现有治疗肿瘤的药物中不存在针对肿瘤细胞外分泌蛋白信 号肽酶的抑制剂的问题，所提出的一种信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin及其在制备治 疗肿瘤药物中的应用。
[0005] 本发明是按照以下技术方案实现的。
[0006] 一种信号肽酶抑制剂F25P prepro insul in，所述信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin是胰岛素原前体的突变体，突变位点为胰岛素原前体核苷酸序列的第73、74 位碱基;所述F25P preproinsulin的核苷酸序列如序列表Sequence 1所示。
[0007] 所述F25P preproinsulin的核苷酸序列是将胰岛素原前体核苷酸序列第73、74位 的胸腺嘧啶突变成胞嘧啶。
[0008] 一种上述信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin在制备治疗肿瘤药物中的用途。 [0009] 所述信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin抑制肿瘤细胞信号肽酶活性，抑制外分 泌蛋白的合成。
[0010] 本发明获得了如下有益效果。
[0011] 本发明有效的解决了现有治疗肿瘤的药物中不存在针对肿瘤细胞外分泌蛋白信 号肽酶的抑制剂的问题。本发明的信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin能较好地并特异性 的抑制肿瘤细胞的信号肽酶活性，有效的抑制外分泌蛋白的合成，抑制肿瘤的转移和进展， 起到了抗肿瘤的作用。本发明提供了一种全新的治疗肿瘤的药物，具有极大的临床意义。
【附图说明】
[0012] 图1是本发明F25P preproinsulin(突变型胰岛素)与野生型胰岛素核苷酸序列对 比图； 图2是本发明D0X诱导试剂浓度对载有野生型核苷酸序列的重组慢病毒表达量影响图； 图3是本发明D0X诱导试剂浓度对载有突变型核苷酸序列的重组慢病毒表达量影响图； 图4是本发明载有野生型和突变型核苷酸序列的重组慢病毒对D0X诱导试剂的时间依 赖性对比图； 图5是本发明体外实验中用ELI SA方法检测细胞上清中EGF细胞因子浓度图； 图6是本发明体外实验中用ELI SA方法检测细胞上清中VEGF细胞因子浓度图； 图7是本发明体外实验中用ELISA方法检测细胞上清中MMP-9细胞因子浓度图； 图8是本发明体内实验中用ELI SA方法检测小鼠血清中EGF细胞因子浓度图； 图9是本发明体内实验中用ELI SA方法检测小鼠血清中VEGF细胞因子浓度图； 图10是本发明体内实验中用ELI SA方法检测小鼠血清中MMP-9细胞因子浓度图； 图11是本发明体内实验中不同组别小鼠颅内肿瘤大小及转移灶形成图。
【具体实施方式】
[0013] 下面结合附图及实施例对本发明进行进一步的说明。
[0014] 1.核苷酸序列 1.1 F25P preproinsulin(突变型胰岛素)核苷酸序列 TCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCACCGGCGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGC TGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCCCTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCT CTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGG GCAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTG GCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGAATTCATGGACTAC AAGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGAACGCGTGG CCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGACGAAGGGCG CAGCGAGCGTCCTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAGCGGCCCGCTGCTCATAAGACTCGGCCTTAGAACCCC AGTATCAGCAGAAGGACATTTTAGGACGGGACTTGGGTGACTCTAGGGCACTGGTTTTCTTTCCAGAGAGCGGAACA GGCGAGGAAAAGTAGTCCCTTCTCGGCGATTCTGCGGAGGGATCTCCGTGGGGCGGTGAACGCCGATGATTATATAA GGACGCGCCGGGTGTGGC 1.2野生型胰岛素核苷酸序列(Gene ID:3630) CGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCACCGGCGCCACCATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCT GCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCCTTTGTGAACCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTC TCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTTCTTCTACACACCCAAGACCCGCCGGGAGGCAGAGGACCTGCAGGTGGGG CAGGTGGAGCTGGGCGGGGGCCCTGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCCTTGGCCCTGGAGGGGTCCCTGCAGAAGCGTGG CATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTCTACCAGCTGGAGAACTACTGCAACGAATTCATGGACTACA AGGATGACGATGACAAGGATTACAAAGACGACGATGATAAGGACTATAAGGATGATGACGACAAATGAACGCGTGGC CTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCCGCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTGCCACGTCAGAC F25P preproinsulin(突变型胰岛素)与野生型胰岛素核苷酸序列对比图如图1所示。
[0015] 2.载有野生型和突变型核苷酸序列的重组慢病毒的构建与表达 2.1重组慢病毒的构建 A:慢病毒载体的制备:载体编号:GV208(购自上海吉凯基因化学技术有限公司）;元件 顺序:Ubi-MCS-EGFP;焚光标记:EGFP;克隆位点:Agel;真核抗性:嘌呤霉素。
[0016] 载体酶切反应温度:37°C;酶切反应时间：2 h，酶切反应体系:ddH20 42 uL，10X buffer 15 yL，纯化的 DNA 质粒（1 ug/yL) 2 yL，Age I (5 U/yL) lyL，Total 50yL〇
[0017] B:目的基因片段的获取：引物（F:TCTACCTAGTGTGCGGGGAAR: AGAGGGAGCAGATGCTGGTA) PCR 扩增目的基因片段：PCR 反应体系：ddH20 12.4yL，5XTaq buffer 4yL，dNTPs (2.5mM) 1.6yL，Primer F(10y M) 0.4yL，Primer R(10y M) 0.4yL，Template(根据 Sequencel、2由上海吉凯基因化学有限公司合成）（10ng/yL) lyL，Taq polymerase 0.2yL。 PCR 反应条件：94°C 5 min，94°C 30 sec，55°C 30 sec，72°C 2 min，72°C 10 min〇
[0018] C:质粒构建： PCR产物交换入线性化表达载体：反应条件:25°C 30分钟-42°C 15分钟。反应体 系：ddH2〇 8yL; 10 X In-Fusion交换酶缓冲液2yL; In-Fusion交换酶0.5yL;线性化载体 DNA 2yL;纯化后PCR产物片段5yL。
[0019] 转化：1)用冷却的无菌吸头从感受态细胞(五DH5a购自购自上海吉凯基因 化学技术有限公司）悬液中各取200 uL转移到无菌的微量离心管中，每管加10 uL上述 连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟。2)将管放到预加温到42°C的循环 水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，不要摇动EP管架。3)快速将管转移到冰浴 中，使细胞冷却1 一2分钟。4)每管加800 uL LB培养基。用水浴将培养基加温至37°C， 然后将管转移到37°C摇床上，温育45分钟使细菌复苏。5)将150 uL已转化的感受态 细胞转移到AMP抗性（100ug/ml)的LB琼脂培养基上。6)将平板置于室温直至液体被吸 收。7)倒置平皿，于37°C培养，16小时。8)长出的克隆进行后续PCR鉴定(PCR产物的测 序由上海吉凯基因化学技术有限公司进行）。
[0020] D:慢病毒包装:细胞株:293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生 长培养基为DMEM(含10%FBS)，贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。菌株:大肠杆菌菌 株DH5a，用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。病毒载体:GV208载体，pHelper 1.0 载体，pHelper 2.0载体（购自上海吉凯基因化学技术有限公司）ANA溶液的制备：以 Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种质粒DNA，质粒DNA溶于除菌 的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的A260/A280在1.8~ 2.0之间。
[0021] Lentivirus病毒包装：1)转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细 胞(购自上海吉凯基因化学技术有限公司），以含10%血清的培养基调整细胞密度为1.2X 1〇7细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿，37 °C、5% C02培养箱内培养。24 h 待细胞密度达70%~80%时即可用于转染。
[0022] 2)转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。
[0023] 3)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(重组病毒质粒20 yg，pHelper 1.0载体15yg，pHelper 2.0载体10 yg)，与相应体积的Opti-MEM(购自上海吉凯基因 化学技术有限公司）混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5分钟。
[0024] 4)将Lipofectamine 2000试剂(购自上海吉凯基因化学技术有限公司）轻柔摇 匀，取100以11^口(^6(^3111丨116 2000试剂在另一管中与2.4 1111(^衍-]\^]\1混合，在室温下 温育5分钟。
[0025] 5)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混 匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。
[0026] 6)混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释 液的转染复合物。
[0027] 7)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀， 于37 °C，5% C02细胞培养箱中培养。
[0028] 8)培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液， 轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
[0029] 9)每瓶细胞中加入含10%血清的细胞培养基25 ml，于37 °C，5% C02培养箱内 继续培养48小时。
[0030] E:病毒的收获及浓缩：1)收集转染后48小时(转染即可为0小时计起）的293T 细胞上清液。
[0031] 2)于4 Γ，4000 g离心10 min，除去细胞碎片。
[0032] 3)以0·45μπι滤器过滤上清液于40 ml超速离心管中。
[0033] 4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤 过液收集管中。
[0034] 5)组合好后，做好平衡，放在转头上。
[0035] 6)在4000Xg离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。
[0036] 7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。
[0037] 8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。
[0038] 9)离心力不超过1000g，时间为2分钟。把过滤杯从样品收集杯上移开。样品收 集杯中的即为病毒浓缩液。
[0039] 10)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，_80°C长期保存。取其中一支进行 病毒生物学滴度测定。
[0040] 2.2重组慢病毒的表达 在实验细胞(U87和U87EGFRvIII)中加入含有野生型和突变型核苷酸序列的重组病毒， 然后设置不同浓度(〇 .2、0.4、0.6、0.8、1.0ug/ml)的D0X试剂诱导病毒的表达，48h后倒出培 养液，用PBS洗两次，加入lml Trizol，室温裂解2分钟，用移液器吹下细胞并置于EP管中，颠 倒10次，室温静置5分钟。加入200微升的氯仿，室温静置5分钟，4°C，12000rpm，离心20min。 转上层水相于另一个EP管中，加等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，温静置5分钟，4°C， 12000rpm，离心20min。小心吸弃上清，加预冷的75%乙醇，4°C，12000rpm，离心10min。弃上 清，EP管倒扣，空气干燥5min，溶于20微升的DEPC处理水中，完成RNA提取。
[0041 ] 反转录：1微升01 igo dT加5微克RNA，用DEPC处理水补齐到12微升，混匀后70°C保 温5min，立即放在冰上冰浴5分钟，然后加入4微升5 X反应缓冲液，1微升RNase抑制剂和2微 升1 Ommo 1 /L NTP，混匀后37 °C保温5分钟，加入1微升逆转录酶，42 °C反转录60分钟，70 °C终 止酶活性lOmin，反转录产物20微升置于-20°C保存。
[0042] Real-time PCR:按照定量PCR试剂盒（购自上海生工生物工程股份有限公司，型 号：SK2491-50次)进行，该试剂盒内有荧光染料SYBR和共同参与的定量PCR反应体系，对上 述逆转录产物进行定量检测。每个实验组设置三个副孔，重复3次。25μ1实时定量PCR反应体 系的制备如表1:
Real-time PCR过程使用MJ-real time PCR仪(BioRad公司，美国）完成，使用GAPDH作 为内参。Opticon 2软件计算AC(t)值(2-Δ ACT的计算方法)表示。处理实验结果，检测不 同组胰岛素的相对表达量。
[0043]实验结果表明：不同组病毒中胰岛素的表达量随着D0X浓度的增加表达量增加，但 是当浓度超过1.0后细胞的形态会发生改变，所以D0X的最适诱导浓度为1.0ug/ml(图2、3)。 [0044] 按照上述相同的方法加入病毒培养细胞，D0X诱导浓度为1.0ug/ml，设置48h、72h 两个不同的诱导表达时间点，用Real-time PCR的方法检测相同诱导浓度下不同时间点胰 岛素的表达量变化，实验具体步骤同上。
[0045]实验结果表明：在相同浓度的D0X试剂诱导表达下，诱导48小时的胰岛素表达量大 于72小时的表达量，在体外实验选择的诱导时间为48h(图4,其中**P〈0.01)。
[0046] 3.体外实验 以胶质瘤中U87EGFRvII I细胞为例，实验分为四组，空白对照组，病毒空载对照组，野生 型组，突变型组，实验前培养皿中更换为无血清培养基，按照病毒的滴度以及培养皿中细胞 的密度加入相应的病毒量(病毒空载对照组，野生型组，突变型组，各加入相应的病毒15μ 1)，并且按照D0X诱导试剂的最适诱导浓度（l.Oμg/ml)加入诱导试剂来诱导病毒基因的表 达，在培养箱中培养48小时后收集相应的上清液，用ELISA的方法检测上清液中细胞因子 (EGF、VEGF、MMP-9 )的浓度，实验方法如下： 1.包被过程(设置空白对照，阴性对照）：将所用抗原(EGF、VEGF、MMP9)用包被稀释液稀 释到适当浓度，置于37°C保温4h或4°C存放24h，弃去孔中液体（为避免蒸发，板上应加盖或 将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中）。
[0047] 2 .封闭酶标反应孔:5%小牛血清置37 °C封闭40min。封闭时将封闭液加满各反应 孔，并去除各孔中的气泡，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。洗涤方法:吸干孔 内反应液，将洗涤液注满板孔，放置2min略作摇动，吸干孔内液，倾去液体后在吸水纸上拍 干，洗涤次数为3次。
[0048] 3.加入待检测样品：检测时一般采用1: 50-1:400的稀释度，应采用较大稀释体积 进行，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔l〇〇yL，置于37°C反应 40_60min。用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
[0049] 4.加入酶标抗体(EGF、VEGF、MMP9):每孔加100μL，置于37°C反应30-60min，短于 30min往往结果不稳定，洗涤步骤同步骤3。
[0050] 5.加入底物液(现用现配）：首选TMB-过氧化氢尿素溶液，oro-过氧化氢底物液系 统次之。底物加入量:每孔100yL，置37 °C避光放置3-5分钟，加入终止液显色。
[0051 ] 6.终止反应:每孔加入终止液50yL终止反应，于20min内测定实验结果。
[0052] 7.结果判断：显色后采用450nm波长。检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用 测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为 抗体的效价。
[0053] 实验结果表明（图5-7):空白对照组，空载对照组以及野生型胰岛素组上清中的 EGF、VEGF、MMP-9浓度变化较小，而在加入突变型病毒的细胞上清中三种细胞因子浓度显著 降低。
[0054] 4动物实验 4.1小鼠颅内原位模型的建立 (1) 实验分为四组:野生型组(D0X诱导），野生型组(无 D0X诱导），突变型组(D0X诱导）， 突变型组(无 D0X诱导），按照体外实验中所述的方法转染U87EGFRvIII细胞，取转染过相应 重组慢病毒的U87EGFRvIII胶质母细胞瘤细胞经0.125%胰酶消化，lOOOrpm常温离心 10min，去上清，以PBS离心洗涤2次； (2) 计算细胞数:调整细胞浓度至2X108/ml，将细胞悬浮于无血清DMEM培养液中， 制成细胞悬液； (3) 将待试验小鼠称重，用5%的水合氯醛腹腔注射麻醉(剂量:0.001ml/g); (4) 常规碘酊、消毒头部皮肤，沿头部正中线偏右3mm并与两耳连线垂直切开头部皮 肤，暴露颅骨，取对侧眼、耳连线交点偏右2mm处，细针钻透颅骨，将小鼠用立体定向仪(北 京吉安得尔科技有限公司、ALC-H)三角架固定； (5) 量程为5μ1的微样进样器吸取3μ1细胞悬液(约含5X105细胞)后置于立体定 向仪上，沿钻孔处进针3mm，后退1mm，启动立体定向仪缓慢注入细胞悬液； (6) 注射完毕后，将皮肤切口缝合，并消毒创面，小鼠放回笼中。
[0055] 4.2 ELISA方法检测小鼠血清中细胞因子(EGF、VEGF、MMP-9)的浓度 颅内原位模型建立后18天，每组取6只小鼠从内眦静脉取血，离心后取上清液，然后用 ELISA的方法检测小鼠血中相应细胞因子的浓度，同时解剖相应组小鼠的脑组织，用HE染色 的方法观察不同组别小鼠脑组织中肿瘤的大小及肿瘤转移情况。
[0056]结果显示表明：在四个组别中，加入野生型病毒的组内，以及加入突变型病毒无 D0X诱导的组内小鼠血液上清中EGF，VEGF，丽P-9基本没有变化（图8-10)，而在加入突变型 病毒组内（D0X诱导）小鼠血液上清中三个细胞因子降低明显，EGF的降低减弱了对周围细胞 的生长刺激作用，VEGF的降低减弱了肿瘤内部血管的生成，MMP-9的表达降低则减弱了细胞 外基质对肿瘤生长的支持作用，同时也减弱并且抑制了肿瘤细胞的转移效应。观察小鼠颅 内肿瘤发现（图11 )，加入突变型病毒且D0X诱导的组内小鼠颅内的肿瘤大小明显小于其他 组，无转移灶的形成。EGF的表达降低能明显减弱小鼠颅内肿瘤的大小，VEGF表达的降低使 该组小鼠颅内肿瘤中的血管生成明显减少，同时血清中MMP-9的减少减弱了肿瘤细胞外基 质的降解，不利于肿瘤细胞的转移，使加入突变型病毒且D0X诱导的组内没有出现明显的转 移灶。综上所述，加入突变型病毒且D0X诱导能通过减弱小鼠血液上清中EGF，VEGF，MMP-9的 表达来抑制颅内肿瘤的生长，同时抑制肿瘤的转移。 SEQUENCE LISTING 〈11〇>天津医科大学总医院 〈120>信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin及其在制备治疗肿瘤药物中的应用 <130> 1 <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 784 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 〈220〉 〈221> F25P preproinsulin 〈222〉 （1)..(784) 〈400〉 1 tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcaccggc gccaccatgg ccctgtggat gcgcctcctg 60 cccctgctgg cgctgctggc cctctgggga cctgacccag ccgcagcccc tgtgaaccaa 120 cacctgtgcg gctcacacct ggtggaagct ctctacctag tgtgcgggga acgaggcttc 180 ttctacacac ccaagacccg ccgggaggca gaggacctgc aggtggggca ggtggagctg 240 ggcgggggcc ctggtgcagg cagcctgcag cccttggccc tggaggggtc cctgcagaag 300 cgtggcattg tggaacaatg ctgtaccagc atctgctccc tctaccagct ggagaactac 360 tgcaacgaat tcatggacta caaggatgac gatgacaagg attacaaaga cgacgatgat 420 aaggactata aggatgatga cgacaaatga acgcgtggcc tccgcgccgg gttttggcgc 480 ctcccgcggg cgcccccctc ctcacggcga gcgctgccac gtcagacgaa gggcgcagcg 540 agcgtcctga tccttccgcc cggacgctca ggacagcggc ccgctgctca taagactcgg 600 ccttagaacc ccagtatcag cagaaggaca ttttaggacg ggacttgggt gactctaggg 660 cactggtttt ctttccagag agcggaacag gcgaggaaaa gtagtccctt ctcggcgatt 720 ctgcggaggg atctccgtgg ggcggtgaac gccgatgatt atataaggac gcgccgggtg 780 tggc 784 <130> 2 <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 526 <212> DNA <213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 〈220〉 〈221>野生型胰岛素 〈222〉 (1)..(526) <400> 1 cgtttagtga accgtcagat cgcaccggcg ccaccatggc cctgtggatg cgcctcctgc 60 ccctgctggc gctgctggcc ctctggggac ctgacccagc cgcagccttt gtgaaccaac 120 acctgtgcgg ctcacacctg gtggaagctc tctacctagt gtgcggggaa cgaggcttct 180 tctacacacc caagacccgc cgggaggcag aggacctgca ggtggggcag gtggagctgg 240 gcgggggccc tggtgcaggc agcctgcagc ccttggccct ggaggggtcc ctgcagaagc 300 gtggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg gagaactact 360 gcaacgaatt catggactac aaggatgacg atgacaagga ttacaaagac gacgatgata 420 aggactataa ggatgatgac gacaaatgaa cgcgtggcct ccgcgccggg ttttggcgcc 480 tcccgcgggc gcccccctcc tcacggcgag cgctgccacg tcagac 526
【主权项】
1. 一种信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin，其特征在于:所述信号肽酶抑制剂F25P preproinsulin是胰岛素原前体的突变体，突变位点为胰岛素原前体核苷酸序列的第73、74 位碱基;所述F25P preproinsulin的核苷酸序列如序列表Sequence 1所示。2. 根据权利要求1所述的一种信号肽酶抑制剂F25P preproinsul in，其特征在于:所述 F25P preproinsulin的核苷酸序列是将胰岛素原前体核苷酸序列第73、74位的胸腺嘧啶突 变成胞嘧啶。3. -种权利要求1所述的信号肽酶抑制剂F25P preproinsul in在制备治疗肿瘤药物中 的用途。4. 根据权利要求3所述的信号肽酶抑制剂F25P preproinsul in在制备治疗肿瘤药物中 的用途，其特征在于:所述信号肽酶抑制剂F25P preproinsul in抑制肿瘤细胞信号肽酶活 性，抑制外分泌蛋白的合成。
【文档编号】C07K14/62GK106008694SQ201610291581
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月5日
【发明人】康春生, 魏建伟, 刘铭, 崔景秋, 陈鹭跃, 杨超
【申请人】天津医科大学总医院