一种苦瓜皂苷的新型提取方法
【专利摘要】本发明涉及天然产物深加工技术领域，具体涉及一种苦瓜皂苷的新型提取方法，包括以下步骤：S1取干燥的苦瓜粉溶于乙醇中，振荡摇匀，放置在60℃水浴锅中浸提1h之后离心获得苦瓜皂苷醇提液，并于旋转蒸发器中真空浓缩至浓缩液无醇味，制得苦瓜皂苷提取液A；S2采用异丙醇/(NH4)2SO4双水相体系进行萃取，分配平衡后分相，取上相，制得苦瓜皂苷提取液B；S3将苦瓜皂苷粗提液B通过AB?8型大孔吸附树脂进一步纯化，制得苦瓜皂苷精提物C；S4冷冻干燥制备苦瓜皂苷成品。与传统方法相比，本发明通过乙醇浸提、双水相萃取和大孔树脂结合分离得到的苦瓜皂苷，苦瓜皂苷得率有所增加，苦瓜皂苷的降血糖活性也明显提高。
【专利说明】
一种苦瓜皂苷的新型提取方法
技术领域
[0001] 本发明涉及天然产物深加工技术领域，具体涉及一种苦瓜皂苷的新型提取方法。
【背景技术】
[0002] 苦瓜，属于萌芦科苦瓜属植物，是一种"药食两用"的天然植物，苦瓜中含有苦瓜皂 苷、多糖、蛋白质和多肽等多种化学成分。苦瓜皂苷是一类比较复杂的苷类化合物，又称配 糖体(glycoside )，是由糖或糖的衍生物等与另一非糖物质通过其端基碳原子联接而成的 化合物，是由皂苷元和糖、糖醛酸或其它有机酸所组成，根据苷元的化学结构可分为三萜皂 苷和留体皂苷两大类。据报道其具有抗肿瘤、提高免疫、降血糖、抑菌、抗病毒等功能。苦瓜 皂苷具有一般皂苷的性质如分子量较大，不易结晶，一般呈无色或乳白色粉末，易溶水、乙 醇和热甲醇。目前，国内外关于苦瓜皂苷的提取工艺的研究报道很少，一般常见的报道用甲 醇-乙醚，石油醚-乙酸乙酯-正丁醇等有机溶剂提取，这样会导致有机溶剂残留、药物活性 降低或丧失，目标产物收率低等一系列问题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种苦瓜皂苷的新型提取方法，通过新型双水相体系和大孔 树脂结合分离方法增加苦瓜总皂苷的得率，解决现有提取方法有机溶剂残留，药物活性成 分不高，目标产物收率低等问题。
[0004] 为了实现上述的目的，采用如下的技术方案。
[0005] -种苦瓜皂苷的新型提取方法，该方法包括以下步骤： S1取干燥的苦瓜粉溶于乙醇中，振荡摇匀，放置在60°C水浴锅中浸提lh之后离心获得 苦瓜皂苷醇提液，并于旋转蒸发器中真空浓缩至浓缩液无醇味，制得苦瓜皂苷提取液A; S2采用异丙醇/(NH4)2S04双水相体系进行萃取，分配平衡后分相，取上相，制得苦瓜皂 苷提取液B; S3将苦瓜皂苷粗提液B通过AB-8型大孔吸附树脂进一步纯化，制得苦瓜皂苷精提物C; S4冷冻干燥制备苦瓜皂苷成品。
[0006] 进一步地，步骤S1所述的乙醇浓度为70 %乙醇。70 %乙醇对苦瓜皂苷的浸出率和 提取率较高。
[0007] 进一步地，步骤S1中苦瓜粉与乙醇溶液固液比为l:20(g/mL)，离心条件是4000rpm 离心10min。
[0008] 进一步地，步骤S2中双水相萃取条件为系线长度(TLL)为83,相比（R)为3,其中各 组分质量分数分别为74.994%异丙醇、40.111 % (NH4)2S〇4，分配平衡30min。
[0009] 进一步地，步骤S3中大孔树脂纯化苦瓜皂苷的具体步骤如下： 树脂预处理： 先于吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.4~0.5倍的水，然后将新树脂投入柱中，使 其液面高于树脂层约0.3m处;反洗:水量由小逐渐变大，使树脂充分展开而不流出，以排水 清澈、透明为止;正洗:使树脂床层落实。用2BV的2 %NaOH溶液，以1~2BV/h的流速通过树脂 层，并浸4~8小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性； 用2BV乙醇，以lBV/h的流速通过树脂层，并浸泡8~12小时。用乙醇，以lBV/h的流速通 过树脂层，洗至流出液加水（1:4比例)不呈白色浑浊止;并以水以同样流速洗净乙醇；用2BV 的5 %HCL溶液，以4~6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2~4小时，而后用水以同样流速洗至 出水pH中性； 装柱： 取处理好的树脂于水中湿法装柱，玻璃柱L = 30cm，内D=1.6cm树脂装填高度25cm，树 脂体积50mL，用蒸馏水过夜压柱，流速1.5mL/min; 上样： 将处理好的苦瓜皂苷提取液B上样，皂苷浓度0.8637mg/mL，上样体积为200mL，上样流 速为0.5ml/min，待样品流完后，吸附lh; 洗脱： 先用蒸馏水洗至流出液经苯酚-硫酸检测不显红色（除去多糖杂质），流速为1.5mL/ min，再用460mL的0-100 %的乙醇梯度洗脱，最后用60mL (-个柱体积)无水乙醇洗脱，洗脱 流速为lml/min;用分布收集器对洗脱下的溶液进行收集，共收集68管，然后根据浓度梯度 将洗脱曲线画出来;苦瓜皂苷提取液B经纯化后收集乙醇浓度为72-82 %的洗脱液，旋转蒸 发除去乙醇，制成苦瓜皂苷精提物C。
[0010] 本发明的另一目的在于保护利用上述新型提取方法制备的苦瓜皂苷精提物及苦 瓜皂苷成品。
[0011] 本发明的苦瓜皂苷新型提取方法及提取物具有的优点： (1) 本发明依次采用乙醇浸提、双水相萃取和大孔树脂分离，避免了传统方法收率低等 弊端，提取工艺简单、成本低，适于间歇性和规模化生产加工高纯度、高得率的苦瓜皂苷成 品； (2) 本发明所采用的双水相系统反应反应条件温和不会引起生物活性物质失活或变 性，能耗小，不存在有机溶剂残留问题，用药安全性高，适合于天然生物活性成分分离； (3) 本发明的新型方法对苦瓜皂苷有明显的富集效果，该方法制得的苦瓜总皂苷的得 率在相同情况下比传统方法下制得的苦瓜总皂苷的得率高出很多； (4) 本发明的新型方法对苦瓜皂苷的降血糖活性有明显的提高作用，该方法制得的苦 瓜皂苷精提物在相同情况下比传统方法下制得的苦瓜皂苷精提物的降血糖活性明显高出 很多，利用异丙醇/(NH4)2S04体系结合大孔树脂层析能富集低极性的苦瓜皂苷组分，这种 极性的苦瓜皂苷组分的降血糖活性远远高于传统方法，其降糖活性最高与降血糖药阿卡波 糖相近。
[0012] 与传统方法相比，本发明通过乙醇浸提、双水相萃取和大孔树脂结合分离得到的 苦瓜皂苷，苦瓜皂苷得率有所增加，苦瓜皂苷的降血糖活性也明显提高。本发明通过双水相 系统对苦瓜中有效成分皂苷进行分离纯化，可以实现廉价化，高效化操作。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明的苦瓜皂苷提取工艺流程图； 图2是三种不同方法所得皂苷洗脱曲线图，从上到下依次是单独采用大孔树脂层析洗 脱图，乙醇/(NH4)2S04体系结合大孔树脂层析洗脱图，异丙醇/(NH 4)2S04体系结合大孔树脂 层析洗脱图； 图3为总皂苷得率图，从左到右依次为大孔树脂层析所得总皂苷得率，乙醇/(NH4)2S0 4 体系结合大孔树脂层析所得总皂苷得率，异丙醇/(NH4)2S04体系结合大孔树脂层析所得总 阜苷得率； 图4是本发明实施例中三种方法下得到的苦瓜皂苷及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑 制率图，其中：图（a)、（b)、（c)和(d)分别为苦瓜皂苷精提物C1、C2、C3及阿卡波糖对α-葡萄 糖苷酶活性抑制率情况。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合【具体实施方式】和附图对本发明作进一步的描述。
[0015] 实施例1使用三种不同提取方法制备苦瓜皂苷 s 1制备苦瓜皂苷提取液A:取55g干燥的苦瓜粉以1:20 (g/mL)的固液比溶于70 %的乙醇 中，振荡摇匀，放置在60 °C水浴锅中，lh后取出，4000rpm离心10min，合并上清液，获得苦瓜 皂苷醇提液并于旋转蒸发器中真空浓缩至浓缩液无醇味，制得苦瓜皂苷提取液A。 S2制备苦瓜皂苷提取液B1:采用乙醇/(NH4)2S〇4双水相体系萃取苦瓜皂苷醇提液A，双 水相萃取条件为系线长度(TLL)为45，相比(R)为2.5，其中各组分质量分数分别为45.195% 乙醇、33.594% (NH4)2S〇4，分配平衡30min后分相，取上相，制得苦瓜皂苷提取液B1。 S3制备苦瓜皂苷提取液B2:采用异丙醇/(NH4)2S〇4双水相体系萃取旋蒸除去乙醇后的 苦瓜皂苷醇提液A，双水相萃取条件为系线长度(TLL)为83,相比(R)为3,其中各组分质量分 数分别为74.994%异丙醇、40.111 % (順4)2S〇4，分配平衡30min后分相，取上相，制得苦瓜皂 苷提取液B2。 S4制备苦瓜皂苷精提物(：1工2、03:将苦瓜皂苷提取液4、81、82(皂苷浓度分别为1.2、 1.2、0.8637mg/mL)通过AB-8型大孔吸附树脂进一步纯化。大孔吸附树脂使用前先要进行预 处理，预处理步骤如下:先于吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.4~0.5倍的水，然后将新 树脂投入柱中，使其液面高于树脂层约0.3m处。反洗:水量由小逐渐变大，使树脂充分展开 而不流出，以排水清澈、透明为止。正洗:使树脂床层落实。用2BV的2 % NaOH溶液，以1~2BV/ h的流速通过树脂层，并浸4~8小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。用2BV乙醇，以 lBV/h的流速通过树脂层，并浸泡8~12小时。用乙醇，以lBV/h的流速通过树脂层，洗至流出 液加水（1:4比例）不呈白色浑浊止。并以水以同样流速洗净乙醇。用2BV的5 % HCL溶液，以4 ~6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2~4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性。取三 份等量处理好的树脂分别于水中湿法装柱，（玻璃柱L = 30cm,内径D = 1.6cm)，树脂装填高 度25cm，树脂体积40mL，用蒸馏水过夜压柱，流速为1.5mL/min。分别取200mL苦瓜皂苷提取 液A、B1、B2上柱，上样流速为0.5ml/min，待样品流完后，吸附lh。然后用蒸馏水洗至流出液 经苯酸 -硫酸检测不显红色，流速为1.5mL/min，再用460mL的0-100%的乙醇梯度洗脱，最后 用60mL(-个柱体积)无水乙醇洗脱，洗脱流速为lml/min。用分布收集器对洗脱下的溶液进 行收集，共收集68管，然后根据浓度梯度将洗脱曲线画出来。苦瓜皂苷提取液A、B1经纯化后 收集乙醇浓度为60-70 %的洗脱液，旋转蒸发除去乙醇，分别制成苦瓜皂苷精提物Cl、C2，苦 瓜皂苷提取液B2经纯化后收集乙醇浓度为72-82 %的洗脱液，旋转蒸发除去乙醇，分别制成 苦瓜皂苷精提物C3; S5分别冷冻干燥制备淡黄色粉末状苦瓜皂苷D1、D2、D3成品。
[0016] 其中，本发明的苦瓜皂苷提取工艺流程图如图1所示。通过测定在传统大孔树脂和 新型双水相-大孔树脂结合分离苦瓜皂苷这两种方法下所收集到的68管的皂苷浓度，画出 洗脱曲线图，并计算总皂苷得率。如图2所示，三种方法下所得皂苷洗脱曲线图，从上到下依 次是单独采用大孔树脂层析洗脱图，乙醇/(NH 4)2S04体系结合大孔树脂层析洗脱图，异丙 醇/(NH4) 2S04体系结合大孔树脂层析洗脱图，图3为总皂苷得率图，从左到右依次为大孔树 脂层析所得总皂苷得率，乙醇/(NH 4)2S04体系结合大孔树脂层析所得总皂苷得率，异丙醇/ (NH 4)2S04体系结合大孔树脂层析所得总皂苷得率。由图2和3可知，单独采用大孔树脂层析、 乙醇/(NH 4)2S04结合大孔树脂层析、异丙醇/(NH4) 2S04结合大孔树脂层析这三种方法处理lg 苦瓜粉所得苦瓜总皂苷的得率分别是5.65、15.1、8.0mg/g。说明双水相体系和大孔树脂层 析结合后苦瓜总皂苷的得率与传统方法相比有所提高。
[0017] 实施例2体外降糖活性测定指标评定 本实施例中样品为阿卡波糖、苦瓜皂苷成品〇1、02、03。苦瓜皂苷提取液六、81经纯化后 收集乙醇浓度为60-70 %的洗脱液，旋转蒸发除去乙醇，分别制成苦瓜皂苷精提物Cl、C2，苦 瓜皂苷提取液B2经纯化后收集乙醇浓度为72-82 %的洗脱液，旋转蒸发除去乙醇，分别制成 苦瓜皂苷精提物C3。分别冻干燥制备淡黄色粉末状苦瓜皂苷D1、D2、D3成品。苦瓜皂苷体外 降糖活性测定指标由其对α-葡萄糖苷酶活性抑制率来评定。
[0018] 实验原理：
反应体系组成： (1) 67mM磷酸盐缓冲液：称取0.912g的磷酸二氢钾用蒸馏水溶解，定容至100mL，用 lmol/L的氢氧化钠溶液调PH至6.8; (2) 10mM的PNPG(4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷）：称取0.151g的PNPG用67mM磷酸盐缓冲 液溶解，定容至50mL; (3) 100mM的碳酸钠溶液:称取1.060g的无水碳酸钠用蒸馏水溶解，定容至100mL; (4) 3mM的谷胱甘肽(GSH):称取0.046的谷胱甘肽干粉用蒸馏水溶解，定容至50mL; (5) a-葡萄糖苷酶：将100U的a-葡萄糖苷酶干粉用67mM磷酸盐缓冲液溶解，定容至 10mL，即配制10U/mL的母液，分装，用时再将母液稀释25倍至0.4U/mL; (6) 苦瓜皂苷样品:将通过传统大孔树脂分离和新型双水相-大孔树脂结合分离三种方 法得到的苦瓜皂苷各组分提取液蒸干，得到苦瓜皂苷成品01、02、03，并用67!1^磷酸盐缓冲 液溶解形成溶液。
[0019] 实验步骤： 取100yL样品、100yL的0.4U/mL的a-葡萄糖苷酶、200yL的GSH和1.3mL的磷酸盐缓冲液， 37 °C保温10min，向其中加入100yL的PNPG，反应20min，后再加入lmL的Na2C03溶液终止反应 2-3min，最后用分光光度计于波长400nm处测其吸光度值。
[0020] 实验设置4组： (1) 空白组：100yL 的 PNPG+1.5mL 的磷酸盐缓冲液+200yLGSH+lmLNa2C〇3 (2) 样品组：100yL样品+ 100yL酶+100yL的PNPG+1.3mL的磷酸盐缓冲液+200yLGSH+ lmLNa2C〇3 (3) 对照组：100yL 酶+100yL 的 PNPG+1.4mL 的磷酸盐缓冲液+200yLGSH+lmLNa2C〇3 (4) 样品空白组：10OyL样品+10OyL的PNPG+1.4mL的磷酸盐缓冲液+20OyLGSH+ lmLNa2C〇3 α-葡萄糖苷酶活性抑制率： 酶活性抑制率（％) = {1-(Α样品组一 Α样品空白组)/(Α对照组一 Α空白组）}Χ100%
[0021] 如图4所示，这三种方法下得到的苦瓜皂苷对α-葡萄糖苷酶活性均有一定的抑制 作用。图(a)、（b)、（c)和(d)分别为苦瓜皂苷成品D1、D2、D3及阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性 抑制率情况。其中苦瓜皂苷精提物D1的α-葡萄糖苷酶抑制率的IC 5Q = 380yg/mL，D2的IC50 = 80yg/mL，D3的IC5〇 = 50yg/mL，阿卡波糖的IC5〇 = 42yg/mL。与传统单独采用大孔树脂分离方 法相比，双水相体系结合大孔树脂方法所得皂苷具有较高降血糖活性，而且异丙醇/(NH 4) 2S04体系结合大孔树脂层析能富集低极性的苦瓜皂苷组分，这种方法所得的苦瓜皂苷组分 的降血糖活性是三种方法中最高，与阿卡波糖的降糖活性相近。
[0022]虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种苦瓜皂苷的新型提取方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： S1取干燥的苦瓜粉溶于乙醇中，振荡摇匀，放置在60°C水浴锅中浸提lh之后离心获得 苦瓜皂苷醇提液，并于旋转蒸发器中真空浓缩至浓缩液无醇味，制得苦瓜皂苷提取液A; S2采用异丙醇/(NH4)2S04双水相体系进行萃取，分配平衡后分相，取上相，制得苦瓜皂 苷提取液B; S3将苦瓜皂苷粗提液B通过AB-8型大孔吸附树脂进一步纯化，制得苦瓜皂苷精提物C; S4冷冻干燥制备苦瓜皂苷成品。2. 根据权利要求1所述的新型提取方法，其特征在于，步骤S1所述的乙醇浓度为70%乙 醇。3. 根据权利要求1所述的新型提取方法，其特征在于，步骤S1中苦瓜粉与乙醇溶液固液 比为1:20(g/mL)，离心条件是4000rpm离心10min。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中双水相萃取条件为系线长度 (TLL)为83,相比(R)为3,其中各组分质量分数分别为74.994%异丙醇、40.111%(顺) 23〇4， 分配平衡30min。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S3中大孔树脂纯化苦瓜皂苷的具体步 骤如下： 树脂预处理:先于吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.4~0.5倍的水，然后将新树脂 投入柱中，使其液面高于树脂层约〇.3m处;反洗:水量由小逐渐变大，使树脂充分展开而不 流出，以排水清澈、透明为止;正洗:使树脂床层落实。用2BV的2 % NaOH溶液，以1~2BV/h的 流速通过树脂层，并浸4~8小时，而后用水以同样流速洗至出水pH中性； 用2BV乙醇，以1 BV/h的流速通过树脂层，并浸泡8~12小时。用乙醇，以1 BV/h的流速通 过树脂层，洗至流出液加水（1:4比例)不呈白色浑浊止;并以水以同样流速洗净乙醇；用2BV 的5 %HCL溶液，以4~6BV/h的流速通过树脂层，并浸泡2~4小时，而后用水以同样流速洗至 出水pH中性； 装柱：取处理好的树脂于水中湿法装柱，玻璃柱L = 30cm，内D=1.6cm树脂装填高度 25cm，树脂体积50mL，用蒸馏水过夜压柱，流速1.5mL/min; 上样:将处理好的苦瓜皂苷提取液B上样，皂苷浓度0.8637mg/mL，上样体积为200mL，上 样流速为〇. 5ml/min，待样品流完后，吸附lh; 洗脱：先用蒸馏水洗至流出液经苯酚-硫酸检测不显红色（除去多糖杂质），流速为 1.5mL/min，再用460mL的〇-100%的乙醇梯度洗脱，最后用6〇111以一个柱体积）无水乙醇洗 脱，洗脱流速为lml/min;用分布收集器对洗脱下的溶液进行收集，共收集68管，然后根据浓 度梯度将洗脱曲线画出来;苦瓜皂苷提取液B经纯化后收集乙醇浓度为72-82%的洗脱液， 旋转蒸发除去乙醇，制成苦瓜皂苷精提物C。6. 由权利要求1-5任一项所述新型提取方法制备的苦瓜皂苷精提物及苦瓜皂苷成品。
【文档编号】C07J17/00GK106008647SQ201610521955
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月5日
【发明人】刘杨, 李明莉, 肖湘
【申请人】汕头大学