一种泼尼松龙人工抗原及其制备方法与应用
【专利摘要】本发明公开了一种泼尼松龙人工抗原及其制备方法与应用。本发明所提供的泼尼松龙人工抗原为将式I所示的泼尼松龙半抗原与载体蛋白偶联所得的抗原。本发明所提供泼尼松龙人工抗原合成方法简单，纯度高和产率高，对于泼尼松龙抗体的制备，以及泼尼松龙药物残留检测具有重大价值。
【专利说明】
一种泼尼松龙人工抗原及其制备方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药及化学领域，涉及一种泼尼松龙人工抗原及其制备方法与应 用。
【背景技术】
[0002] 泼尼松龙属于肾上腺皮质激素类药物，具有抗炎、抗过敏、免疫抑制等药理作用， 临床应用广泛。在动物食品中的残留对人体健康有潜在的威胁。
[0003] 目前，兽药残留检测常用的方法有气相色谱、高效液相色谱以及气质联用等理化 分析方法。虽然这些方法特异性强、灵敏度高，但是样品前处理操作步骤繁琐，成本较高，也 不适用于大批量样品的筛选检测。免疫化学分析鉴于在抗原抗体的定性定量方面独特的优 势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，在 泼尼松龙的残留检测中起着越来越重要的作用。
[0004] 影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于 免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成是产生特异性抗体和建立小分 子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种泼尼松龙人工抗原及其制备方法与应用。
[0006] 本发明所提供的泼尼松龙人工抗原是在泼尼松龙半抗原的基础上构建所得的抗 原。
[0007] 所述泼尼松龙半抗原属于本发明的保护范围，其结构如式I所示。
[0008]
[0009] 本发明还提供了制备所述泼尼松龙半抗原的方法。
[0010] 本发明所提供的制备所述泼尼松龙半抗原的方法，具体可包括如下步骤:将泼尼 松龙与琥泊酸酐按照质量比为500mg: 145-150mg(如500mg: 150mg)的比例进行反应，获得所 述化合物。
[0011]其中，所述反应的温度具体可为70-80°C (如80°C)，时间具体可为2-3h(如3h)。所 述反应的催化剂和溶剂均为吡啶。
[0012]具体而言，制备所述泼尼松龙半抗原的方法包括如下步骤:将泼尼松龙溶于吡啶 后，加入琥珀酸酐，所述泼尼松龙、所述吡啶和所述琥珀酸酐的配比为500mg: 5ml: 145- 150mg(如 50011^:51111:15011^)，70-80°(：(如80°(：)反应2-311(如311)，减压蒸除所述吡啶，获得 所述化合物。
[0013] 在所述"减压蒸除所述吡啶"后还可包括如下步骤：向残余物中加入冰水，析出白 色固体，过滤，水洗干燥，获得所述化合物。其中，所述泼尼松龙、所述吡啶、所述琥珀酸酐和 所述冰水的配比为500mg:5ml: 145_150mg: 10ml(如500mg:5ml: 150mg: 10ml)。
[0014] 在泼尼松龙半抗原的基础上构建所得的泼尼松龙抗原也属于本发明的保护范围。
[0015] 所述泼尼松龙抗原，为将所述泼尼松龙半抗原(式I)与载体蛋白偶联所得的抗原。 在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（0VA)。
[0016] 所述泼尼松龙抗原的制备方法也属于本发明的保护范围。
[0017] 所述泼尼松龙抗原的制备方法，具体可包括如下步骤:将所述泼尼松龙半抗原(式 I)与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述泼尼松龙抗原。
[0018] 其中，所述泼尼松龙半抗原(式I)与所述载体蛋白偶联的摩尔比为22.22:1。
[0019] 在本发明中，所述泼尼松龙抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：
[0020] (al)将所述泼尼松龙半抗原（式I)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，20-25°C磁力搅 拌反应3h，得到溶液I;
[0021] 其中，所述泼尼松龙半抗原(式I)、所述二甲基甲酰胺(DMF)、所述1-(3-二甲氨基 丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)、所述N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)的配比为21.2mg: 1.5ml：25mg：25mg；
[0022] (a2)将所述载体蛋白置于0.1M碳酸缓冲液中，4000rpm搅拌10mn，充分溶解，得到 溶液II;所述〇. 1M碳酸缓冲液的pH为9.6，溶剂为水，溶质及浓度如下:碳酸钠0. lmol/L，碳 酸氢钠〇. lmol/L;所述载体蛋白与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为5〇-67mg: 3.5ml;
[0023] 其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA)，则所述牛血清白蛋白（BSA)与所述 0.1M碳酸缓冲液的配比为50mg:3.5ml;若所述载体蛋白为卵清蛋白（0VA)，则所述卵清蛋白 (0VA)与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为67mg: 3.5ml;
[0024] (a3)将所述溶液I和所述溶液II按照条件A进行混合，混合后后于20_25°C磁力搅 拌反应24h，得到溶液III;
[0025] 所述条件A为:所述溶液I中的所述泼尼松龙半抗原(式I)与所述溶液II中的所述 0.1M碳酸缓冲液的配比为21.2mg: 3.5ml;
[0026] 其中，将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在4°C条件下，将所述溶液I逐滴加 入到所述溶液Π 中，边加边搅拌；
[0027] (a4)用磷酸盐缓冲液(0.01M PBS，pH7.4)，于4°C对所述溶液III搅拌透析3天，得 到所述泼尼松龙抗原;所述磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯 化钠和氯化钾;所述磷酸二氢钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为〇. 27g/L，所述磷酸氢二钠 在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为1.42g/L，所述氯化钠在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为8g/ L，所述氯化钾在所述磷酸盐缓冲液中的浓度为0.2g/L;所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4。
[0028]所述泼尼松龙半抗原(式I)或所述泼尼松龙抗原在如下(a)或(b)中的应用也属于 本发明的保护范围：
[0029] (a)定性或定量检测泼尼松龙；
[0030] (b)制备泼尼松龙抗体。
[0031] 利用所述泼尼松龙抗原制备的抗体也属于本发明的保护范围。
[0032 ]所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。
[0033]本发明所提供的泼尼松龙半抗原，以及所述泼尼松龙抗原，合成方法简单，纯度高 和产率高，对于泼尼松龙抗体的制备，以及泼尼松龙药物残留检测具有重大价值。
【附图说明】
[0034]图1为泼尼松龙半抗原质谱图。
[0035] 图 2 为BSA 的 MALDI-T0F-MAS 图。
[0036] 图3为泼尼松龙BSA复合物的MALDI-T0F-MAS图。
【具体实施方式】
[0037] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0038] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0039] 泼尼松龙:百灵威科技有限公司产品，其产品编号EN300-53017。
[0040]实施例1、泼尼松龙半抗原的制备 [0041] -、泼尼松龙半抗原的制备
[0042]在50ml圆底烧瓶中加入泼尼松龙500mg，5ml吡啶(催化剂兼溶剂)溶解后加入琥珀 酸酐150mg，80 °C反应3h，TLC检测原料反应完毕后处理，减压蒸除吡啶，残余物中加入10ml 冰水，析出白色固体，过滤，水洗干燥得380mg产品。
[0043] 反应方程式如下：
[0044]
[0045] 二、泼尼松龙半抗原的结构鉴定
[0046] 对所得380mg产品进行质谱检测（图1)，结果显示其化学结构式如式I所示(MW = 460)，即为泼尼松龙半抗原。
[0047]
[0048] 实施例2、泼尼松龙人工抗原的制备及结构鉴定
[0049] -、泼尼松龙人工抗原的制备
[0050] 1、免疫原的合成
[0051] (1)将实施例1制备得到的半抗原（式1)21.21^溶解于1.51^二甲基甲酰胺(01^) 中，完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)25mg，N-羟基 琥珀酰亚胺(NHS) 25mg，室温(20-25 °C)磁力搅拌反应3h，得到溶液I。
[0052] (2)称取50mg牛血清白蛋白（BSA)，溶解于3.5mL 0· 1M碳酸缓冲液中，400rpm搅拌 lOmin，充分溶解，得到溶液II。
[0053]其中，所述0.1M碳酸缓冲液的pH为9.6，溶剂为水，溶质及其浓度如下：此：^03 1.59g/L，NaHC03 2.94g/L。
[0054] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C )环境下逐滴加入到上述溶液II中，边加边搅拌， 室温(20-25 °C)磁力搅拌反应24h，得到溶液III。
[0055] (4)将所述溶液III装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋（15cm)，lL 0.01M roS(pH = 7.4)透析3天，4 °C搅拌透析，每天更换透析液3次，透析产物4500rpm离心6min，0.5ml/管分 装，将抗原编号，-20 °C保存备用。
[0056] 其中，所述0.01M PBS(pH=7.4)的溶剂为水，溶质及其浓度如下：磷酸二氢钾 0.27g/L，磷酸氢二钠1.42g/L，氯化钠8g/L，氯化钾0.2g/L。
[0057] 2、包被原的合成
[0058] (1)将实施例1制备得到的半抗原（式1)21.21^溶解于1.51^二甲基甲酰胺(01^) 中，完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)25mg，N-羟基 琥珀酰亚胺(NHS) 25mg，室温(20-25 °C)磁力搅拌反应3h，得到溶液I。
[0059] (2)称取67 · Omg卵清蛋白（0VA)，溶解于3 · 5mL 0 · 1Μ碳酸缓冲液pH = 9 · 6 (配方同 上）中，400rpm搅拌1 Omin，充分溶解，得到溶液II。
[0060] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C )环境下逐滴加入到上述溶液II中，边加边搅拌， 室温(20-25 °C)磁力搅拌反应24h，得到溶液III。
[0061] (4)将所述溶液III装入1个蒸馏水冲洗干净透析袋（15cm)，1L roS(配方同上)透 析3天，4°C搅拌透析，每天更换透析液3次，透析产物4500rpm离心6min，0.5ml/管分装，将抗 原编号，-20 °C保存备用。
[0062]二、泼尼松龙人工抗原的鉴定
[0063]免疫原 MALDI-TOF-MS 鉴定结果显示偶联比为：R= (76510 · 205-66288 · 367)/460 = 22.22(图2和图3)。即免疫原中，所述泼尼松龙半抗原(式I)与牛血清白蛋白（BSA)偶联的摩 尔比为22.22:1。
[0064]实施例3、泼尼松龙人工抗原免疫动物制备抗血清 [0065] 一、动物免疫
[0066]用步骤实施例2获得的泼尼松龙人工抗原"泼尼松龙-BSA"作为免疫原免疫新西兰 大白兔。每次免疫剂量为1〇〇~200!^，免疫方式为双肩部和后大腿皮下多点注射，每个区域 大约用1/4的免疫原。首免时将免疫原用生理盐水稀释，然后与弗氏不完全佐剂进行1:1(体 积比）混合制成乳化剂，每间隔2周取相同剂量免疫原加等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后 加强免疫一次，采用此方式共加免3次后，间隔3~4周再取相同剂量免疫原加弗式不完全佐 剂进行末次免疫，耳动脉取血检测抗体效价。末次免疫7-10天后采用颈动脉放血，每只兔子 可得血100-120ml左右，取完的血在4°C冰箱放置5~6小时，然后以5000rpm离心10min，分离 血清。
[0067]二、抗血清效价测定
[0068]采用间接ELISA法测定步骤一所得血清的抗体效价，具体如下：
[0069] 1)包被:在96孔酶标板中加入100yL浓度为2yg/mL的"泼尼松龙-OVA"溶液（用包被 缓冲液进行稀释），同时设置不包被抗原的对照，4°C包被过夜，用PBS缓冲液洗涤3次。
[0070] 包被缓冲液:pH9.6、0.05mol/L的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(溶剂为水，溶质及其浓 度如下：Na 2C03 1.59g/L和NaHC03 2.93g/L)。
[0071] 2)封闭：加入150μLν孔的封闭液，在37 °C孵育2h，弃封闭液，洗涤3次，拍干。置于4 °(：冰箱保存备用。
[0072]封闭液:含有0.5% (体积百分含量)小牛血清、3% (3g/100ml)酪蛋白的磷酸盐缓 冲液，PH7.4。
[0073] 3)加待测样品：吸取不同稀释度的待测血清100μΙ，加入对应的酶标板中，37°C孵 育30min，洗板4次，拍干。
[0074]同时设置未经免疫的兔血清的对照；以PBS代替待检测样品的对照（阴性对照孔）。
[0075] 4)加酶标二抗:取HRP标羊抗兔IgG抗体(Jackson ImmunoResearch公司，货号111-035-003)，按体积比1:5000倍稀释后，100μΙ/孔，37°C孵育20至30min，洗涤4次，拍干。
[0076] 5)显色:将 20 X TMB 稀释至1 X TMB，按100μΙ/孔加入，37 °C 显色 15-30min。
[0077] 6)终止：加入终止液（2M H2S〇4)50yl/孔。
[0078] 7)读数：以450nm单波长测定各孔0D值，以与阴性对照孔（以PBS代替待测样品的对 照)0D值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为血清效价的临界点。
[0079] ELISA结果判定方法：以P/N>2.1的血清最大稀释倍数表示。
[0080] 结果表明血清中的抗体效价为1:16000。
[0081 ]实施例4、泼尼松龙酶联免疫试剂盒检测泼尼松龙
[0082] -、泼尼松龙酶联免疫试剂盒的组装
[0083] 1、泼尼松龙酶联免疫试剂盒的组成包括如下：
[0084] (1)泼尼松龙标准品工作液:6瓶，1 · 5mL/瓶，浓度为0ng/ml、0 · lng/ml、0 · 3ng/ml、 0·9ng/ml、2·7ng/ml、8·lng/ml;
[0085] (2)泼尼松龙酶标板：1块(8孔X 12条），为包被了实施例2制备得到的"泼尼松龙- 0VA"的酶标板。
[0086] (3)泼尼松龙抗体工作液：1瓶(7mL)，为抗体稀释液将抗体进行1:8000稀释，抗体 稀释液为含6% (体积分数）山羊血清的0.2mol/L PBS，所述泼尼松龙抗体为实施例3制备得 到的抗血清纯化所得的抗体。
[0087] (4)酶标记物工作液：1瓶（12mL)，酶标记物具体为经辣根过氧化酶标记的羊抗鼠 的抗体。
[0088] (5)样品稀释液：1 瓶（10X，15mL)，为0.01M ρΗ7·4的PBS。
[0089] (6)洗涤液：1 瓶（20Χ，25mL)，为0.01mol/L ρΗ7·4的PBST溶液。
[0090] (7)底物Α液、底物Β液各1瓶(7mL)。其中，底物Α为2%过氧化脲水溶液。底物Β为1 % 四甲基联苯胺水溶液。
[0091] (8)终止液：1瓶(7mL)，为2mol/L H2S〇4溶液。
[0092] (9)盖板膜；
[0093] (10)自封袋。
[0094] 2、需要而未提供的设备和材料
[0095] (1)设备
[0096] 酶标仪(检测波长450nm，参考波长630nm)、天平(精度:0.01g)、漩涡振荡器、离心 机(4000g)、摇床(300rpm)、氮吹仪、微量移液器、计时器。
[0097] (2)试剂
[0098] 样品提取液:称取NaCl 20g，K2HP〇4 · 3H20 26g于干净烧杯中，加入200mL去离子水 溶解。
[0099] 乙酸乙酯、正己烷。
[0100] 3、贮存
[0101] 该试剂盒贮存于2_8°c，切勿冷冻，有效期1年。
[0102] 未使用完的酶标板条应密封，2_8°C保存。
[0103] 4、试剂盒检测原理
[0104] 样品中的泼尼松龙与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标记物，催化 底物显色，根据显色的深浅来判断样品中泼尼松龙的含量。显色深，含量少，反之，含量多。
[0105] 二、泼尼松龙酶联免疫试剂盒的使用方法
[0106] 1、样品前处理
[0107] (1)鸡肉、鸭肉(稀释系数:1)
[0108] a)取2±0.02g组织样品于50mL离心管中，加入2mL样品提取液(见步骤一2)，充分 祸动30s;b)加入8mL乙酸乙酯，祸动lmin;c)摇床300rpm振摇10min;d)4000g以上，离心 1 Omin; e)取4mL上清液于新的4mL离心管中；f)50-60°C水浴中，氮气吹干;g)加入lmL样品稀 释液，再加入2mL正己烧，充分祸动lmin;h)4000g以上，离心5min，完全弃去上层正己烧及中 间层杂质；i)取50yL进行检测。
[0109] (2)原奶(稀释系数:2)
[0110] a)取2ml新鲜原奶于50mL离心管中，加入8mL乙酸乙酯，剧烈涡动lmin(如果使用多 管漩祸混合仪则需祸动2min); b)4000g以上，离心10min; c)取2mL上清液于新的4mL离心管 中（注:避免吸入上层漂浮杂质，否则影响检测结果）；d)50-60°C水浴中，氮气吹干;e)加入 lmL样品稀释液，再加入2mL正己烧，充分祸动lmin;f )4000g以上，离心5min，完全弃去上层 正己烷及中间层杂质;g)取50yL进行检测。
[0川]2、检测步骤
[0112] (1)将板条插入酶标板架上，并记录下各标准品和样品的位置，建议均做双孔平 行，未使用的板条用自封袋密封后，立即保存于2_8°C环境中；
[0113] (2)将50yL各浓度的泼尼松龙标准品工作液(或待测样品溶液)分别加入对应的标 准品(或待测样品孔)中；
[0114] (3)在每孔中加入50yL泼尼松龙抗体工作液；
[0115] (4)盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下（25 ± 2 °C )，避光反应 20min；
[0116] (5)揭开盖板膜；
[0117] (6)倒掉板孔中液体，在每孔加入260yL洗涤工作液，充分洗涤4次，每次浸泡15-30s ；
[0118] (7)倒掉板孔中液体，将酶标板倒置于吸水纸上，拍干；
[0119] (8)立即在每孔中加入1 OOyL酶标记物工作液；
[0120] (9)盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板1 Os，充分混匀，室温下（25 ± 2 °C )，避光反应 20min；
[0121] (10)重复步骤(5)-(7);
[0122 ] (11)立即在每孔中加入lOOyL底物A液和底物B液的混合液(底物A液、底物B液按体 积1:1混合，必须充分混勾，混合液在5min内使用，避免使用金属盛装、搅拌试剂）；
[0123] (12)盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀，室温下(25 ± 2 °C )，避光反应15-20min；
[0124] (13)揭开盖板膜，在每孔中加入50yL终止液，轻轻振荡酶标板10s，充分混匀；
[0125] (14)终止后5min内用酶标仪在双波长450nm、630nm下读取酶标板吸光度值。
[0126] 3、结果计算或判定
[0127] (1)各标准品（或待测样品）的平均吸光度值，除以零标(浓度为0ng/ml的标准品） 吸光度值，乘以100,可以得到各标准品对应的吸光度的百分比，即百分吸光度值：
[0128]
[0129] 以合称佃^&的曰甘反俚刀纵生称，以^的汲尼忪兀浓度为横坐标绘制 标准曲线。
[0130] (3)将待测样品的百分吸光度值代入标准曲线方程，可得出待测样品对应的浓度， 再乘以相应样品的稀释倍数，方得待测原样品中泼尼松龙的实际含量。
[0131 ]三、泼尼松龙酶联免疫试剂盒检测泼尼松龙
[0132] 1、特异性检测
[0133] 泼尼松龙酶联免疫试剂盒的特异性是通过与相应的物质进行交叉反应试验来确 定的。交叉反应越小，特异性越好。
[0134] 将泼尼松龙及其它类似物(地塞米松、倍他米松、曲安息龙、氢化可的松)分别做系 列稀释，分别按照如上步骤二2进行操作，以泼尼松龙及其它类似物的系列稀释液替代其中 的"泼尼松龙标准品工作液"，制作标准曲线，并在曲线上找出各自50%抑制浓度(IC 5Q)，具 体方法如下:得到纵坐标数值等于50%对应的泼尼松龙浓度(ng/mL)，即IC5Q值。用下式计算 试剂盒对泼尼松龙和各类似物的交叉反应率。
[0135]
[0136] 结果如表1所示，从表1中可以看出，泼尼松龙酶联免疫试剂盒对各种类似物的交 叉反应率均小于1%。这说明泼尼松龙酶联免疫试剂盒对泼尼松龙具有极高的特异性，可有 效的排除其它类似物的干扰，可专门用于泼尼松龙的检测。
[0137] 表1泼尼松龙酶联免疫试剂盒的特异性
[0138]
[0139] ~2、不同样品的最低检测限测定^
'
[0140] 分别测定采用泼尼松龙酶联免疫试剂盒对鸡肉、鸭肉和原奶中泼尼松龙进行检测 时的最低检测限。具体方法如步骤二。
[0141] 结果显示，采用步骤二2(1)中的样品前处理方法处理鸡肉，测得的最低检测限可 达0.2ng/g(即每g鸡肉中含有0.2ng的泼尼松龙即可被检测到，下同）；采用步骤二2(1)中的 样品前处理方法处理鸭肉，测得的最低检测限可达〇.4ng/g;采用步骤二2(2)中的样品前处 理方法处理原奶，测得的最低检测限可达0.3ng/ml。
[0142] 3、泼尼松龙酶联免疫试剂盒板内板间误差的测定
[0143] 分别测定泼尼松龙酶联免疫试剂盒的板内误差和板间误差。具体方法如步骤二。
[0144] 结果显示，试剂盒吸光度的板内误差小于5%，板间误差小于10%。
[0145] 4、泼尼松龙酶联免疫试剂盒检测泼尼松龙的回收率测定
[0146] 测定采用泼尼松龙酶联免疫试剂盒检测泼尼松龙的回收率。具体方法如步骤二。
[0147] 结果显示，采用泼尼松龙酶联免疫试剂盒检测泼尼松龙的回收率范围为90% ± 30% 〇
[0148] 5、泼尼松龙酶联免疫试剂盒的灵敏度测定
[0149] 测定泼尼松龙酶联免疫试剂盒的灵敏度。具体方法如步骤二。
[0150] 结果显示，泼尼松龙酶联免疫试剂盒的灵敏度为O.lppb，标准曲线范围O.lppb-8. lppb(注:ppb=yg/kg) 〇
【主权项】
1. 一种化合物，其结构如式I所示：2. 制备权利要求1所述化合物的方法，包括如下步骤:将泼尼松龙与琥珀酸酐按照质量 比为500mg: 145-150mg的比例进行反应，获得所述化合物。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述反应的温度为70-80°C，时间为2-3h; 和/或 所述反应的催化剂和溶剂均为吡啶。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述包括如下步骤:将泼尼松龙溶于吡 啶后，加入琥珀酸酐，所述泼尼松龙、所述吡啶和所述琥珀酸酐的配比为500mg:5ml :145-150mg，70-80°C反应2-3h，减压蒸除所述吡啶，获得所述化合物。5. 泼尼松龙抗原，为将权利要求1所述化合物与载体蛋白偶联所得的抗原。6. 根据权利要求5所述的泼尼松龙抗原，其特征在于:所述载体蛋白为牛血清白蛋白或 卵清蛋白。7. 权利要求5或6所述的泼尼松龙抗原的制备方法，包括如下步骤:将权利要求1所述化 合物与载体蛋白通过酰胺键偶联，获得所述泼尼松龙抗原;和/或 权利要求1所述化合物与所述载体蛋白偶联的摩尔比为22.22:1。8. 根据权利要求7所述的泼尼松龙抗原的制备方法，其特征在于:所述方法包括如下步 骤： (al)将权利要求1所述化合物溶解于二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，20-25°C反应3h，得到溶液I; 所述化合物、所述二甲基甲酰胺、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、 所述N-羟基琥泊酰亚胺的配比为21.2mg: 1.5ml: 25mg: 25mg; (a2)将所述载体蛋白溶解于O. IM碳酸缓冲液中，得到溶液II; 所述载体蛋白与所述〇. IM碳酸缓冲液的配比为50-67mg: 3.5ml; (a3)将所述溶液I和所述溶液II按照条件A进行混合，混合后后于20-25Γ反应24h，得 到溶液ΠΙ; 所述条件A为:所述溶液I中的所述化合物与所述溶液II中的所述O. IM碳酸缓冲液的配 比为21 · 2mg:3· 5ml; (a4)用磷酸盐缓冲液，于4°C对所述溶液III透析3天，得到所述泼尼松龙抗原。9. 权利要求1所述化合物或权利要求5或6所述泼尼松龙抗原在如下（a)或（b)中的应 用： (a)定性或定量检测泼尼松龙； (b)制备泼尼松龙抗体。10.利用权利要求5或6所述泼尼松龙抗原制备的抗体。
【文档编号】C07J5/00GK106008637SQ201610387409
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】何义刚, 武煊, 黄诚, 秦誉, 苏丽芳, 温凯, 王照鹏, 王文珺, 于书英, 邢维维, 覃丹凤, 许舒婷
【申请人】北京维德维康生物技术有限公司, 重庆市动物疫病预防控制中心