治疗或预防急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物及其应用

治疗或预防急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物及其应用
【专利摘要】本发明提供了治疗或预防急性淋巴细胞白血病(ALL)耐药复发的药物及其应用。该药物作用于嘌呤合成途径中的酶类，通过降低次黄嘌呤的浓度降低了ALL的耐药复发。本发明还提供了化合物洛美曲沙(Lometrexol)及相关靶向GART和ATIC制剂在制备预防或治疗ALL耐药复发的药物中的应用。本发明还提供了一种评估ALL耐药复发风险的试剂盒及其使用方法，其包括裂解样本细胞的试剂和使用说明书。所述使用方法包括：(1)收集、裂解样本细胞；(2)检测次黄嘌呤、IMP、AICAR以及次黄苷的含量；(3)判断样本急性淋巴细胞白血病耐药复发的风险。本发明为ALL耐药复发的预防和治疗提供了有力的技术手段和支持。
【专利说明】
治疗或预防急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物医药领域，具体涉及治疗或预防急性白血病耐药复发的药物及其 应用。
【背景技术】
[0002] 儿童急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL)是儿童期常见 的恶性血液系统肿瘤疾病，是我国儿童因病死亡的重要原因之一。尽管在过去几十年经过 众多努力后，儿童ALL的治疗和预后已有显著改善，但仍有15%~20%的患儿会复发，一旦 复发，治愈率不足40%，复发一直是造成儿童ALL治疗失败和死亡的首要因素。复发问题日 益成为国内外儿童ALL研究的热点和焦点。
[0003] 儿童ALL治疗过程中，化疗是诱导缓解和缓解后治疗的主要手段之一。目前临床 上常用的化疗药物通常是利用核苷酸类似物破坏DNA、RNA的合成，从而导致DNA损伤诱导 肿瘤细胞凋亡。儿童ALL诱导缓解阶段，通过大剂量药物的联合化疗，有90 %的病人会得到 缓解，缓解后会通过低剂量的化疗药物来维持治疗，在维持治疗期主要是通过口服6-巯基 嘌呤（6-MP)或6-巯鸟嘌呤（6-TG)，肿瘤细胞需要耐受6-MP/6-TG的作用才会积累复发。最 近Adolfo Ferrando和William L Carroll的研究小组利用二代测序技术对耐药复发的白 血病患者的样本进行检测，发现复发的ALL细胞中的5' -核苷酸酶II (NT5C2)基因存在突 变，该基因负责编码与核苷酸及核苷酸类似药物6-巯基嘌呤出-MP)和6-巯鸟嘌呤出-TG) 的代谢相关酶，在ALL耐药复发中的突变比例约为10%。儿童ALL的耐药复发并非是一个 基因的单碱基突变可以解释的，寻找复发相关的遗传学变异仍是目前儿童ALL耐药复发研 究的重点和难点，与之相应的检测与治疗手段也因此比较缺乏。
[0004] PRPS1基因编码磷酸核糖焦磷酸合成酶，是细胞内嘌呤代谢合成途径的第一个限 速酶。PRPS1催化5-磷酸核糖和ATP的反应，生成AMP和PRPP (5-磷酸核糖-1-焦磷酸。PRPP 经过一系列酶催化反应后生成次黄嘌呤核苷酸（MP)，MP进一步转变为（d)ATP和（d)GTP 等DNA和RNA合成的原料。细胞内PRPP的含量过高或者过少，都可能引起以它为底物或者 调节物的代谢通路异常，导致疫病的发生。目前发现PRPS1的突变与疾病相关，如非综合 症型遗传性感音神经性耳聋（X _linked nonsyndromic sensorineural deafness, DFN2)、 进行性神经病性肌萎缩综合症（X_linked Charcot-Marie-Tooth disease-5, CMTX5)等。 PRPS1突变有功能获得性突变（Gain of function)，如D183H、A190V、D52H等，也有功能缺 失性突变（Reduced function)，如A87T、M115T、I290T等。但到目前为止在肿瘤中PRPS1 还没有发现突变。
[0005] 洛美曲沙（Lometrexol)，CAS 号 106400-81-1 分子式 C21H25N506,分子量 443. 45,结 构式如下所示：
[0006]
[0007] 洛美曲沙是一种叶酸诘抗剂（antifolate)，其被还原性叶酸载体与叶酸受体运输 进入细胞后可以抑制甘氨酰胺核苷酸甲酰基转移酶（GART)的活性，GART是嘌呤从头合成 途径所中的关键酶。该药物作为一种潜在的抗肿瘤药物对针对其他抗肿瘤药物产生抗药性 的一些细胞系也有效果。该药物目前在外国已经完成二期临床实验，但至今尚没有任何关 于该药物在预防和治疗急性淋巴细胞白血病的耐药复发中的报道。

【发明内容】

[0008] 本发明所解决的技术问题：针对现在儿童ALL的耐药复发检测与治疗手段的较为 缺乏的问题，本发明提供了预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物的靶标、治疗 急性白血病耐药复发的RNA药物和嘌呤从头合成途径中所有酶中的一种或多种酶的抑制 剂在制备预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物中的应用。本发明还提供了一种 评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒及其在评估儿童ALL耐药复发风险中的 应用。本发明对后续临床的急性淋巴细胞白血病复发早期的基因诊断和个体化治疗有重要 的指导意义。
[0009] 本发明技术方案之一：一种预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物的靶 标，所述靶标为嘌呤从头合成途径中所有酶中的一种或多种。
[0010] 本发明中，所述靶标较佳地为嘌呤从头合成途径中选自PRPS1、PRPS2、PPAT、PFAS、 GART、ATIC、PAICS和ADSL中的一种或多种
[0011] 本发明技术方案之二：一种siRNA，其特征在于，所述的siRNA包括正义RNA片段 与反义RNA片段，所述正义RNA片段包含权利要求1所述靶标的DNA编码的RNA分子，所述 正义RNA片段与反义RNA片段能够互补形成双链RNA分子。
[0012] 本发明技术方案之三：一种向导RNA，其针对的靶标为GART基因，其核苷酸序列如 SEQ. ID No. 41 所示。
[0013] 本发明技术方案之四：一种慢病毒载体，其特征在于，其含有如本发明技术方案之 三所述向导RNA的DNA序列和Cas9基因。
[0014] 本发明中，所述慢病毒载体的空载为本领域常规，较佳地为基于HIV-ι的慢病毒 载体，更佳地为购自addgene的lentiCRISPR载体。
[0015] 本发明技术方案之五：一种慢病毒，其由如本发明技术方案之四所述慢病毒载体 在慢病毒包装质粒的辅助下在细胞系中经病毒包装而成。
[0016] 本发明中，所述慢病毒包装质粒为本领域常规，较佳地为psPAX2与pMD2. G，所述 细胞系为本领域常规，较佳地为HEK293T细胞系。
[0017] 本发明中，所述病毒包装为本领域常规，较佳地为将所述下调GART基因表达的 慢病毒载体与所述慢病毒包装质粒一起共转到所述细胞系中，培养后收集培养基上清 浓缩得到。所述浓缩为本领域常规，较佳地为通过Amicon Ultra-15 100KD的超滤管 (Millipore)，4°C离心30分钟浓缩收集的病毒液。
[0018] 本发明技术方案之六：一种向导RNA，其针对的靶标为ATIC基因，其核苷酸序列如 SEQ. ID No. 42 所示。
[0019] 本发明技术方案之七：一种慢病毒载体，其特征在于，其含有如本发明技术方案之 六所述向导RNA的DNA序列和Cas9基因。
[0020] 本发明中，所述慢病毒载体的空载为本领域常规，较佳地为基于HIV-1的慢病毒 载体，更佳地为购自addgene的lentiCRISPR载体。
[0021] 本发明技术方案之八：一种慢病毒，其由如本发明技术方案之七所述慢病毒载体 在慢病毒包装质粒的辅助下在细胞系中经病毒包装而成。
[0022] 本发明中，所述慢病毒包装质粒为本领域常规，较佳地为psPAX2与pMD2. G，所述 细胞系为本领域常规，较佳地为HEK293T细胞系。
[0023] 本发明中，所述病毒包装为本领域常规，较佳地为将所述下调ATIC基因表达的 慢病毒载体与所述慢病毒包装质粒一起共转到所述细胞系中，培养后收集培养基上清 浓缩得到。所述浓缩为本领域常规，较佳地为通过Amicon Ultra-15 100KD的超滤管 (Millipore)，4°C离心30分钟浓缩收集的病毒液。
[0024] 本发明技术方案之四与技术方案之七中，所述慢病毒载体的Cas9基因为本领域 常规，较佳地为按照人类遗传密码子优化后的Cas9基因。
[0025] 本发明技术方案之九：一种如本发明技术方案之三和/或之六所述向导RNA、如本 发明技术方案之四和/或之七所述慢病毒载体或如本发明技术方案之五和/或之八所述慢 病毒在制备治疗或预防急性白血病耐药复发的药物中的应用。
[0026] 本发明技术方案之十：一种治疗或预防急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物组合 物，其有效物质含有选自如本发明技术方案之二所述siRNA、如本发明技术方案之三和/或 之六所述向导RNA、如本发明技术方案之四和/或之七所述慢病毒载体和如本发明技术方 案之五和/或之八所述慢病毒中的一种或多种。
[0027] 本发明技术方案之十一：一种嘌呤从头合成途径中所有酶中的一种或多种酶的抑 制剂在制备预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物中的应用。
[0028] 本发明中，所述抑制剂为本领域常规，较佳地为抑制性RNA、抑制性多肽、抗体和 小分子化合物抑制剂中的一种或多种，更佳地为抑制性RNA和小分子化合物抑制剂中的一 种或多种。所述抑制性RNA为本领域常规，较佳地为选自向导RNA、siRNA、shRNA、miRNA、 反义RNA和核酶中的一种或多种，更佳地为选自向导RNA、siRNA和shRNA中的一种或多 种，最佳地为向导RNA。所述小分子化合物抑制剂为本领域常规，较佳地为选自洛美曲沙 (Lometrexol)和力比泰（Alimta)中的一种或两种，更佳地为洛美曲沙。
[0029] 本发明中，所述"耐药复发"是指急性淋巴细胞白血病病人在恢复期对化疗药物的 治疗产生耐药性，所述化疗药物为本领域常规，较佳地为嘌呤类化疗药物，更佳地为6-巯 基嘌呤（6-MP)或6-巯鸟嘌呤（6-TG)。
[0030] 所述"预防"是指在可能存在所述耐药复发的情况下，使用后防止或降低所述耐药 复发的发生。
[0031] 所述"治疗"是指减轻所述耐药复发的程度，或者治愈所述耐药复发使急性淋巴细 胞白血病病人恢复正常，或者减缓所述耐药复发的进程。
[0032] 所述预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物包括所述抑制性RNA、抑制 性多肽、抗体和小分子化合物抑制剂中的一种或多种和一种药用载体。在所述药物中，所述 抑制性RNA、抑制性多肽、抗体和小分子化合物抑制剂中的一种或多种可以单独或和其他组 分一起作为活性成分。所述活性成分是指具有预防或治疗所述耐药复发的功能。所述的药 用载体包括药学上可接受的赋形剂、填充剂、稀释剂等。
[0033] 所述的药物中，所述抑制性RNA、抑制性多肽、抗体和小分子化合物抑制剂中的一 种或多种的含量是〇. 01~99. 99%，所述药用载体的含量是0. 01~99. 99%，所述百分比 是占药物总质量的质量百分比。
[0034] 所述的药物的剂型没有特别限制，可以是固体、半固体或液体的形式，可以是水溶 液、非水溶液或混悬液，也可以是片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。可以经口服途径 应用，也可以经静脉、肌肉、皮内或皮下注射途径给药。
[0035] 本发明中，所述预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物在治疗时的使用 剂量根据患者的年龄和病情而定，常用的每日剂量约为〇. 0001~1000mg/kg体重，较佳地 为0. 01~500mg/kg体重，更佳地为0. 1~200mg/kg体重。给药次数一天一次或数次。
[0036] 本发明中，所述预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物在治疗时还可以 与化疗药物配合使用。所述化疗药物为本领域常规，较佳地为嘌呤类化疗药物，更佳地为 6-巯基嘌呤（6-MP)或6-巯鸟嘌呤（6-TG)。
[0037] 本发明技术方案之十二：一种评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒， 其裂解样本细胞的试剂、检测次黄嘌呤（HX)、次黄嘌呤核苷酸单磷酸αΜΡ)、5 -氨基咪 唑一 4 一甲酰胺核苷酸（AICAR)和次黄苷（Inosine)中一种或多种的试剂和使用说明书； 所述使用说明书记载的内容包括以下步骤：
[0038] (a)收集、裂解样本细胞；
[0039] (b)检测步骤（a)所得的样本细胞裂解液中的选自次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单 磷酸、5 -氨基咪唑一 4 一甲酰胺核苷酸和次黄苷中一种或多种的含量；
[0040] (c)通过步骤（b)所得的次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单磷酸、5 -氨基咪唑一 4 一 甲酰胺核苷酸和次黄苷中一种或多种的浓度判断样本急性淋巴细胞白血病耐药复发的风 险。
[0041] 本发明中，所述试剂盒较佳地还包括标准品，所述标准品为本领域常规，较佳地为 为次黄嘌呤、5 -氨基咪唑一 4 一甲酰胺核苷酸和次黄苷中的一种或多种，更佳地为5 -氨 基咪唑一 4 一甲酰胺核苷酸、次黄苷和全部碳原子为13C、全部氮原子为15N的次黄嘌呤中的 一种或多种。
[0042] 本发明中，所述裂解样本细胞的试剂为本领域常规，较佳地为80%甲醇，所述百分 比为体积百分比。
[0043] 本发明中，所述检测次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单磷酸、5 -氨基咪唑一 4 一甲酰 胺核苷酸和次黄苷中的一种或多种的试剂为本领域常规，较佳地为为质谱检测试剂。
[0044] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0045] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0046] 本发明的积极进步效果在于：本发明针对现有的以嘌呤类似物为化疗药物在治疗 急性淋巴细胞白血病会出现耐药性复发的问题，提供了一种全新的作用于嘌呤合成途径中 的酶类的药物在治疗和预防急性淋巴细胞白血病耐药性复发中的应用。本发明还提供了一 类全新的检测急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒，所述试剂盒检测选自嘌呤合成 途径的代谢产物次黄嘌呤核苷酸、次黄嘌呤、AICAR和Inosine中的一种或多种，以此作为 评估ALL耐药复发风险的指标。本发明为儿童急性淋巴细胞白血病耐药复发的预防和治疗 提供了有力的技术手段和支持。
【附图说明】
[0047] 图1 :超深度测序发现PRPS1为复发特异性突变且突变比例在临床复发前迅速增 加。
[0048] 图2 :PRPS1突变蛋白结构示意图。
[0049] 图3 :pET28a载体图谱。
[0050] 图4 :纯化得到的PRPS1野生型及各突变体SDS-PAGE电泳结果。
[0051] 图5 :PCR扩增得到PRPS1野生型琼脂糖凝胶电泳结果。
[0052] 图6 :表达PRPS1野生型及各突变体的稳定Reh细胞系Western结果。
[0053] 图7 :表达PRPS1野生型及各突变体的稳定Reh细胞系对6-MP和6-TG的药物敏 感性结果。
[0054] 图8 :表达PRPS1野生型及各突变体的稳定Reh细胞系对6-MP和6-TG的细胞凋 亡结果。
[0055] 图9 :细胞内化疗药物6-MP/6-TG的代谢产物检测结果。
[0056] 图10 :表达PRPS1野生型及各突变体的PRPS1酶活性检测结果。
[0057] 图11 :ADP和⑶P对PRPS1反馈调节路径示意。
[0058] 图12 :GDP/ADP对PRPS1蛋白活性的抑制的效果。
[0059] 图13 :细胞内嘌呤代谢途径产物含量测定结果。
[0060] 图14 :靶向嘌呤合成途径的核酸药物对PRPS1S103T与A190T突变体耐药性的抑 制作用。
[0061] 图15 :外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的药物耐受。
[0062] 图16 :外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的代谢。
[0063] 图17 :次黄嘌呤竞争性抑制化疗药物6-MP的反应。
[0064] 图18 :洛美曲沙（Lometrexol)逆转PRPS1基因突变导致的6-MP药物耐受。
【具体实施方式】
[0065] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0066] 本发明通过全外显子组测序技术，对16组儿童ALL的初发、缓解和复发样本测序， 发现噪呤合成限速酶PRPSl(Phosphoribosyl pyrophosphate synthase I)基因存在多个 位点的复发特异性突变，在初发与缓解样本中均为野生型。通过进一步对144例复发样本 进行了 PRPS1测序，又发现16例复发样本中出现了 PRPS1基因的突变，在B-ALL中突变频 率为 13% (18/138)。同时德国的夏里特医学院（Charit6-Universitiiismedizin Berlin) 儿童血液肿瘤中心的Renate Kirschner-Schwarb博士的研究也证实了在德国儿童ALL中 PRPS1存在复发特异性突变，突变比例为2. 7% (6/220)。针对所有突变中最主要的四类突 变A190T、T303S、K176N和N144S，通过对一系列骨髓样本的超深度测序发现，所有的样本中 的病人在诊断期在超深度测序的分辨率范围内均未出现上述突变。此外，这些PRPS1的突 变在临床复发期之前被发现呈指数增长，如图1所示。在PRPS1野生型的ALL细胞系Reh 中过表达所述PRPS1的突变体，通过药物敏感性实验发现，复发性特异的PRPS1基因突变使 Reh对6-MP/6-TG产生了耐药，证明PRPS1基因突变在儿童ALL耐药复发过程中具有重要的 作用。
[0067] 本发明结合细胞生物学、分子生物学、代谢组学等方法，从PRPS1基因突变对自身 酶活性的影响，以及对6-MP药物代谢和嘌呤代谢网络的影响等方面系统地研究PRPS1基 因突变介导儿童ALL耐药复发的机制。研究揭示了儿童ALL -种新的耐药复发机制，提示 PRPS1突变可以驱动复发，是一个耐药复发的基因标志物，并对后续临床的复发早期的基因 诊断和个体化治疗有重要的指导意义。
[0068] 以下实施例中所涉及的D183H突变体为已报道过的PRPS1基因的功能获得性突 变体；所涉及的A87T与M115T突变体为已报道的功能缺失性突变体，它们分别作为检验实 验检测的体系是否正常的正对照与负对照。所涉及的S103T、S103N、N144S、T303S、K176N、 D183E、A190T、A190V和L191F为实验组，这些突变体通过比对人PRPS1的晶体结构可以被 分为两类，即位于PRPS1二聚体形成界面的突变位点与位于PRPS1变构位点的突变位点，如 图2所示。组内的突变体为PRPS1基因的耐药突变体。
[0069] 实施例1
[0070] 检测样本中的PRPS1基因突变：
[0071] 通过全外显子组测序技术，对16组儿童ALL的初发、缓解和复发样本及144例复 发样本进行了 PRPS1的测序。
[0072] 样品的质控：样品质量直接关系到测序结果的可靠性，通过以下三种方法保证用 于深度测序和后续验证样本的质量：①白血病初发和复发时其骨髓中的白血病细胞可占全 部有核细胞的90%以上，通过Ficoll密度梯度离心可以去除残余的正常粒细胞和有核红 细胞，从而可以得到高纯度的白血病细胞用于后续的DNA抽提和测序；②通过多色荧光抗 体组合可以区分白血病细胞和正常骨髓造血细胞，对于个别纯度较低的样品可通过流式细 胞技术分选得到高纯度（>99% )的样品；③根据微量残留病检测结果，选择残留白血病细 胞低于0. 01 %的缓解期样本用于深度测序，从而可以保证初发和复发特异性突变的可靠 性。
[0073] 样品的制备：通过QIAGEN Blood DNA kit进行白血病细胞基因组DNA的抽提， Q-bit荧光定量试剂盒进行DNA浓度测定，将高纯度基因组DNA用于后期的深度测序。
[0074] PRPS1各外显子的扩增：针对PRPS1基因组序列设计合适的引物进行PRPS1各外 显子的扩增，所述PCR体系与程序如下所示：
[0075] PCR具体体系：
[0076] 10 XK0D 缓冲液：2 μ 1
[0077] 2mM DNTP:2 μ 1
[0078] 25mM MgS04:0. 8 μ 1
[0079] 正向引物（lOpmol) :0· 5 μ 1
[0080] 反向引物（lOpmol) :0· 5 μ 1
[0081] 基因组 DNA 模板：1 μ 1 (50ng)
[0082] 无菌水：12· 7μ1
[0083] K0D-PLUS 聚合酶：0· 5 μ 1
[0084] PCR具体反应程序：
[0085]
[0086] 引物序列如表1所示，PCR产物按常规进行毛细管电泳测序和突变分析，突变分析 使用软件为 Mutation Surveyor。
[0087] 测序分析：PCR成功后将目的条带测序，将目的序列与NCBI中的PRPS1基因序列 进行比对，分析PRPS1的基因突变情况。实验结果见表2与表3。
[0088] 通过对16组儿童ALL的初发、缓解和复发样本测序，发现嘌呤合成限速酶 PRPSl(Phosphoribosyl pyrophosphate synthase I)基因存在多个位点的复发特异性突 变（见表2)，在初发与缓解样本中均为野生型。通过对144例复发样本进行了 PRPS1测序， 又发现16例复发样本中出现了 PRPS1基因的突变，突变频率为13% (18/138)。同时德国 的夏里特医学院（Charit6_ Universitdtsmedizin Berlin)儿童血液肿瘤中心的Renate Kirschner-Schwarb博士的研究也证实了本发明的结果，在德国儿童ALL中PRPS1存在复发 特异性突变，突变比例为2. 7% (6/220)(见表2)。结合临床病理学分析显示，存在PRPS1 基因突变的病人均为早期复发（P〈〇. 005)(见表3)。超深度测序发现PRPS1为复发特异性 突变且突变比例在临床复发前迅速增加。意味着PRPS1驱动了病人的耐药复发，可以作为 临床复发诊断的基因标志物以及临床复发治疗的一个重要靶点。
[0089] 表1PCR扩增外显子信息
[0090]
[0092] 表2中国和德国儿童B-ALL复发样本中的PRPS1突变
[0093]
[0095] 通过全外显子组测序技术对儿童ALL初发、缓解、复发骨髓样本进行测序， 发现了 18例病人复发样本中存在PRPS1基因突变，突变频率为13% (18/138)，如 表2所示。其中有9例复发样本中均为A190T的位点突变。通过与德国的夏里特 医学院（Charit6_ Urtiv:er.sit_|tsine:dizill Berlin)儿童血液肿瘤中心的 Renate Kirschner-Schwarb博士合作也证实了在德国儿童ALL中PRPS1存在复发特异性突变，突变 比例为 2. 7% (6/220)。
[0096] 表3中国和德国B-ALL患儿中PRPS1突变与临床特征的关系

[0100] 中值用Fisher精确检验计算得到。
[0101] 2P值用卡平方检验计算得到。
[0102] 复发时间：较早期，诊断后的18个月之内；早期，诊断后的18个月与36个月 之间；后期，初次治疗后的36个月之后。
[0103] 如表3所示，通过临床病理学资料，分析发现PRPS1突变都发生在早期复发病人中 (中国病人，P〈〇. 005,德国病人，P〈0. 001)，预示具有缓解期诊断复发意义。
[0104] 实施例2
[0105] 检测样本中的嘌呤代谢途径相关基因的突变
[0106] 通过常规的二代测序技术，在160例儿童ALL复发样本中进行了嘌呤代谢相关酶 HGPRT、頂PDH、NT5C2、PRPS2、ATIC、ADSL、GART、PFAS 的测序。
[0107] 样品的质控、制备、基因外显子的扩增同实施例1
[0108] 测序分析：PCR成功后将目的条带测序，将目的序列与NCBI中对应的基因序列进 行比对，分析基因突变情况。如果复发样本中发现了基因突变，检测同一病人的初发样本， 确定是否是复发特异性突变。实验结果见表4。
[0109] 通过测序与序列比对发现，嘌呤代谢相关酶PRPS2、ATIC、ADSL、GART、PFAS均存在 复发特异性突变。
[0110] 表4嘌呤代谢相关酶在儿童ALL复发样本中的突变
[0111]
[0113] 实施例3
[0114] PRPS1原核表达载体的构建
[0115] 1.目的基因片段的获取：根据NCBI提供的PRPS1 (gene ID:5631，NM 002764)序 列，设计野生型PRPS1的PCR引物序列，正向引物：5' cgcggcagccatATGCCGAATATCAAAATCTT CAG 3'，反向引物：5'gtggtggtgctcgagTTATAAAGGGACATGGCTGAATAGGTA3'（引物说明：含交 换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5'端部分序列用于PCR钓取目的基因）。以提取 的Reh细胞的cDNA为模板，PCR钓取PRPS1，PCR产物大小为957bp，产物序列如序列表SEQ ID No. 1 所示。
[0116] 2.原核表达载体的线性化：用限制性内切酶Ndel/Xhol处理pET28a载体，pET28a 载体图谱如图3所示。
[0117] 3.重组质粒构建：通过clontech公司的In-Fusion? PCR Cloning Kit试剂盒将 第1步的PCR产物交换入线性化病毒载体中，通过大肠杆菌T0P10扩增重组子。
[0118] 4.鉴定重组质粒：通过测序验证重组子是否构建成功。
[0119] 5. PRPS1突变原核载体的构建：以pET28a-PRPSl为质粒模板，通过Τ0Υ0Β0公司的 KOD-Plus DNA聚合酶进行环状PCR分别构建PRPS1的9个突变体：S103T、S103N、N144S、 T303S、K176N、D183E、A190T、A190V 和 L191F，PCR 引物见表 5。
[0120] PCR具体体系：
[0121] 10XK0D 缓冲液：2 μ 1
[0122] 2mM dNTP:2 μ 1
[0123] 25mM MgS04:0. 8 μ 1
[0124] 正向引物（lOpmol) :0· 5 μ 1
[0125] 反向引物（lOpmol) :0· 5 μ 1
[0126] GV303-PRPS1 质粒模板：1 μ 1 (lOng)
[0127] 无菌水：12. 7μ1
[0128] K0D-PLUS 聚合酶：0· 5 μ 1
[0129] PCR具体反应程序：
[0130]
[0131] PCR产物加入1 μ 1 Dpnl酶37°C水浴1小时消化质粒模板后，取10 μ 1加入大肠 杆菌Τ0Ρ10中扩增。转化子经测序验证突变体是否构建成功。
[0132] 实施例4
[0133] PRPS1原核蛋白的纯化
[0134] 1. pET28a_PRPSl系列质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)
[0135] ①取1 μ 1 pET28a-PRPSl系列质粒与100 μ 1 BL21 (DE3)大肠杆菌感受态细胞混 匀，冰上放置30分钟，水浴42°C，90秒，勿摇动，立即置冰上冷却2分钟，加入900 μ 1 S0C 培养基，37°C，170转/分，振荡1小时.
[0136] ②将1ml已转化的感受态细胞，涂在含50 μ g/ml卡那霉素的半固体LB琼脂培养 皿中倒置平皿培养16小时，出现菌落，拟挑出长势良好的阳性克隆做进一步实验。
[0137] 2.小量表达测试：
[0138] ①从上述pET28a_PRPSl系列转化平板中，挑取单克隆到3ml LB (含抗生素）中， 37°C，220rpm振荡培养10~12小时。
[0139] ②次日以1:100接菌，即取50μ1菌液到5ml LB(含抗生素）中，37°C，220rpm振 荡培养2~3小时至0D值达到0. 6。
[0140] ③对照取样：取2ml菌液，12000rpm离心1分钟，弃尽上清，菌体沉淀中加入 lml PBS溶液，超声破碎（200w，超声3秒，间歇5秒，20循环），加入SDS-PAGE Loading Buffer (还原，4x), 100°C，水浴10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，-20°C保存，做为 诱导前对照。
[0141] ④剩余3ml菌液中，加诱导剂IPTG至终浓度为ImM，16°C，220rpm振荡培养16小 时后，12000rpm离心1分钟，弃尽上清收菌，超声破碎处理取样，-20°C保存。
[0142] ⑤对上述样品进行SDS-PAGE电泳鉴定表达结果。
[0143] 3.PRPS1 大量表达：
[0144] @挑单克隆到10〇11111^(含5(^8/1111卡那霉素抗生素）中，37°(：，220印111振荡培 养10~12小时。
[0145] ②扩大培养：以1:100接菌，即各取上述20ml菌液接到2L LB培养基中（含终浓 度50 μ g/ml卡那霉素抗生素）中，37°C，220rpm振荡培养4~5小时至0D值达到0. 6-0. 8。
[0146] ③对照取样：取2ml菌液，12000rpm离心1分钟，弃尽上清，菌体沉淀中加入 lml PBS溶液，超声破碎（200w，超声3秒，间歇5秒，20循环），加入SDS-PAGE Loading Buffer (还原，4x), 100°C，水浴10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，-20°C保存，做为 诱导前对照。
[0147] ④其余菌液于16°C，220rpm继续振荡培养1小时后，加 IPTG至终浓度ImM，16°C， 220rpm振荡培养12小时后收菌：6000rpm、4°C离心10分钟，弃尽上清，取5ml做表达鉴定 (16°C样品），其余-80°C保存。
[0148] ⑤超声破碎分别处理上述PRPS1系列样品，进行SDS-PAGE电泳鉴定。（同小量表 达中的5)
[0149] 4. PRPS1蛋白纯化：分别取超声破碎好的菌液，通过AKTA-purifier系统的镍柱纯 化PRPS1的系列蛋白，通过SDS-PAGE电泳鉴定PRPS1系列蛋白的表达以及纯度，通过碧云 天公司的BCA蛋白定量试剂盒对PRPS1系列蛋白进行定量，得到氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的野生型PRPS1蛋白，如图4所示。
[0150] 实施例5
[0151] PRPS1突变基因真核表达载体的制备
[0152] 1.目的基因片段的获取：根据NCBI提供的PRPS1 (gene ID:5631，NM 002764)序 列，设计野生型PRPS1的PCR引物序列，正向引物：5' GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGCC GAATATCAAAATC 3 '，反向引物：5 ' TCCTTGTAGTCCATACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTAAAG3 '， 引物含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5'端部分序列用于PCR钓取目的基因。以 pET-28a-PRPSl为质粒模板，PCR钓取PRPS1，PCR产物大小为1022bp，如图5所示。
[0153] PCR 体系：
[0156] PCR反应程序：
[0157]
[0158] PCR产物加入1 μ 1 Dpnl酶37°C水浴1小时消化质粒模板后，取10 μ 1加入大肠 杆菌Τ0Ρ10中扩增。转化子经测序验证突变体是否构建成功。
[0159] 2.病毒表达载体的线性化：用限制性内切酶Agel处理GV303病毒载体（吉凯基 因）。
[0160] 3.重组质粒构建：通过clontech公司的In-Fusion? PCR Cloning Kit试剂盒按 照说明书将第1步的PCR产物交换入线性化病毒载体中，通过大肠杆菌T0P10扩增重组子 GV303-PRPS1。
[0161] 4.酶切鉴定重组质粒：经过限制性内切酶Hind III鉴定重组子是否正确，若产生 354bp的酶切片段则为阳性重组子。
[0162] 5.PRPS1突变质粒的构建：以所述GV303-PRPS1为质粒模板，通过Τ0Υ0Β0公司 的KOD-Plus DNA聚合酶进行环状PCR分别构建PRPS1的9个突变体慢病毒表达载体： GV303-PRPS1-S103T、GV303-PRPS1-S103N、GV303-PRPS卜N144S、GV303-PRPS卜T303S、 GV303-PRPS1-K176N、GV303-PRPS1-D183E、GV303-PRPS1-A190T、GV303-PRPS1-A190V 和 GV303-PRPS1-L191F，PCR 引物见表 5。
[0163] 表5 PRPS1突变体PCR引物序列表
[0164]
[0165] 实施例6
[0166] 表达PRPS1突变基因的Reh细胞的制备
[0167] 病毒制备
[0168] 1.转染前24小时将HEK293T细胞种到10cm皿中，第二天当细胞密度达到50%~ 80 %时，开始转染。
[0169] 2.配制 DNA-Opti-MEM 和 Fugene-6-Opti-MEM 混合液（一皿细胞）：
[0170] 表 6
[0171]
[0172] Promega公司的转染试剂Fugene-6和Opti-MEM混合后，静置5分钟； DNA-Opti-MEM 和 Fugene-6-Opti-MEM 混合后，静置 15 分钟；
[0173] 3.混合液静置过程中，从培养箱中取出需转染的HEK293T细胞培养皿，换新鲜的 无抗生素培养基。
[0174] 4.混合液静置15min后，加233 μ 1/皿混合液至HEK293T细胞的培养皿中，"十" 字形上下左右混匀培养液5次。
[0175] 5. 37°C，5% C02条件下培养，24小时后换液，15ml/皿加新鲜培养液，继续培养72 小时后，收集含病毒的培养液。
[0176] 6.将收集的病毒上清液加入Amicon Ultra-15 100KD的超滤管，4°C离心30分钟， 得到浓缩后的病毒液。
[0177] 7.将得到的病毒液进行梯度稀释后感染HEK293T细胞，并根据感染后绿色荧光的 细胞数量计算病毒的滴度。
[0178] 病毒感染
[0179] 1.细胞接种：将Reh细胞计数后接种到12孔板中，每孔接种3 X 105个细胞。
[0180] 2.每孔加入浓缩后的病毒上清（Μ0Ι = 10)，同时加入终浓度为8 μ g/ml的聚凝胺 (polybrene)，将细胞放入培养箱继续培养24小时后，换成新鲜的完全培养基。48小时后即 可在显微镜下观察荧光。
[0181] 3.流式分选细胞：病毒感染72小时后，将细胞通过Beckman公司的流式细胞仪 Moflo XDP分选出有绿色荧光的Reh细胞，扩大培养。
[0182] 4.收集分选后的Reh细胞，通过Western blot检测PRPS1野生型与突变 型的表达，验证稳定细胞系是否构建成功。实验结果见图6,共获得以下九个稳定细 胞系：Reh-PRPS1-S103T、Reh-PRPS1-S103N、Reh-PRPSl-N144S、Reh-PRPSl-T303S、 Reh-PRPS卜K176N、 Reh-PRPS卜D183E、 Reh-PRPS卜A190T、 Reh-PRPS卜A190V 和 Reh-PRPS1-L191F。
[0183] 实施例7
[0184] 6-MP药物敏感性实验
[0185] Reh细胞是一种人急性B淋巴细胞白血病株。通过检测经化疗药物6-MP处理后表 达不同PRPS1突变基因的Reh细胞的存活率来检测不PRPS1突变体对化疗药物6-MP的敏 感性，步骤如下：
[0186] ①细胞接种：将表达野生型与各类突变体PRPS1的Reh细胞计数后接种到96孔板 中，每孔接种1〇4个细胞，设置5个复孔；
[0187] ②细胞处理：将药物6-ΜΡ进行梯度稀释，起始浓度为100 μ g/ml，依次3倍稀释， 稀释10个梯度，加入铺好细胞的96孔板中，37°C培养72小时；
[0188] ③细胞活性测定：72小时后，每孔中加入50 μ 1 CellTiter-Glo试剂（Promega公 司），室温混匀孵育10分钟，放入酶标仪（Biotek公司）读化学发光值；
[0189] ④计算IC5Q:用Graphpad 5. 0软件计算药物IC5。值，比较组间差异。
[0190] 实验结果如图7所示。与表达空载的对照相比，实验组各PRPS1突变基因的细胞 IC5。值都有显著上升，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞在6-MP处理后存活率显著 提高，即耐药性显著增加。
[0191] 实施例8
[0192] 6-TG药物敏感性实验
[0193] 通过检测经化疗药物6-TG处理后表达不同PRPS1突变基因的Reh细胞的存活率 来检测不同PRPS1突变体对化疗药物6-TG的敏感性，步骤如下：
[0194] ①细胞接种：将表达野生型与各类突变体PRPS1的Reh细胞计数后接种到96孔板 中，每孔接种1〇 4个细胞，设置5个复孔；
[0195] ②细胞处理：将药物6-TG进行梯度稀释，起始浓度为100 μ g/ml，依次3倍稀释， 稀释10个梯度，加入铺好细胞的96孔板中，37°C培养72小时；
[0196] ③细胞活性测定：72小时后，每孔中加入50 μ 1 CellTiter-Glo试剂（Promega公 司），室温混匀孵育10分钟，放入酶标仪（Biotek公司）读化学发光值；
[0197] ④计算IC5Q:用Graphpad 5. 0软件计算药物1C 5。值，比较组间差异。
[0198] 实验结果如图7所示。与表达空载的对照相比，实验组各PRPS1突变基因的细胞 IC5。值都有显著上升，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞在6-TG处理后存活率显著 提高，即耐药性显著增加。
[0199] 实施例9
[0200] 细胞凋亡的检测实验
[0201 ] ①细胞接种：将表达野生型与各类突变体PRPS1的Reh细胞计数后接种到12孔板 中，每孔接种3 X 105个细胞，设置2个复孔；
[0202] ②细胞处理：将药物6-MP或6-TG 10 μ g/ml，加入铺好细胞的12孔板中，37°C培 养72小时；
[0203] ③细胞染色：72小时后，离心收集细胞，用PBS缓冲液冲洗细胞，加入BD公司PE标 记的Annexin-V与7-AAD染料，室温混匀孵育15分钟，离心弃上清，用PBS冲洗2遍；
[0204] ④流式检测：用BD公司的流式细胞仪Canto II上机检测细胞凋亡比例。
[0205] 实验结果如图8所示。与表达空载的对照相比，实验组各PRPS1突变基因的细胞 凋亡比例都有显著下调，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞在6-MP或6-TG处理后 存活率显著提高，即耐药性显著增加。
[0206] 实施例10
[0207] 检测细胞内化疗药物6-MP/6-TG的代谢产物。
[0208] 6-MP为前药，在发挥作用之前需要先经过体内代谢反应形成??ΜΡ与TGMP，如图9C 所示。检测步骤如下所述：
[0209] ①细胞接种：将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿，每 个皿3X10 6细胞；
[0210] ②细胞处理：每个6cm培养皿中加入10 μ Μ化疗药物6-MP处理4个小时；
[0211] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, 000g离心5分钟，弃上清，按照3Χ106细 胞/200 μ 1 80%甲醇裂解细胞；
[0212] ④ LC-MS (ΑΒΙ 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测化疗药物 6-MP 的代谢产物 ??ΜΡ, TGMP, r-MP, r-TG, r-MMP 的含量，分别用 ??ΜΡ (Jean Bioscience, cat U-1148)，TGMP(Jean Bioscience，cat#NU-l121)，r-MP(Sigma, cat#852686)，r-TG(Sigma ，cat#858412), r-MMP (Sigma, cat#M4002)做标准曲线定量。
[0213] 实验结果图9所示，对于实验组经过6-MP处理后的各突变体，6-MP的代谢产物 ??ΜΡ、TGMP和r-MP、r-TG、r-MMP在胞内的含量与对照相比都显著减少。
[0214] 实施例11
[0215] PRPS1酶活性的检测
[0216] 本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术，通过同位素标记的方法，检测了 PRPS1在细胞中的活性。【具体实施方式】如下：
[0217] ①细胞培养：将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿，每 个皿3X10 6细胞；
[0218] ②细胞处理：第二天用无葡萄糖培养基（Gibco, cat#11879-020)悬浮细胞，每个 6cm培养皿中加入 10mM 13C6-葡萄糖（Cambridge isotope laboratories, cat#CLM_1396_l) 标记5分钟；
[0219] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, OOOg离心5分钟，弃上清，按照3X 106细 胞/200 μ 1 80%甲醇，裂解细胞；
[0220] ④ LC-MS (ΑΒΙ 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测 13C5_PRPP 的含量，用PRPP(sigma，cat#P8296)做标准曲线定量。
[0221] 实验结果见图10,与表达空载的对照相比，实验组各PRPS1突变基因的催化反应 产物PRPP的浓度值都有显著上升，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞中PRPS1突变 体酶的活性都有显著地增加。
[0222] 实施例12
[0223] 测定核苷酸ADP、⑶P对PRPS1活性的反馈调节
[0224] 1.体外蛋白水平
[0225] ①建立PRPS1催化的酶学反应，如图11所示，ATP(货号A7699)、ADP(货号A2754)、 ⑶P(货号G7172)、核糖-5-磷酸（货号R7750)购自sigma公司。反应体系为：50mM Tris PH7.5,2mM 磷酸根，ImM DTT，10mM MgC12,0.5mM 核糖-5-磷酸，0.5mM ATP，PRPS1 蛋白。
[0226] ②测定⑶P/ADP对PRPS1蛋白活性的抑制：GDP/ADP起始浓度为5mM，依次做3倍 浓度梯度稀释，配制15 μ L PRPS1体外酶学反应体系加入384孔板，37°C反应30分钟。加 入10 μ 1 Promega公司的Kinase-Glo试剂（货号V3722)终止反应，室温反应15分钟，在 酶标仪中读取化学发光数值。用Graphpad 5. 0计算⑶P/ADP对PRPS1的活性抑制。
[0227] 实验结果见图 12A、B，可见⑶P/ADP 对 PRPS1 突变体 S103T、S103N、N144S、T303S、 K176N、D183E、A190T、A190V、L191F的抑制明显低于PRPS1野生型，而已知的功能缺失性突 变A87T与M115T与野生型无明显差异，即PRPS1的复发特异性突变逃逸了核苷酸⑶P/ADP 对PRPS1活性的负反馈抑制，为功能获得性突变。
[0228] 2.细胞水平
[0229] 本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术，通过同位素标记的方法，检测PRPS1 在细胞中的活性，在此基础上评估核苷酸GDP/ADP对PRPS1活性的影响。【具体实施方式】如 下：
[0230] ①细胞培养：将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿，每 个皿3X10 6细胞；
[0231] ②细胞处理：在培养皿中加入2mM ADP或0. 5mM GDP处理4小时后用无葡萄糖培养 基（Gibco, cat#11879_020)悬浮细胞，每个6cm培养皿中加入10mM 13C6-葡萄糖（Cambridge isotope laboratories, cat#CLM_1396_l)标记 5 分钟；
[0232] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, OOOg离心5分钟，弃上清，按照3X 106细 胞/200 μ 1 80%甲醇，裂解细胞；
[0233] ④ LC-MS (ΑΒΙ 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测 13C5_PRPP 的含量，用PRPP(sigma，cat#P8296)做标准曲线定量。根据PRPP的含量来判定PRPS1酶活 性的变化。
[0234] 实验结果见图12C，表达野生型实验组在加入核苷酸⑶P/ADP后PRPP的浓度有所 下降，实验组各PRPS1突变基因的催化反应产物PRPP的浓度均不受核苷酸⑶P/ADP的影 响，证明表达实验组各PRPS1突变基因的细胞中PRPS1突变体酶的活性不受核苷酸⑶P/ADP 的反馈调节。
[0235] 实施例13
[0236] 嘌呤代谢途径活性的检测
[0237] 本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术，通过同位素标记的方法，检测细胞 中嘌呤从头合成途径与补救合成途径的活性。【具体实施方式】如下：
[0238] ①细胞培养：将表达PRPS1野生型与各类突变体的Reh细胞计数铺6cm培养皿，每 个皿3X10 6细胞；
[0239] ②细胞处理：第二天用无氨基酸培养基（Gibco定制，cat#ME100031Ll)悬浮细 胞，分别用20 μ g/ml 13C2,15N-甘氨酸（sigma, cat#489522)标记从头合成途径，2 μ M 13C5， 15Ν4-次黄噪呤（Cambridge isotope laboratories, cat#489522)标记补救合成途径，分别 标记4小时与1小时；
[0240] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, 000g离心5分钟，弃上清，按照3X 106细 胞/200 μ 1 80%甲醇，裂解细胞；
[0241] ④ LC_MS(ABI 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测 13C2,15N -次黄嘌呤核苷酸αΜΡ+3)与13C5,15N4次黄嘌呤核苷酸αΜΡ+9)的含量，用 IMP(sigma，cat#I4625)做标准曲线定量。
[0242] 实验结果如图13、图9B和图18所示。实验组中表达各PRPS1基因耐药突变体的 Reh细胞内的13C2，15N-次黄嘌呤核苷酸αΜΡ+3)和 13(：5，15乂次黄嘌呤核苷酸αΜΡ+9)的浓 度和与表达空载与野生型PRPS1基因的Reh细胞相比有显著的上升，即表明嘌呤从头合成 与补救合成两条途径活性均有显著提高。
[0243] 实施例14
[0244] 检测样本中的次黄嘌呤、AICAR以及Inosine的含量
[0245] 本发明结合了细胞生物学与代谢组学的技术，通过LC-MS检测细胞中次黄嘌呤的 含量。【具体实施方式】如下：
[0246] ①细胞培养：将PRPS1的野生型和各类突变体病毒转染人Reh细胞（此处请参见 实施例4)，培养细胞；
[0247] ②细胞计数：当每个反应孔细胞达到5 X 106/5ml时，根据实验所需细胞数量进行 取样；
[0248] ③收集细胞：细胞从孔中吸出，1500rpm离心后弃去上清。PBS洗涤1次，再次离心 (500g)，吸去上清；
[0249] ④细胞裂解：按照3 X 106细胞/200 μ 1 80%甲醇，裂解细胞；
[0250] ⑤4°C 14, 000g离心10分钟，离心后将上清转移到1. 5ml ΕΡ管中；
[0251] ⑥ LC_MS(ABI 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测次 黄噪呤、AICAR以及Inosine的含量，分别用13C5， 15N4-次黄噪呤（Cambridge isotope laboratories, cat#489522)、AICAR (sigma, cat#A9978)以及 Inosine (sigma, cat#I4125) 做标准曲线绝对定量。
[0252] 实验结果如图13所示。实验组中表达各PRPS1基因耐药突变体的Reh细胞内的 次黄嘌呤、AICAR以及Inosine的浓度与表达空载和野生型PRPS1基因的对照细胞相比都 有显著地提高。
[0253] 实施例15
[0254] 靶向嘌呤合成途径的核酸药物
[0255] 针对嘌呤从头合成途径的慢病毒LV-CRISPR-ATIC与LV-CRISPR-GART的制备及其 逆转PRPS1基因突变引起的6-MP药物耐受中的应用
[0256] ① CRISPR慢病毒载体的构建：根据CRISPR设计原则与GART和ATIC的序列，分别 设计对应序列如下：CRISPR-ATIC:TGAATCTGGTCGCTTCCGGA(SEQ ID Na40)，CRISPR-GART:G CAGCCCGAGTACTTATAAT(SEQ ID Ν0· 39)，构建到 CRISPR 慢病毒载体（Addgene, cat#49535) 中，得到慢病毒载体 lentiCRISPR-ATIC 与 lentiCRISPR-GART ;
[0257] ②按已报道的方法（Shalem 0, Sanjana NE, Hartenian E, Shi X，Scott DA, Mikkelsen TS, Heckl D, Ebert BL, Root DE, Doench JG, Zhang F Science. 2014 Jan 3； 343(6166) :84-7. doi:10.1126/science.l247005.Epub 2013 Dec 12)包装获得表达针对 ATIC 与 GART 基因的 CRISPR RNA 的慢病毒 LV-CRISPR-ATIC 与 LV-CRISPR-GART ;
[0258] ③将包装得到的空载慢病毒、慢病毒LV-CRISPR-ATIC与LV-CRISPR-GART分 别感染细胞系Reh-PRPS1-S103T与Reh-PRPS1-A190T后形成稳定细胞系，感染Reh细 胞的病毒Μ0Ι = 10,加入8 μ g/ml聚凝胺，感染24个小时后换液，培养48小时候加入 0. 8 μ g/ml嘌呤霉素抗性筛选一周后形成下述稳定细胞系：对照细胞系Reh-LV-CRISPR、 Reh-S103T-CRISPR-ATIC、 Reh-S103T-CRISPR-GART、 Reh-A190T-CRISPR-ATIC 和 Reh-A190T-CRISPR-GART。
[0259] ④细胞处理：将药物6-MP进行稀释，加入铺好如步骤③所述的几种细胞系的96孔 板中，每种细胞系设置5个复孔，检测慢病毒感染细胞对6-MP的敏感性变化。具体实施方 式同实施例8 ;
[0260] 实验结果如图14所示，与空载病毒的对照细胞系Reh-LV-CRISPR相比 Reh-S103T-CRISPR-ATIC、 Reh-S103T-CRISPR-GART、 Reh-A190T-CRISPR-ATIC 和 Reh-A190T-CRISPR-GART的IC5。值都显著下降，即表明对药物6-MP的耐药性显著降低。
[0261] 实施例16
[0262] 外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的药物耐受
[0263] 通过检测外源加入嘌呤对Reh细胞的药物敏感性，步骤如下：
[0264] ①细胞接种：将表Reh细胞计数后接种到96孔板中，每孔接种104个细胞，每组设 置5个复孔；
[0265] ②细胞处理：每组分别加入10 μ M、50 μ M、100 μ Μ的次黄嘌呤（HX)或次黄嘌呤核 苷酸（ΜΡ)预处理1小时，然后将药物6-ΜΡ进行梯度稀释，起始浓度为100 μ g/ml，依次3 倍稀释，稀释10个梯度，加入铺好细胞的96孔板中，37°C培养72小时；
[0266] ③细胞活性测定：72小时后，每孔中加入50 μ 1 CellTiter-Glo试剂（Promega公 司），室温混匀孵育10分钟，放入酶标仪（Biotek公司）读化学发光值；
[0267] ④计算IC5Q:用Graphpad 5. 0软件计算药物IC5。值，比较组间差异。
[0268] 实验结果如图15所示。与嘌呤溶剂水对照相比，实验组分别加入次黄嘌呤与雌黄 嘌呤核苷酸的细胞IC 5。值都有显著上升，证明外源加入嘌呤的细胞在6-MP处理后存活率显 著提高，即耐药性显著增加。
[0269] 实施例17
[0270] 外源加入嘌呤影响Reh细胞对化疗药物6-MP的代谢
[0271] ①细胞接种：将Reh细胞计数铺6cm培养皿，每个皿3 X 106细胞；
[0272] ②细胞处理：每个6cm培养皿中加入50 μ Μ的次黄嘌呤（HX)或次黄嘌呤核苷酸 (ΜΡ)预处理1小时，后加入10 μ Μ化疗药物6-ΜΡ处理4个小时；
[0273] ③收集细胞：将细胞转移到离心管中，3, 000g离心5分钟，弃上清，按照3Χ 106细 胞/200 μ 1 80%甲醇裂解细胞；
[0274] ④ LC-MS (ΑΒΙ 5500 Qtrap coupled with Waters Acquity UPLC)检测化疗药物 6-MP 的代谢产物 ??ΜΡ, TGMP 的含量，分别用 ??ΜΡ (Jean Bioscience, cat_U-1148)，TGMP (J ean Bioscience，cat#NU_1121)做标准曲线定量。
[0275] 实验结果如图16所示，对于实验组加入外源嘌呤处理后的Reh细胞，6-MP的代谢 产物??ΜΡ和TGMP在胞内的含量与对照相比都显著减少。
[0276] 实施例18
[0277] 次黄嘌呤竞争性抑制化疗药物6-MP的反应
[0278] 化疗药物6-MP是次黄嘌呤的类似物，6-MP与次黄嘌呤都是HGPRT的底物，本发明 建立了体外酶学反应测定次黄嘌呤与6-MP与HGPRT反应的Km值，反映次黄嘌呤与6-MP与 HGPRT的亲和力。【具体实施方式】如下：
[0279] 建立体外酶学反应，如图17A所示：
[0280] 具体反应体系如下：
[0281] 表 7
[0282]

[0288] 次黄嘌呤与6-MP依次做浓度梯度稀释，37°C反应1小时，加入80%甲醇终止反应， 通过LC-MS分别检测頂P与??ΜΡ的含量。绘制反应曲线，通过Graphpad 5. 0软件分别计 算次黄嘌呤与6-MP的Km值。
[0289] 实验结果如图17B所示，次黄嘌呤与HGPRT的亲和力明显高于6-MP与HGPRT的亲 和力；且在100 μ Μ 6-MP作为反应底物时，随着加入次黄嘌呤浓度的升高，??ΜΡ的生成受到 了明显的抑制。
[0290] 实施例19
[0291] 洛美曲沙（Lometrexol)逆转PRPS1基因突变导致的6-ΜΡ药物耐受
[0292] 洛美曲沙为一种GART的小分子抑制剂。本发明检测到洛美曲沙可以逆转PRPS1 基因突变导致的6-MP药物耐受，具体步骤如下：
[0293] ①细胞接种：将Reh-PRPS1_S103T与Reh-PRPS1_A190T细胞计数后接种到96孔板 中，每孔接种1〇 4个细胞，每种细胞系设置5个复孔；
[0294] ②细胞处理：用药物5ng/ml洛美曲沙（Lometrexol)或二甲亚楓（DMS0)对照预处 理细胞1小时，对6-MP进行梯度稀释，加入铺好细胞的96孔板中，37°C培养72小时；
[0295] ③读值：72小时后，每孔中加入50 μ 1 CellTiter-Glo试剂（Promega公司），室温 混匀孵育10分钟，放入酶标仪读化学发光值；
[0296] ④计算：用Graphpad 5. 0软件计算1(：5。值，比较差异；
[0297] ⑤6-MP代谢产物浓度的检测：同实施例13 ;
[0298] ⑥次黄嘌呤胞内浓度的检测：同实施例14。
[0299] 实验结果如图18所示。与各自的对照相比，Reh-PRPS1_S103T与Reh-PRPS1_A190T 细胞用洛美曲沙（Lometrexol)处理后药物6-MP的IC5。值都显著下降，同时6-MP在 体内的代谢产物??ΜΡ与TGMP都显著上升，表明洛美曲沙使得Reh-PRPS1-S103T与 Reh-PRPS1-A190T细胞系对6-MP的耐药性显著降低。并且处理后的Reh-PRPS1-S103T与 Reh-PRPS1-A190T胞内的6-MP代谢产物??ΜΡ与TGMP都有非常显著地上升，同时次黄嘌呤 浓度有显著下降。
[0300] 实施例20
[0301] 质谱检测嘌呤代谢产物及嘌呤类似物药物代谢产物
[0302] 药物及试剂
[0303] 甲醇、乙腈（HPLC级）购自Sigma-Aldrich公司（美国），甲酸（HPLC级）购自 Merck公司（德国），实验用水由Millipore-Q制备。
[0304] 试验仪器
[0305] 液质联用仪（UPLC-MS/MS):
[0306] AB SCIEX QTRAP? 5500 (Singapore)
[0307] Waters Ultra Performance LC system(Singapore)
[0308] 1. ACQUITY? Binary Solvent Manager
[0309] 2. ACQUITY? Column Manager
[0310] 3. ACQUITY? Sample Organizer
[0311] 4. ACQUITY? Sample Manager
[0312] 采用Analyst, version 1. 5. 2数据采集和处理系统。
[0313] 其他仪器：Thermo Fisher-70°C超低温冰箱（美国）；Eppendorf 5810R高速大容 量低温离心机（德国）；IKA Vibrax VXR小型摇床（德国）；IKA Vortex振荡器（德国）； KQ5200DA超声波清洗器（昆山）等。
[0314] 1.样品分析方法
[0315] 样品处理方法
[0316] 80%甲醇收集细胞，4度12000rpm离心5分钟，转移上清至新EP管中，取20 μ 1进 行LC-MS/MS分析。
[0317] 1)标记的 PRPP, ADP and GDP:
[0318] 色谱条件
[0319] 流动相组成：流动相A :50mM碳酸氢铵（pH9. 5)
[0320] 流动相B :乙腈：水=6:1 (v/v)
[0321] 梯度洗脱：
[0322] 表 10
[0323]
[0324] 色谱柱：apHera? NH2 Polymer (2 X 150mm);
[0325] 流速：0· 6ml/min ;进样体积：20 μ 1 ;
[0326] 质谱检测条件
[0327] 采用电喷雾离子源（Turbo spray)，选择多通道反应监测（MRM)模式进行二级质 谱分析。质谱检测工作参数及离子源参数如下：
[0328] 表 11
[0331] 2)IMP(labeled IMP+3 and labeled IMP+9), HX, TIMP, TGMP, AICAR, Inosine, 6-MP ,6-TG, MMP, r-MP, r-TG and r-MMP
[0332] 色谱条件
[0333] 流动相组成：流动相A :水-0. 025%甲酸-ImM
[0334] 流动相B :甲醇-0· 025 %甲酸-ImM醋酸铵
[0335] 梯度洗脱：
[0336] 表 12
[0337]
[0338] 色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18 (4. 6 X 150mm, 5 μ m);
[0339] 流速：0· 6ml/min ;进样体积：15 μ 1 ;
[0340] 质谱检测条件
[0341] 采用电喷雾离子源（Turbo spray)，选择多通道反应监测（MRM)模式进行二级质 谱分析。质谱检测工作参数及离子源参数如下：
[0342] 表 13
[0343]
[0345] 应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关 条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种预防或治疗急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物的靶标，其特征在于，所述靶 标为嘌呤从头合成途径中所有酶中的一种或多种。2. 如权利要求1所述靶标，其特征在于，所述靶标为选自PRPS1、PRPS2、PPAT、PFAS、 GART、ATIC、PAICS和ADSL中的一种或多种。3. -种siRNA，其特征在于，所述的siRNA包括正义RNA片段与反义RNA片段，所述正 义RNA片段包含权利要求1所述靶标的DNA编码的RNA分子，所述正义RNA片段与反义RNA 片段能够互补形成双链RNA分子。4. 一种向导RNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID No. 41所示。5. -种慢病毒载体，其特征在于，其含有如权利要求4所述向导RNA的DNA序列和Cas9 基因。6. -种慢病毒，其特征在于，其由如权利要求5所述慢病毒载体在慢病毒包装质粒的 辅助下在细胞系中经病毒包装而成。7. -种向导RNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID No. 42所示。8. -种慢病毒载体，其特征在于，其含有如权利要求7所述向导RNA的DNA序列和Cas9 基因。9. 一种慢病毒，其特征在于，其由如权利要求8所述慢病毒载体在慢病毒包装质粒的 辅助下在细胞系中经病毒包装而成。10. 如权利要求5和8所述慢病毒载体，其特征在于，所述Cas9基因为按照人类遗传密 码子优化后的Cas9基因。11. 一种如权利要求4和/或7所述向导RNA、如权利要求5和/或8所述慢病毒载体 或如权利要求6和/或9所述慢病毒在制备治疗或预防急性淋巴细胞白血病耐药复发的药 物中的应用。12. -种治疗或预防急性淋巴细胞白血病耐药复发的药物组合物，其特征在于，其有效 物质含有选自如权利要求3所述siRNA、如权利要求4和/或7所述向导RNA、如权利要求 5和/或8所述慢病毒载体和如权利要求6和/或9所述慢病毒中的一种或多种。13. -种嘌呤从头合成途径中所有酶中的一种或多种酶的抑制剂在制备预防或治疗急 性淋巴细胞白血病耐药复发的药物中的应用。14. 如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为抑制性RNA、抑制性多肽、抗 体和小分子化合物抑制剂中的一种或多种。15. 如权利要求14所述应用，其特征在于，所述抑制性RNA为选自向导RNA、siRNA、 shRNA、miRNA、反义RNA和核酶中的一种或多种。16. 如权利要求14所述应用，其特征在于，所述小分子化合物抑制剂为选自洛美曲沙 和力比泰中的一种或两种。17. -种评估急性淋巴细胞白血病耐药复发风险的试剂盒，其特征在于，其包括裂解样 本细胞的试剂、检测次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单磷酸、5 -氨基咪唑一 4 一甲酰胺核苷酸 和次黄苷中一种或多种的试剂和使用说明书；所述使用说明书记载的内容包括以下步骤： (a) 收集、裂解样本细胞； (b) 检测步骤（a)所得的样本细胞裂解液中的选自次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单磷酸、 5 -氨基咪唑一 4 一甲酰胺核苷酸和次黄苷中一种或多种的含量； (C)通过步骤（b)所得的次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单磷酸、5 -氨基咪唑一 4 一甲酰 胺核苷酸和次黄苷中一种或多种的浓度判断样本急性淋巴细胞白血病耐药复发的风险。18. 如权利要求17所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品，所述标准品为 次黄嘌呤、5 -氨基咪唑一 4 一甲酰胺核苷酸和次黄苷中的一种或多种。19. 如权利要求18所述试剂盒，其特征在于，所述标准品为5 -氨基咪唑一 4 一甲酰胺 核苷酸、次黄苷和全部碳原子为13C、全部氮原子为15N的次黄嘌呤中的一种或多种。20. 如权利要求17所述试剂盒，其特征在于，所述裂解样本细胞的试剂为80%甲醇，所 述百分比为体积百分比。21. 如权利要求17所述试剂盒，其特征在于，所述检测次黄嘌呤、次黄嘌呤核苷酸单磷 酸、5 -氨基咪唑一 4 一甲酰胺核苷酸和次黄苷中的一种或多种的试剂为质谱检测试剂。
【文档编号】G01N27/62GK105985960SQ201510086558
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月17日
【发明人】李慧, 李本尚, 周斌兵
【申请人】上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心