一种逆境诱导表达Ghi10424启动子及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种逆境诱导表达Ghi10424启动子及其应用。本发明公开一种DNA分子，为如下(1)-(3)任一所示：(1)SEQ ID No.8中第1位至第2079位核苷酸所示的DNA分子；(2)SEQ ID No.11中第15位至第2073位核苷酸所示的DNA分子；(3)SEQ ID No.11所示的DNA分子。本发明公开的启动子可以应用于影响逆境下目的基因的诱导表达，尤其对培育抗复合型逆境植物新品种具有重要的理论及现实意义。
【专利说明】
一种逆境诱导表达Gh i 10424启动子及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种启动子及其应用；特别涉及一种逆境诱导表达Ghi 10424启动子 及其应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 低温、干旱、盐碱等非生物胁迫严重威胁着现代农业的发展，这些非生物胁迫导致 棉花在形态、生理、生化及分子方面产生一系列不利的改变，进而严重的影响着棉花的产量 和纤维品质。传统的育种方法很难在短期内解决棉花的抗逆问题，基因工程的方法具有不 受种间生殖隔离限制、快速聚合多个优良性状的优点。
[0003] 植物的抗逆性反应是一个非常复杂的过程，可以通过一种途径完成，也可以经过 多种途径相互协同或抑制而共同完成，其中包括植物细胞质膜对外源刺激信号的感知，通 过第二信使将信号传递给相应的胁迫应答转录因子，最终转录因子与胁迫应答的顺式作用 元件特异性结合，从而激活下游基因的表达对逆境作出应答。其中，启动子序列中包含许多 重要的顺式作用元件，对植物基因的表达水平具有重要作用，使其成为表达调控的关键环 节，无论是在基因功能研究还是在转基因技术研究中都具有十分重要的地位。因此，对启动 子结构、功能和作用机制的研究将有助于了解基因调控模式和信号传递途径，对深入了解 棉花的防卫机制、提高作物的抗逆性有重要的意义。
[0004] 随着各种转基因农作物在全球的陆续推广，启动子在转基因中的重要作用已经得 到了广泛的共识。人们需要不同类型的启动子驱动抗逆基因的表达，以提供不同转基因表 达模式的解决方案。在棉花抗逆研究领域中，人们最为关注的就是在逆境条件下可以被快 速诱导表达的启动子，从而快速启动棉花对各种非生物逆境的抗性，保证甚至提高棉花在 逆境条件下的纤维产量和品质。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供培育抗逆境植物新品种的方法。
[0006] 为了解决以上技术问题，本发明提供一种DNA分子，为如下（1)-(3)任一所示：
[0007] (1) SEQ ID No. 8中第1位至第2079位核苷酸所示的DNA分子；
[0008] (2) SEQ ID No. 11中第15位至第2073位核苷酸所示的DNA分子；
[0009] (3) SEQ ID No. 11 所示的 DNA 分子。
[0010] 为了解决以上技术问题，本发明还提供一种上调植物逆境胁迫下目的基因表达的 方法，包括如下步骤：将上述的DNA分子导入出发植物中，得到转基因植物，使得所述转基 因植物中的目的基因以上述DNA分子作为启动子启动所述目的基因的转录；与所述出发 植物相比，所述转基因植物的目的基因表达上调；
[0011] 所述目的基因为所述出发植物的内源基因或外源基因。
[0012] 上述方法中，所述逆境胁迫为非生物逆境胁迫。
[0013] 上述任一所述的方法中，所述目的基因为抗逆基因。
[0014] 上述任一所述的方法中，所述抗逆基因为具有抗非生物逆境胁迫能力的基因。
[0015] 上述任一所述的方法中，所述非生物逆境胁迫为低温胁迫、高盐胁迫、脱落酸胁 迫、干旱胁迫和/或碱胁迫。
[0016] 为了解决以上技术问题，本发明还提供上述DNA分子在制备启动子中的应用。
[0017] 为了解决以上技术问题，本发明还提供上述DNA分子或上述任一所述的方法在制 备抗逆性增强的植物中的应用。
[0018] 上述应用中，所述抗逆性为抗非生物逆境胁迫能力。
[0019] 上述应用中，所述非生物逆境胁迫为低温胁迫、高盐胁迫、脱落酸胁迫、干旱胁迫 和/或碱胁迫。
[0020] 上述任一所述的方法或应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，具体可为 十字花科植物，如拟南芥。
[0021] 本发明提供的启动子可以应用于影响逆境下目的基因的表达，尤其对培育抗逆境 植物新品种具有重要的理论及现实意义。
【附图说明】
[0022] 图1为非逆境处理条件下Ghi 10424基因在棉花苗期的不同组织器官中的表达水 平以及在逆境处理条件下Ghi 10424基因在棉花苗期整株苗中的表达水平。
[0023] 图2为转基因拟南芥的PCR鉴定。
[0024] 图3为转基因拟南芥中各不同组织器官中⑶S的表达情况。
[0025] 图4为不同逆境处理条件下启动子被诱导后基因的表达水平。
【具体实施方式】
[0026] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 棉花 C312 (Coker312) (Gossypium hirsutum L.)在文献 "Zhu Y-N, Shi D-Q, Ruan M-B, Zhang L-L, Meng Z-H, Liu J, Yang ff-C(2013)Transcriptome Analysis Reveals Crosstalk of Responsive Genes to Multiple Abiotic Stresses in Cotton (Gossypium hirsutum L.).PLoS ONE 8(11): e80218.doi :10. 1371/journal. pone. 0080218" 中公开过， 公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
[0029] pZero back/blunt为天根生化科技（北京）有限公司产品，产品目录号为 VT204-03〇
[0030] pPZPlll-GUS-NOS的序列如SEQ ID No. 12所示，公众可从中国科学院遗传与发育 生物学研究所获得。
[0031] Genome Walking Kit 为 TaKaRa 产品，产品目录号为 6108。
[0032] 拟南芥 Col-〇 生态型（Arabidopsis thaliana L.)在文献"Xin-Ran Li, Hong-Ju Li, Li Yuan, Man Liu, Dong-Qiao Shi, Jie Liu and ffei-Cai Yang. (2014)Arabidopsis DAYU/ABERRANT PEROXISOME M0RPH0L0GY9Is a Key Regulator of Peroxisome Biogenesis and Plays Critical Roles during Pollen Maturation and Germination in Planta. The Plant Cell, 26:619 - 635."中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所 获得。
[0033] 0· 1M 磷酸缓冲液（ρΗ7· 0) :lmol/LNa2HP04的水溶液取 5. 77mL，lmol/L NaH 丨04的 水溶液取4. 23ml，用水定容至100mL。
[0034] 10% SDS溶液：将90ml水稍微加热，加 lOgSDS，搅拌溶解，加入几滴浓盐酸调节pH 至7. 2,然后加水定容至100mL。
[0035] 0· 5M EDTA(pH8. 0):在 80mL 水中加入 18. 61gNa2EDTA ·2Η20,用 NaOH 调 pH 至 8. 0， 溶解后加水定容至l〇〇mL。
[0036] ⑶S酶提取液：0. 1M磷酸缓冲液（pH7. 0)取50mL，10 % SDS溶液取lmL，0. 5M EDTA(pH8.0)取 2mL，Triton X-100 取 100yL，β-巯基乙醇 100yL，用水定容至 100mL。
[0037] MUG底物（4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷）：称8. 8mg MUG，溶于10mL⑶S酶提 取液中，配制成2mmol/L的工作浓度。
[0038] 反应终止液（0. 2mol/L似20)3的水溶液）：称2. 12g Na2C03，用水定容到100mL。
[0039] 下述实施例中的ΑΒΑ为脱落酸。
[0040] 实施例1、棉花逆境诱导表达启动子的筛选及基因表达的鉴定
[0041] 一、棉花种子的处理
[0042] 将健康、饱满的棉花C312 (Coker312) (Gossypium hirsutum L.)的种子在体积百 分含量75%的乙醇水溶液中处理一分钟，然后倒出溶液，加入10%的双氧水浸泡2小时，期 间晃动若干次。倒出双氧水，用灭菌蒸馏水将种子表面的双氧水冲洗干净后，在灭菌蒸馏水 中浸泡过夜，确保整个过程在无菌条件下进行。
[0043] 二、逆境处理
[0044] 取经过步骤一处理之后露白一致的种子种植在1/2MS培养基上，置于25°C，12小 时光周期的培养箱中培养5天，使其发芽，然后分别移至相应的逆境培养基上进行逆境处 理，各种逆境处理条件如表1所示。
[0045] 表1各组处理条件
[0046]
[0047] 表1中，含200mM NaCl的1/2MS培养基（pH = 5. 8)由溶剂和溶质组成；溶质为 NaCl，溶剂为 1/2MS 培养基（pH = 5. 8)，NaCl 在含 200mM NaCl 的 1/2MS 培养基（pH = 5. 8) 中的浓度为200mM ;含有1 μΜ ΑΒΑ的1/2MS培养基（pH = 5. 8)由溶剂和溶质组成；溶质为 ABA，溶剂为 1/2MS 培养基（pH = 5. 8)，ΑΒΑ 在含有 1 μ Μ ΑΒΑ 的 1/2MS 培养基（pH = 5. 8) 中的浓度为1 μΜ ;含有200mM甘露醇的1/2MS培养基（pH = 5. 8)由溶剂和溶质组成；溶质 为甘露醇，溶剂为1/2MS培养基（pH = 5. 8)，甘露醇在含有200mM甘露醇的1/2MS培养基 (pH = 5. 8)中的浓度为200mM。
[0048] 三、采用改良的LiCl沉淀法提取表1中各处理组的幼苗（整株苗）的总RNA，DNA 酶消化后的总RNA的浓度和纯度通过NanoDrop ND-1000spectrophotometer及琼脂糖凝胶 电泳进行分析，检验合格的总RNA用于下述实验。
[0049] 四、逆境诱导表达转录因子的筛选。
[0050] 与对照组相比，分析其余各处理组的棉花幼苗在低温、高盐、ABA、干旱、碱害五种 非生物逆境条件下的转录组的表达变化（参照文献"Zhu Y-N，Shi D-Q，Ruan M-B，Zhang L-L, Meng Z-H, Liu J, Yang ff-C(2013). Transcriptome Analysis Reveals Crosstalk of Responsive Genes to Multiple Abiotic Stresses in Cotton(Gossypium hirsutum L. )· PLoS ONE 8(11) :e80218. doi: 10. 1371/journal. pone. 0080218"），获得一系列受五 种逆境共诱导表达的候选基因，结果发现，五种非生物逆境处理条件下，Ghi 10424转录本 (编码一个维生素 B1合成基因）在共同上调表达的转录本中上调表达倍数最高。因此，Ghi 10424基因成为逆境诱导表达启动子分离的关键候选基因，该基因在多逆境芯片中的上调 表达倍数结果如表2所示。
[0051] 表2 Ghi 10424在多逆境芯片中的上调表达倍数
[0052]
[0053] 表2表明，Ghi 10424可以被ABA、低温、干旱、高盐、碱高度诱导上调表达，并且诱 导表达倍数均在10倍以上。因此，选择该基因为非生物逆境诱导表达启动子分离的候选基 因。
[0054] 五、逆境诱导表达转录因子的鉴定
[0055] 利用荧光定量PCR的方法对候选基因的组织表达特异性及其逆境诱导表达特性 进行鉴定，进一步确定候选基因。
[0056] 取对照组的幼苗，分别提取其根、茎、叶的总RNA，同时提取其余各个处理组的整株 苗的总RNA，将各个总RNA反转录成cDNA。然后利用实时荧光定量PCR技术，采用SuperReal PreMix(SYBR Green)(天根生化科技（北京）有限公司产品，产品目录号为FP204)，在荧光 定量 PCR仪 C1000TM Thermal Cycler (CFX96real_time system，Bi〇-Rad，USA)上检测逆境 应答相关基因的表达情况。以棉花ACTIN1基因为内参，实验设三次重复。
[0057] 内参ACTIN1的实时荧光定量PCR引物：
[0058] GhiACTINl 上游引物：5'-GTTTATGTGCGGGAAGTTAGG-3' ；（SEQ ID No. 1)
[0059] GhiACTINl 下游引物：5'-TAATGGTGGTGATACGGTGAA-3'。（SEQ ID No. 2)
[0060] 棉花Ghi 10424基因的实时荧光定量PCR引物：
[0061] Ghi 10424 上游引物：5'-CAGCCTGAGTTTGTTCTA-3' ；（SEQ ID No. 3)
[0062] Ghi 10424 下游引物：5'-GTTCACATTCAATCCATCAA-3'。（SEQ ID No. 4)
[0063] 数据处理采用Comparative Ct的方法，Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域 值时所经历的循环数，ACt = Ct (Ghi 10424)-Ct (GhiACTINl)，以2 AGt值衡量基因转录水 平，对非逆境处理条件下（对照组）棉花不同组织器官中Ghi 10424的表达水平以及五种 逆境处理条件下（除对照组外的五个处理组）棉花Ghi 10424的表达水平进行分析比较。
[0064] 非逆境处理条件下（对照组）Ghi 10424基因在棉花苗期的不同组织器官中的表 达水平如图1A所示。
[0065] 图1A表明，抗逆应答基因 Ghi 10424在叶片中的表达量最高，茎中次之，在根中 表达量最低。
[0066] 逆境处理条件下（除对照组外的五个处理组）Ghi 10424基因在棉花苗期整株苗 中的表达水平如图1B所示。
[0067] 图1B表明，与对照组相比，在五种逆境处理条件下，Ghi 10424基因在棉花幼苗中 均呈现显著性的上调表达，其中在干旱条件下表达上调的最多。
[0068] 以上结果表明，Ghi 10424基因是一个在叶片中强势表达的非生物逆境诱导表达 基因。
[0069] 实施例2、染色体步移获取Ghi 10424基因上游的启动子序列
[0070] 一、特异性引物的设计
[0071] 设计如下三个特异性引物，设计方向为需要扩增的未知区域方向，Ghi 10424SP2 的位置应设计在Ghi 10424SP1的内侧，Ghi 10424SP3位于Ghi 10424SP2的内侧。进行染 色体步移，用于获取Ghi 10424转录区上游的启动子序列。
[0072] 染色体步移特异性引物：
[0076] 二、棉花基因组DNA的提取
[0077] 用改良的CTAB法提取未经任何处理的棉花C312 (Coker312)叶片的基因组DNA。
[0078] 三、染色体步移
[0079] 染色体步移按Genome Walking Kit操作，具体方法为：以步骤二提取的基因组 DNA作为模板，以试剂盒中的AP primer作为上游引物，Ghi 10424SP1作为下游引物，进行 第一轮PCR反应，得到第一轮PCR扩增产物；然后将第一轮PCR扩增产物稀释1000倍后作 为模板，以AP primer作为上游引物，Ghi 10424SP2作为下游引物，进行第二轮PCR反应，得 到第二轮PCR扩增产物；再将第二轮PCR扩增产物稀释1000倍后作为模板，以AP primer 作为上游引物，Ghi 10424SP3作为下游引物，进行第三轮PCR反应，得到第三轮PCR扩增产 物。
[0080] 四、取第一轮、第二轮、第三轮PCR扩增产物各20 μ L进行1 %的琼脂糖凝胶电泳， 切胶回收清晰的电泳条带，分别回收各条带与pZero back/blunt载体连接得到各重组质 粒，将各重组质粒的插入序列进行测序并拼接获得一个长度为2. 121kb的DNA片段（如SEQ ID No. 8所示），将其与棉花Ghi 10424基因已知序列进行比较，结果该2. 121kb的DNA片 段含有Ghi 10424基因 cDNA序列5'端编码区的33个核苷酸，即5'端编码区部分重叠， 表明所剩余的长度为2. 088kb的DNA片段包含Ghi 10424基因的启动子序列，将该启动子 命名为Ghi 10424启动子，序列如SEQ ID No. 8中自5'末端起第1位至第2079位核苷酸 所示。
[0081] 五、Ghi 10424启动子的序列分析
[0082] 通过启动子顺式作用元件预测网站PLACE (http: //www. dna. affrc. go. jp/ sigscan)和 PlantCARE(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/p-lantcare/ html/)相关信息学软件对获得的Ghi 10424启动子序列中的顺式作用元件进行搜索、预 测和分析，结果表明，该启动子中含有众多与己知真核生物的顺式元件的同源序列，该序 列中除了含基本的启动元件以外，还包含CAAT-box、ABRE、I-box、G_box、W_box、E-box、 CACT-box、GATA-box、WRKY、CBF等逆境诱导型启动子的作用元件。结果表明，Ghi 10424启 动子可能具有多重因子的诱导活性。
[0083] 实施例3、Ghi 10424启动子的克隆及转基因表达载体的构建
[0084] -、根据所获得的Ghi 10424的启动子序列，结合生物信息学预测的转录起始位 点及终止位点设计引物，设计并合成的引物如下：
[0085] Ghi 10424-F ：5 r -AACTGCAGGTCGACGGAACTCGAAAAGGCAACTATA-3 ' ；(SEQ ID No. 9)
[0086] (下划线所示序列5' -CTGCAG-3'为PstI酶切识别位点，5' -GTCGAC-3'为Sail 酶切识别位点。）
[0087] Ghi 10424-R：5, -GCTCTAGAGCTTGAAGACAGTGAAGTGAGA-3，。（SEQ ID No. 10)
[0088] (下划线所示序列5' -TCTAGA-3'为Xbal酶切识别位点）
[0089] 二、提取实施例1中对照组的棉花的叶片的基因组DNA，以其为模板，以Ghi 10424-F和Ghi 10424-R为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物（如SEQ ID No. 11 所示），将其与pZero back/blunt载体连接，得到重组质粒，将其命名为pZero back/ blunt-Ghi 10424promoter，将重组质粒送测序，结果正确。
[0090] SEQ ID No. 11中第15位至第2073位为Ghi 10424启动子的部分序列。
[0091] 三、PstI和Xbal双酶切SEQ ID No. 11所示的DNA分子，得到基因片段；PstI和 Xbal双酶切pPZPlll-GUS-NOS，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组 质粒，将其命名为PGhi 10424,将重组质粒PGhi 10424送测序，结果正确，表明PGhi 10424 是将pPZPlll-GUS-NOS的PstI和Xbal识别位点间的序列替换为SEQ ID No. 11所示的DNA 分子，pPZPlll-GUS-NOS的其余序列保持不变得到的重组载体。
[0092] 四、将PGhi 10424转化根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，将空载体 pPZPlll-GUS-NOS转化农杆菌GV3101，得到对照农杆菌，将重组农杆菌和对照农杆菌 分别转化拟南芥Col-Ο生态型，分别得到T0代转PGhi 10424质粒拟南芥和T0代转 pPZPlll-GUS-NOS质粒对照拟南芥。
[0093] 五、分别收获T0代转PGhi 10424质粒拟南芥和T0代转pPZPlll-GUS-NOS质粒对 照拟南芥的种子，于37°C保温箱中烘干3天后，置于4°C冰箱中春化2天。将T0代转PGhi 10424质粒拟南芥和TO代转pPZPlll-GUS-NOS质粒对照拟南芥的种子在含有50mg/mL卡那 霉素的MS筛选培养基上进行选择性培养，分别得到T1代转PGhi 10424质粒拟南芥阳性苗 和T1代转pPZPlll-GUS-NOS质粒对照拟南芥阳性苗。
[0094] 六、提取T1代转PGhi 10424质粒拟南芥阳性苗的基因组DNA，以Ghi 10424-F和 Ghi 10424-R为引物，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。并以T1代转pPZPlll-GUS-NOS质 粒对照拟南芥阳性苗的基因组DNA为模板，进行上述实验作为阴性对照，以PGhi 10424质 粒为模板，进行上述实验作为阳性对照。PCR扩增产物的电泳结果如图2所示。
[0095] 图2中，1为阴性对照的PCR扩增产物，2和3为以T1代PGhi 10424转基因拟 南芥阳性苗的基因组DNA为模板的PCR扩增产物，4为阳性对照的PCR扩增产物，Μ为DNA marker〇
[0096] 图2表明，T1代PGhi 10424转基因拟南芥阳性苗的基因组DNA和PGhi 10424质 粒的PCR扩增产物中具有目的条带，阴性对照无目的条带。进一步确定步骤五筛选得到的 T1代转PGhi 10424质粒拟南芥阳性苗为转PGhi 10424阳性，在下述实施例中均将其简称 为T1代转基因拟南芥。
[0097] 实施例4、转基因拟南芥中Ghi 10424启动子启动下的⑶S表达特性分析
[0098] -、染色：在避光条件下，加入适量⑶S染色液于2mL的离心管中，将T1代转基因 拟南芥浸到离心管的⑶S染液中，抽真空30min，然后将其置于37°C保温箱中放置6h。
[0099] 二、漂洗：依次用体积百分含量30%，50%，70%，100%的乙醇水溶液浸泡漂洗T1 代转基因拟南芥，每次浸泡30分钟。
[0100] 三、脱色：最后加入100%乙醇浸泡T1代转基因拟南芥直至完全脱色。
[0101] 四、记录：在体视显微镜下拍照记录。
[0102] 转基因拟南芥中各不同组织器官中⑶S的表达情况如图3所示。
[0103] 图3中，A为T1代转基因拟南芥幼苗的⑶S染色；B和D为T1代转基因拟南芥真 叶和子叶⑶S染色；C和E为T1代转基因拟南芥幼苗根⑶S染色；F和G为T1代转基因拟 南芥花序、花药、柱头GUS染色；Η和I为Τ1代转基因拟南芥角果和种子GUS染色。
[0104] 图3表明，⑶S在Τ1代转基因拟南芥的根、茎、叶、花丝、萼片、柱头、角果中有表达， 其中幼苗期在叶片中强势表达。
[0105] pPZPlll-GUS-NOS中不存在任何可以启动⑶S表达的原件。
[0106] 实施例5、在不同逆境处理条件下Ghi 10424启动子诱导表达后的⑶S定量分析
[0107] -、将两个T1代转基因拟南芥株系（分别命名为PGhi 10424-4和PGhi 10424-7) 分别进行如表3所示的各组处理，得到各组幼苗。
[0108] 表3逆境处理条件
[0110] 二、⑶S基因的定量检测
[0111] (一）分别在处理16h、24h和48h时，取步骤一的各组幼苗（质量为100mg左右）， 用液氮将其急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里分别磨碎各处理组的组织。如果 不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80°C冰箱。
[0112] (二）将研磨破碎的各组织分别转到EP管里，并立即加入lmL的⑶S酶提取液，充 分混勾。
[0113] (三）12000rpm，4°C离心5min，将上清转至另一 EP管中，冰上放置待用。
[0114] (四）Bradford法测定各个上清中的蛋白浓度。
[0115] (五）⑶S表达水平的定量测定
[0116] 1、取100yL各个上清，分别加入400 yL 37°C预热的⑶S酶提取液，再加入 500 μ LMUG底物，37°C温浴，得到混合反应物。在Omin、15min、30min、45min和60min分别取 混合反应物200 μ L加入到800 μ L反应终止液中，得到各最终反应物，室温避光保存。
[0117] 2、用焚光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝lOnm时测定各最 终反应物不同时间点的荧光强度值。
[0118] 3、以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。
[0119] 4、用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，分别求出2个转基因植株 (PGhi 10424-4和PGhi 10424-7)单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。结果如图4 所示。
[0120] 图4中，CK代表对照组；Cold代表低温组；NaCl代表高盐组；ΑΒΑ代表ΑΒΑ组； Mannitol代表干旱组；pH代表碱组。
[0121] 图4表明，和对照组相比较，PGhi 10424-4和PGhi 10424-7转基因株系在ABA、低 温（Cold)、高盐（NaCl)、干旱（Mannitol)、碱（pH)等逆境条件处理24小时后，⑶S基因表达 量均被诱导上调表达，并且随着处理时间的延长（如48小时）荧光信号强度迅速上升，表 明带有Ghi 10424启动子的基因受到多种逆境条件的诱导表达，与基因芯片的检测结果一 致，由此说明，Ghi 10424启动子是一个典型的多逆境诱导表达的启动子，因此，Ghi 10424 启动子的克隆对于植物对复合型逆境响应的改良及应用具有较好的前景，比如可以将其作 为抗逆基因的启动子应用于影响逆境下目的基因的表达，尤其对培育抗逆境植物新品种具 有重要的理论及现实意义。
【主权项】
1. 一种DNA分子，为如下（1) - (3)任一所不： (1) SEQ ID No. 8中第1位至第2079位核苷酸所示的DNA分子； (2) SEQ ID No. 11中第15位至第2073位核苷酸所示的DNA分子； (3) SEQ ID No. 11 所示的 DNA 分子。2. -种上调植物逆境胁迫下目的基因表达的方法，包括如下步骤：将权利要求1所述 的DNA分子导入出发植物中，得到转基因植物，使得所述转基因植物中的目的基因以权利 要求1所述的DNA分子作为启动子启动所述目的基因的转录；与所述出发植物相比，所述转 基因植物的目的基因表达上调； 所述目的基因为所述出发植物的内源基因或外源基因。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述逆境胁迫为非生物逆境胁迫。4. 根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述目的基因为抗逆基因。5. 根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于：所述抗逆基因为具有抗非生物逆 境胁迫能力的基因。6. 根据权利要求2-5任一所述的方法，其特征在于：所述非生物逆境胁迫为低温胁迫、 高盐胁迫、脱落酸胁迫、干旱胁迫和/或碱胁迫。7. 权利要求1所述的DNA分子在制备启动子中的应用。8. 权利要求1所述的DNA分子或权利要求2-6任一所述的方法在制备抗逆性增强的植 物中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗非生物逆境胁迫能力。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述非生物逆境胁迫为低温胁迫、高盐 胁迫、脱落酸胁迫、干旱胁迫和/或碱胁迫。
【文档编号】C12N15/113GK105985957SQ201510059715
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月4日
【发明人】石东乔, 朱亚娜, 司爱君, 杨维才
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所