可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢杆菌及其用图

可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢杆菌及其用图
【专利摘要】本发明提供一种可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢杆菌及其用途。本发明的液化淀粉芽孢杆菌拥有优异的去除玉米烯酮毒素的活性，并且不具有溶血性、不产生肠毒素、能耐酸性与可于胆盐环境中生长，更具有聚木糖酶、羧甲基纤维素酶、淀粉酶与蛋白酶等酵素活性。DSM3211920150817
【专利说明】
可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢杆菌及其用途
技术领域
[0001] 本发明是关于一种可去除霉菌毒素的生物性方法，尤其是关于一种可去除霉菌毒 素的液化淀粉芽孢杆菌及其用途。
【背景技术】
[0002] 饲料或是食物原料于农作物收获前后、加工过程、运输或储存期间，皆有机会遭 受霉菌感染，并产生具有毒性的二次代谢产物，即霉菌毒素（mycoxtoxin)。霉菌毒素不仅 会导致动物与人类的疾病，也会造成经济上的损失，包括谷物本身质量好坏、饲料与食品 安全的顾虑，以及对谷物市场与贸易的冲击。因此，霉菌毒素不仅会引起公共卫生问题， 也会产生经济与粮食问题。世界各地常见的霉菌毒素危害以曲菌属（Aspe rgilluS，A.)、 麦角菌属（Claviceps，C·)、镰刀菌属（Fusarium，F.)与青霉菌属（Penicillium，P.)等霉 菌所产生的毒素为主，常见者有黄曲毒素（aflatoxins)、橘曲毒素（citrinin)、赭曲毒素 (ochratoxin)、棒曲毒素（又称为散毒素、patulin、claviformin、clauacin、clavatin、 expansine、mycotoxinC 等）、麦角生物喊（ergot alkaloid)、伏马镜抱毒素（fumonisins)、 新月毒素群（trichothecenes)等，而其中新月毒素群包括T-2毒素（T-2toxin)、呕吐毒素 (deoxynivalenol、vomitoxin)与玉米稀酬毒素（又称为 F-2 毒素、zearalenone、F_2toxin) 等。
[0003] McNutt等人于1929年发现母猪喂饲发霉饲料后发生阴户及乳房肿胀的假发情 现象，同时亦有出现阴道和直肠脱出的症状。爱尔兰的McErlean氏于1952年指出猪吃 Fusarium感染过的大麦饲料，产生与McNutt所发现相同症状的现象，但均未能分离出其毒 素。其后在法国、意大利、南斯拉夫、罗马尼亚、匈牙利、丹麦和加拿大等地均曾有本病发生 的报告。Andrew和Stob于1961年正式发表长在大麦上的Fusarium roseum能产生具有动 情素性的物质即玉米烯酮（zearalenone)，且提出其分离方法与化学构造，且又指出该物质 具有促进合成代谢与动情素的作用，可作为促进牛、猪和羊生长的物质。
[0004] 容易受玉米烯酮污染的饲料或食物原料为玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦 等，其中又以玉米及小麦最常被玉米稀酮污染。玉米稀酮主要由Fusarium graminearum、 Fusarium oxysporium、 Fusarium moniliforme、 Fusarium culmorum、 Fusarium sporotrichiodes 和 Fusarium equiseti 等菌产生，其中 Fusarium graminearum 为产生此 毒素的主要菌种。玉米烯酮的结构与雌激素类似，会造成动物的繁殖障碍或死亡，并影响猪 只繁殖效率。研究报告指出饲料中含lppm的玉米烯酮会造成猪只的粗蛋白消化率与饲料 效率下降等不良影响；而含1. lppm的玉米烯酮则对猪只的生殖、肝脏、肾脏和脾脏等器官 造成损伤。人类若长期摄入玉米烯酮，会造成细胞分裂时纺锤丝不正常，导致不孕与不正常 倍体的胚胎。此外，玉米烯酮并会造成女性荷尔蒙过多，以及头晕、恶心、呕吐、生殖障碍等 现象。孩童摄入玉米烯酮则可能导致提早性成熟、男孩胸部增长与早发性乳腺炎等。此外， 玉米烯酮亦会促进人类乳癌细胞的生长。目前已有许多研究证实农作物具有极高的玉米烯 酮检出率，如北美、日本与中国玉米的玉米烯酮检出率分别为29、40与49% ;澳洲小麦的玉 米烯酮检出率为44%。
[0005] 去除食品或饲料原料中污染的霉菌毒素，以生物法最具有发展性，因为生物法具 有高效率、专一且对营养成分破坏较小等优点。生物法应用于受霉菌毒素污染的食品或 饲料原料的方式有二：第一种方式为利用微生物的生物分解作用，例如氧化葡糖酸杆菌 (Gluconobacter oxydans)可降解棒曲毒素 ；Rhodococcus erythropolis 则可降解黄曲毒 素 B-1 ;地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)可移除赭曲毒素 A、玉米烯酮与黄曲毒素 B1。第二种方式为利用微生物细胞壁吸附霉菌毒素，例如鼠李糖乳酸杆菌（Lactobacillus rhamnosus)可吸附黄曲毒素 B1。
[0006] 液化淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)多存在于土壤或发霉的农作 物，在分类学上属于芽孢杆菌科（Bacillaceae)的芽孢杆菌属（Bacillus)，为兼性厌氧的 革兰氏阳性菌，受外界压力刺激后会产生内孢子，菌体具周鞭毛而可移动，最适生长温度为 30至40°C，无法在低于15°C或高于50°C的环境生长。此菌种的标准菌株（type strain) 为 Bacillu amyloliquefaciens ATCC 23350(Fukomoto strain F)。液化淀粉芽抱杆菌已 广泛应用于工业生产淀粉酶与蛋白酶。然而，于美国国家生技信息中心（National Center for Biotechnology Information ；NCBI)网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的 PubMedline 数据库或于科学引用文献数据库（Science Citation Index Expanded ;SCIE) 中检索，目前并无任何科学论文指出液化淀粉芽孢杆菌具有分解霉菌毒素的能力。

【发明内容】

[0007] 由上述的问题，本发明提供一种可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢杆菌 DSM32119。
[0008] 本发明亦提供一种液化淀粉芽孢杆菌用于去除玉米烯酮毒素的用途，其中该液化 淀粉芽孢杆菌DSM32119。
[0009] 在本发明一实施例中，该液化淀粉芽孢杆菌DSM32119是与含有玉米烯酮毒素物 质接触有效时间，且其中该有效时间为24-36小时。在本发明的一较佳实施例中，该有效时 间为24小时，该玉米烯酮降解率为100%。
[0010] 在本发明一实施例中，该含有玉米烯酮毒素物质包含被玉米烯酮污染的玉米、小 麦、大米、大麦、小米或燕麦。
[0011] 在本发明另一实施例中，该液化淀粉芽孢杆菌DSM32119添加于食物、食材或饲料 中。
[0012] 本发明另提供一种可去除玉米烯酮毒素的组成物，包含液化淀粉芽孢杆菌 DSM32119,。
[0013] 本发明所提供的液化淀粉芽孢杆菌DSM32119,除了该菌株的分解霉菌毒素的能力 以外，并证实其具有聚木糖酶、羧甲基纤维素酶、淀粉酶与蛋白酶等酵素活性，且不具有溶 血性、不产生肠毒素等，故适合用于受玉米烯酮毒素污染的食物或饲料中，以去除玉米烯酮 的危害。
【附图说明】
[0014] 图1是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119的菌落形态；
[0015] 图2是Bacillus菌种别间亲缘树（phylogenetic tree)关系图；
[0016] 图3是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株于含有5ppm玉米烯酮的 LB培养液中的生长情形；
[0017] 图4是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株移除LB培养液中的玉米 烯酮的能力；
[0018] 图5是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株移除磷酸盐缓冲溶液中的 玉米稀酮的能力；
[0019] 图6是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株于含有5ppm玉米烯酮的 玉米粉培养基的菌数变化；
[0020] 图7是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株移除玉米粉培养基中的玉 米稀酮的能力；
[0021] 图8是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株的耐酸性；
[0022] 图9是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株耐胆盐试验；
[0023] 图10是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株对淀粉、聚木糖、羧甲基 纤维素与脱脂乳的酵素扩散活性分析；
[0024] 图11是液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株的胞外聚木糖酶、羧甲基 纤维素酶、淀粉酶与蛋白酶的酵素比活性。
[0025] 【生物材料寄存】
[0026] 莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养收集中心；地址：德国布伦瑞克 市38124因霍芬大街7B ;2015年8月17日，菌株编号DSM32119。拉丁命名Bacillus amyloliquefaciens〇
【具体实施方式】
[0027] 定义
[0028] 本发明说明书中所称「液化淀粉芽孢杆菌DSM32119」，是为寄存于莱布尼茨研究 所DSMZ-德国微生物和细胞培养收集中心，寄存编号为DSM32119的菌株，亦简称为「菌株 DSM32119」。
[0029] 本发明的分离出液化淀粉芽孢杆菌DSM32119的方法是参考Petchkongkaew et al. (2008)自发霉玉米样本中分离，此样本是取自台湾大学农业试验场。将样本以生理食 盐水（0.85%)稀释后，接种于 LB(Luria-Bertani)琼脂盘（Difco Laboratories, USA)，在 37 °C培养24小时后，挑取单一菌落接种于含有5ppm玉米烯酮的LB培养液中，再于37 °C以 250rpm转速振荡培养24小时后，测定LB培养液中的玉米烯酮残留量。在所有测试菌落中， 以本发明的液化淀粉芽孢杆菌DSM32119具有最高的玉米烯酮移除能力。另外，于本发明 实施例中使用液化淀粉芽孢杆菌的标准菌株（type strain) ATCC 23350做为对照菌株，该 菌株购自食品工业研究所生物资源保存中心（新竹）。
[0030] 为观察液化淀粉芽孢杆菌DSM32119的菌落形态，将菌株接种于LB琼脂盘 (Merck, Germany)，于37 °C培养24小时后观察菌落形态。而菌体形态的观察，是将菌 株DSM32119接种于LB培养液，于37°C培养24小时后，以5000g离心收集菌体，以革兰 氏染色套组（Sigma-Aldrich Co.，USA)进行染色后，以显微镜进行观察。菌体另以乙 醇固定后，依Waldeck et al. (2006)的方法，将菌体进行4'，6_二脒基-2-苯基吲哚 (4'，6-diamidino_2-phenylindole ;DAPI)染色，再以焚光显微镜进行观察。
[0031] 液化淀粉芽孢杆菌DSM32119的菌落形态如图1所示。其表面圆滑突起并带有黏 性。将菌体细胞内核酸以DAPI染剂染色后，以位相差及荧光显微镜观察菌体形态，可知菌 株DSM32119的菌体呈杆状，为单一细胞或由数个细胞连接成链状，具有移动性且可产生内 孢子。DSM32119菌体经革兰氏染色后于显微镜下呈紫色，为革兰氏阳性菌。上述有关菌株 DSM32119 的菌落与菌体形态特征，与 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Vos et al.，2009)所描述的液化淀粉芽孢杆菌特征相符。
[0032] 使用API 50 CHB套组（bioMerieux Inc.，USA)进行液化淀粉芽孢杆菌DSM32119 的生化分析。生化分析结果如表一所示。菌株DSM32119与液化淀粉芽孢杆菌ATCC 23350菌 株主要差异在于对D-木糖（D-xylose)、D_半乳糖（D-galactose)、D_葡萄糖（D-glucose)、 D-甘露糖（D-mannose)、半乳糖醇（dulcitol)、D_ 乳糖（D-lactose)、蜜二糖（melibiose) 与N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine)等的利用性。经由API分析软件比对此二菌 株的相似性，结果显示两菌株具有99. 8%的相似性。
[0033] 表一液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350的生化特性

[0036] 根据Weisburg et al. (1990)的方法进行菌株DSM32119的分子鉴定。以DNA萃 取套组（Qiagen Inc.，USA)抽取DSM32119菌株的基因组DNA。再利用引物对16S-27f(SEQ ID NO :1)以及 16S-1492r(SEQ ID NO :2)，进行聚合酶连锁反应（polymerase chain reaction ;PCR)扩增菌株DSM32119的16S rRNA基因序列。将PCR产物定序后，再取菌株 DSM32119的16S rRNA基因的第54至510号位置的核苷酸序列（其包含VI至V3高度变 异区）与其他菌种进行比对。序列比对的软件为BioEdit Sequence Alignment Editor program (Hall, 1999)，并以邻接法（neighbor-joining method)构筑系统关系树，以 TreeView软件绘图。
[0037] 将菌株DSM32119的16S rRNA基因序列以PCR扩增及定序后（SEQ ID NO :3)，取 其包含VI至V3高度变异区的第54至510号位置的核苷酸序列，与其他芽孢杆菌属的菌种 进行序列比对，并以邻接法（neighbpring-joining method)构筑系统关系树。结果如图2 所示，菌株DSM32119与液化淀粉芽孢杆菌ATCC 23350菌株的关系最为接近，且其序列相似 性尚达99. 9 %。
[0038] 综合上述形态观察、生化分析，以及16S rRNA基因的种源分析结果，菌株 DSM32119于分类学上应属于液化淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)。
[0039] 以下，将以本发明所分离出的液化淀粉芽孢杆菌DSM32119进行玉米烯酮去除能 力的分析。其中，玉米稀酮浓度的分析是依Urraca et al. (2005)的方法，以高效液相层析 法（high performance liquid chromatography ;HPLC)进行分析。使用 C18 逆向层析管 柱，移动相为含有15mM醋酸胺（ammonium acetate)的乙腈、甲醇与水（10 :55 :35，v/v)混 合液，流速为1.0mL/min，并以焚光检测器进行检测。激发波长（excitation wavelength) 及发射波长（emission wavelength)分别设定为452及271nm。另以含不同浓度玉米稀酮 (0.5~8ppm)的标准品，以HPLC配合荧光检测器进行检测，积分后作出检量线。样本中的 玉米烯酮浓度即可对照标准品的检量线估算。
[0040] 为确认液化淀粉芽孢杆菌的生长是否受玉米烯酮影响，将隔夜培养的菌株 DSM32119与ATCC 23350菌株分别以1 %的菌元接种量，接种于LB培养液或含有3. 5ppm玉 米烯酮的LB培养液。于37°C以250rpm转速振荡培养48小时。在培养期间，于第0、4、8、 12、24、36、48小时取样，量测菌液浑浊度（0D 600)以评估菌体生长的情形。
[0041] 将菌株DSM32119与ATCC 23350菌株分别接种于LB培养液，并于37°C振荡培养。 二菌株均于24小时后吸光值达到最高，分别为1. 90与1. 68。显示菌株DSM32119于LB 培养液中的生长性较佳。而在含有3. 5ppm玉米稀酮的LB培养液中培养24小时后，菌株 DSM32119与ATCC 23350菌株的吸光值与在不含玉米烯酮的LB培养液中相同，分别为1.81 与1.62(图3)。上述结果显示玉米烯酮对于菌株DSM32119与ATCC 23350菌株的生长并无 太大影响。
[0042] 实施例一液化淀粉芽孢杆菌菌株DSM32119在LB培养液中去除玉米烯酮的
[0043] 能力
[0044] 为评估菌株DSM32119与ATCC 23350菌株于LB培养液中去除玉米烯酮的能力， 分别将菌株DSM32119与ATCC 23350菌株以1 %的菌元接种量，接种于LB培养液或含有 3. 5ppm玉米烯酮的LB培养液。于37°C以250rpm转速振荡培养48小时。在培养期间，于 第0、4、8、12、24、36、48小时取样，并依1^抑〇 &6丨&1.(2005)的方法纯化及定量1^培养液 中残留的玉米烯酮浓度。
[0045] 结果如图4所示，菌株DSM32119于培养24小时后便将LB培养液中的玉米烯酮完 全移除，而ATCC 23350菌株则在36小时后将LB培养液中的玉米烯酮完全移除。此实验结 果证实菌株DSM32119具有较佳的玉米烯酮移除能力，且于24小时内的玉米烯酮降解率为 100%〇
[0046] 实施例二液化淀粉芽孢杆菌菌株DSM32119在磷酸盐缓冲溶液中去除玉米烯酮的 能力
[0047] 将隔夜培养的菌株DSM32119与ATCC 23350菌株分别以1%的菌元接种量，接种 于LB培养液。于37°C以250rpm转速振荡培养24小时后，以8000g离心20分钟收集菌 体。再将菌体重新悬浮于含有5ppm玉米烯酮的磷酸盐缓冲溶液中，并调整菌体浓度为1010 CFU/mL，于37°C以250rpm转速振荡培养48小时。在培养期间第0、4、8、12、24、36、48小时 取样，并依Urraca et al. (2005)的方法纯化及定量缓冲溶液中残留的玉米稀酮浓度。
[0048] 另评估菌株DSM32119与ATCC 23350菌株于磷酸盐缓冲溶液中去除玉米烯酮的能 力。将菌体以1010 CFU/mL的浓度悬浮于含有5ppm玉米烯酮的磷酸盐缓冲溶液中，再测定 培养期间磷酸盐缓冲溶液中玉米烯酮的浓度变化。结果如图5所示，当DSM32119菌体加入 含有5ppm玉米稀酮的磷酸盐缓冲溶液中（第0小时），玉米稀酮浓度即下降至3. 28ppm，由 此结果推测DSM32119菌体具有吸附玉米烯酮的能力；而培养4小时后，玉米烯酮浓度下降 至0. 36ppm，亦即有89%的玉米烯酮被移除，此结果则说明菌株DSM32119具有代谢降解玉 米烯酮的能力。在ATCC 23350菌株方面，第0小时玉米烯酮浓度仅下降至3. 80ppm ;培养 48小时后，玉米稀酮浓度下降至2. 17ppm，亦即仅有42. 19%的玉米稀酮被移除。上述结果 证实液化淀粉芽孢杆菌具有玉米烯酮移除能力，且菌株DSM32119的能力较ATCC 23350菌 株为佳。
[0049] 实施例三液化淀粉芽孢杆菌DSM32119去除玉米粉中玉米烯酮的效果
[0050] 为评估菌株DSM32119对于玉米中的玉米烯酮清除效果，将40g含有玉米烯酮的玉 米粉悬浮于160mL的蒸馏水中，以121°C、1. 5大气压灭菌15分钟后，测定其玉米烯酮浓度 为1. 56ppm。再接种隔夜培养的菌株DSM32119 (1 %菌元接种量），于37°C培养48小时，分 别于第〇、12、24、36与48小时取样，测定玉米粉中的菌数及玉米烯酮浓度。实验中使用的 玉米是购自本地超级市场，再依Paster et al. (1990)的方法制备成受玉米稀酮污染的玉 米粉
[0051] 以含有1. 56ppm玉米烯酮的玉米粉（20% ;w/w)进行菌株DSM32119的培养，培 养期间菌数如图6所示。菌株DSM32119的初始菌数为6. 661og CFU/mL，经过36小时培养 后，菌数增加至8. 231og CFU/mL。显示菌株DSM32119可在含有5ppm玉米烯酮的玉米粉培 养基中生长。分析玉米烯酮浓度，在接种菌株DSM32119的前，玉米粉培养基中的玉米烯酮 浓度为1. 56ppm，在培养36小时后，残余的玉米烯酮浓度为0· 12ppm，亦即92%的玉米烯酮 已被菌株DSM32119代谢去除（图7)。
[0052] 实施例四液化淀粉芽孢杆菌菌株DSM32119的安全性评估
[0053] 本实施例主要在评估菌株DSM32119是否具有溶血性、抗生素的敏感性，以及是否 产生肠毒素，以提供此菌株用于食材或饲料中被人体或动物摄入后的安全性。
[0054] 4-1评估菌株DSM32119的溶血性
[0055] 将菌株DSM32119接种于血液琼脂盘（Merck, Germany)，于37°C培养24小时后观 察菌落形态，确认是否发生溶血现象。
[0056] 观察液化淀粉芽孢杆菌菌株DSM32119培养于血液琼脂盘上的菌落形态，其菌落 周围并无溶血圈出现，证实菌株DSM32119并不具有溶血性。
[0057] 4-2评估菌株DSM32119的抗生素敏感性
[0058] 依Sorokulova et al. (2008)的方法，将培养隔夜的DSM32119菌液稀释成菌数 106CFU/mL，再将菌液涂布于LB琼脂盘，而后于LB琼脂盘上放置含有不同抗生素的锭片 (Mast Diagonstic, France)。于37°C培养18小时后，测量抑制圈直径，并根据Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)公告的方法判定抗生素敏感性。
[0059] 以抗生素锭片评估菌株DSM32119的抗生素敏感性，结果如表二所示，菌株 DSM32119对ampici 11 in与streptomycin不具敏感性，但亦不具有抗性，另对其余18种 抗生素皆具敏感性。在使用具有抗生素抗性基因的微生物时，其抗药性基因可能会转移至 肠道病原菌，导致病原菌产生抗药性。因此，用于生化解毒的菌株以不具有抗药性者为佳 (Salminen et al. , 1998 ；Temmerman et al.，2002)〇
[0060] 表二液化淀粉芽孢杆菌菌株DSM32119的抗生素敏感性试验。
[0061]
[0062] *数值为三重复试验并以平均值土标准偏差的形式表示。
[0063] 4-3评估菌株DSM32119是否产生肠毒素
[0064] 由于有些与菌株DSM32119同属的Bacillus菌种，如仙人掌杆菌（Bacillus cereus)和枯草杆菌（Bacillus subtilis)，可能会产生造成食品中毒的肠毒素 (Lindback et al.，2004)，且此些肠毒素基因有可能转移至其它菌株（From et al.，2005)。因此，使用Bacillus菌属的菌株进行生化解毒时，亦需检测此些菌株是否具 有肠毒素基因。仙人掌杆菌所产生的肠毒素主要有二型：其一为溶血素 （Hemolysin BL; Hbl)，由hblA、hblB、hblC与hblD等基因所编码的蛋白质HblB、Hbl L1与Hbl L2等次单元 所组成，具有溶血性、细胞毒性与影响血管通透性等特性（Beecher et al.，2009);另一型 为非溶血性肠毒素 （nonhemolytic enterotoxin ;Nhe)，是由nheA、nheB与nheC等基因所 编码的NheA、NheB与NheC等次单元所组成，主要会引起腹泻（Lund and Granum, 1996)。此 外，还有由bceT基因所编码的肠毒素 enterotoxin T(BceT)，其具有细胞毒性、改变血管通 透性并引起腹泻等症状（Agata et al.，1995)。为确认菌株DSM32119是否会产生肠毒素， 分别以PCR检测肠毒素基因及免疫套组检测肠毒素蛋白质。并另以购自食品工业研究所生 物资源保存中心（新竹）的 Bacillus amyloliquefaciens ATCC 2335〇、Bacillus cereus ATCC 11778 与 Bacillus cereus ATCC 33019 等菌株做为对照组。
[0065] 以 PCR 检测肠毒素基因方面，依 Guinebretifere et al. (2002)与 Ouoba et al. (2007)的方法，以PCR法检测溶血素基因 hblA、hblB、hblC、hblD、非溶血性肠毒素基 因 nheA、nheB与nheC，以及肠毒素基因 bceT等是否存在。hblA基因所使用的引物对为 HAF(SEQ ID N0:4)与 HAR(SEQ ID N0:5) ;hblB基因所使用的引物对为HBF(SEQ ID N0:6) 与 HBR(SEQ ID N0:7) ;hblC 基因所使用的引物对为 HCF(SEQ ID N0:8)与 HCR(SEQ ID NO: 9) ;hblD基因所使用的引物对为HDF(SEQ ID N0:10)与HDR(SEQ ID N0:11) ;nheA基因所 使用的引物对为NAF(SEQ ID N0:12)与NAR(SEQ ID N0:13) ;nheB基因所使用的引物对为 NBF(SEQ ID N0:14)与 NBR(SEQ ID N0:15) ;nheC 基因所使用的引物对为 NCF(SEQ ID NO: 16)与 NCR(SEQ ID N0:17) ;bceT 基因所使用的引物对为 BTF(SEQ ID N0:18)与 BTR(SEQ ID NO :19)。
[0066] 以免疫套组检测肠毒素方面，使用由3M公司出品的商业化芽孢杆菌肠道肠毒素 检测套组（TECRA Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual Immunoassay kit)，并依其使 用说明书检测菌株DSM32119是否产生Nhe肠毒素蛋白质。
[0067] 应用于生化解毒的菌株，为确认其安全性，故需检测是否产生肠毒素。以PCR检测 菌株 DSM32119 是否带有 NheA、NheB、NheC、HblA、HblB、HblC、HblD 或 BceT 等肠毒素的基 因。结果如表三所示，液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株皆不带有上述基因 片段，而做为对照组的仙人掌杆菌ATCC 11778菌株带有hblA、nheA、nheC，以及bceT基因； 仙人掌杆菌 ATCC 33019 菌株则带有 hblA、hblB、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC 与 bceT 等基 因。另使用芽抱杆菌肠毒素检测套组（TECRA Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual Immunoassay kit)进行Nheb肠毒素的NheA次单元的检测。结果显示液化淀粉芽孢杆菌菌 株DSM32119与ATCC 23350菌株均不产生此肠毒素蛋白质。
[0068] 表三肠毒素检测结果
[0069]
[0070] a+，PCR检测结果呈阳性；一，PCR检测结果呈阴性。
[0071] b依套组使用说明，分数为3分以下者呈阴性。
[0072] 实施例五液化淀粉芽孢杆菌菌株DSM32119的益生特性
[0073] 使用细菌进行生化解毒时，菌株随着食物进入宿主的消化系统，必须能抵抗胃部 的酸性环境与肠道中的胆盐，才得以于消化道中生存，进而分解随食物进入消化道的毒素。 而且，应用于生化解毒的菌株，伴随着饲料或食物摄入动物体内，若同时具有益生特性时， 则对宿主的肠道健康具有保护作用。依联合国世界粮农组织（FA0)的准则，益生菌必需具 有耐酸、耐胆盐，以及抗病原菌等活性。
[0074] 5-1耐酸性
[0075] 依Ehrmann et al. (2002)的方法，将隔夜培养的DSM32119或ATCC 23350菌株的 菌液lmL，于4°C以8000g离心20分钟后，去除上清液，将菌体分别悬浮于10mL的pH 2. 0 或3. 0的磷酸盐缓冲溶液中，于第0、0. 5、2与3小时取出0. lmL的菌体悬浮液，序列稀释至 适当倍数后，以涂布平板法（spread plate)接种于LB琼脂盘，于37°C培养24小时后计算 菌落数。
[0076] 以pH 2. 0或3. 0的磷酸盐缓冲溶液模拟动物胃部的酸性环境，检测菌株是否具有 耐酸性。结果如图8所示，菌株DSM32119于pH 2.0的环境下，菌数于2小时内由7.41og CFU/mL降至6. 41og CFU/mL;于pH 3. 0的环境下，菌数于2小时内则由10. 31og CFU/mL降 至8. llog CFU/mL，故证实菌株DSM32119具有良好的耐酸性。
[0077] 5-2耐胆盐性
[0078] 依Ehrmann et al. (2002)的方法，将隔夜培养的DSM32119或ATCC 23350菌株的 菌液lmL，接种于含有0. 3% oxgall的LB培养液9mL中，于37°C培养12小时，培养期间分 别于第〇、4、8与12小时测定菌液于波长600nm的吸光值。
[0079] 以含有0. 3% oxgall的LB培养液模拟肠道中的胆盐浓度，检测菌株是否可在此 环境下生长。结果如图9所示，DSM32119于含有0. 3% oxgall的LB培养液中培养12小 时后，吸光值为1. 38 ;而于不含胆盐的LB培养液中生长，吸光值为1. 5。此结果证实菌株 DSM32119具有耐胆盐性，可在含有0. 3%胆盐的LB培养液中生长。
[0080] 5-3抗病原菌活性
[0081] 试验中使用的病原菌包括 Salmonella enteri ATCC 12947、Listeria monocytogenes BCRC 14930、 Listeria monocytogenes BCRC 15338、 Listeria monocytogenes BCRC 15387、Bacillus cereus ATCC 11778、Bacillus cereus ATCC 33019 与Escherichia coli 0 157:H7等菌株，均购自食品工业发展研究所生物资源保存与研究 中心（新竹）。
[0082] 依Yilmaz et al. (2006)的方法，将隔液培养的上述病原菌的菌液分别涂布于LB 琼脂盘后，再挖出直径约6mm的孔洞。将隔夜培养的菌株DSM32119或ATCC 23350菌株的 菌液于4°C以8000g离心20分钟后，取出上清液，再以孔径0. 22 μ m的滤膜过滤除菌，于上 述孔洞中加入40 μ L过滤后的菌株DSM32119或ATCC 23350菌株的上清液，于37°C培养24 小时后测量抑制圈的直径。
[0083] 液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株的抗病原菌活性实验结果如表 四。液化淀粉芽孢杆菌DSM32119对单核球增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes) BCRC 15338菌株、仙人掌杆菌（B. cereus)ATCC 11778与ATCC 33019皆具有抑制其生长的 特性；而液化淀粉芽孢杆菌ATCC 23350菌株则对试验中所使用的病原菌皆无抑制作用。
[0084] 表四液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350菌株的抗病原菌活性
[0085]
[0086] *NI:未有抑制效果。
[0087] *数值为三重复试验并以平均值土标准偏差的形式表示。
[0088] 实施例六液化淀粉芽孢杆菌DSM32119的聚木糖酶、羧甲基纤维素酶、淀粉酶与蛋 白酶活性
[0089] 用于生化解毒的菌株，若具有产生聚木糖酶、羧甲基纤维素酶与蛋白酶等酵素的 能力，则在降解毒素的同时，亦可水解纤维与蛋白质，提高食物或饲料的消化吸收。
[0090] 将隔夜培养的菌株DSM32119或ATCC 23350菌株，以1 %的接种量接种至10mL的 LB培养液，于37°C培养16小时后，以5000g于4°C下离心20分钟，收集上清液，以酵素扩散 法与酵素比活性测定法分析聚木糖酶、羧甲基纤维素酶与蛋白酶等酵素活性。
[0091 ] 6-1酵素扩散法分析酵素活性
[0092] 依Waldeck et al. (2006)的方法，将15mL含有1%的聚木糖、羧甲基纤维素或脱 脂奶粉的洋菜胶（1. 5% )倒入培养皿中，凝固后于洋菜胶挖出直径约6mm的圆形孔洞。再 将隔夜培养的菌株DSM32119或ATCC 23350菌株，于4°C以5000g离心10分钟后，取40 μ L 上清液，置入上述洋菜胶的孔洞中，于37°C培养隔夜16小时后进行观察。于聚木糖或羧甲 基纤维素的洋菜胶表面分别加入10mL的刚果红溶液（0. 75% )，静置15分钟以进行染色。 染色后将刚果红溶液移除，观察孔洞周围是否出现浅色透明环，若有透明环出现则表示加 入的菌液具有聚木糖酶或羧甲基纤维素酶活性。而含有脱脂乳粉的洋菜胶则可直接观察孔 洞周围是否有透明环产生，若有则表示加入的菌液具有蛋白酶活性。
[0093] 菌株对受质作用后的结果如图10所示，透明环的产生是因为菌株将胶体中的受 质分解，表示菌株对此受质具有酵素活性；而表五为液化淀粉芽孢杆菌DSM32119与ATCC 23350于酵素扩散试验中的结果，结果显示两者对羧甲基纤维素、脱脂乳粉、聚木糖与淀粉 皆具有酵素活性。
[0094] 表五酵素扩散分析结果
[0097] *所有数值为三重复试验并以平均值土标准偏差的形式表示。
[0098] 6-2酵素比活性测定
[0099] 聚木糖酶、羧甲基纤维素酶与蛋白酶等酵素活性，是采用Megazyme公司 (Wicklow, Ireland)的套组进行检测。受质分别为偶氮聚木糖（azo-xylan)、偶氮羧甲基纤 维素（azo-CMC)，以及偶氮酪蛋白（azo-casein)，并依厂商使用说明书进行检测。将菌株 DSM32119或ATCC 23350菌株的隔夜培养菌液分别于4°C以8000g离心10分钟，将上清液 以磷酸钠缓冲溶液（l〇〇mM、pH 7. 0)稀释10倍后，再进行酵素活性的检测。每一单位的酵 素活性定义为经lmL酵素液作用后每分钟所释出的1 μ mol染剂。
[0100] 参考Megazyme公司的测定方法进行菌株对聚木糖、羧甲基纤维素、淀粉与脱脂乳 粉等受质的酵素活性并进行定量；实验结果如图11，菌株DSM32119对聚木糖、羧甲基纤维 素、淀粉与脱脂乳粉的酵素活性分别为2. 18±0. 01U/mL、3. 39±0. 02U/mL、2. 07±0. 00U/mL 与 3· 13±0· 06U/mL，ATCC 23350 则为 9· 71±0· 01U/mL、3. 60±0· 01U/mL、72. 84±0· 02U/mL 与1. 02±0. 06U/mL。故本发明的液化淀粉芽孢杆菌DSM32119不仅具有移除玉米烯酮的能 力，更具有产生淀粉酶、聚木糖酶、羧甲基纤维素酶与蛋白酶的能力。
[0101] 经由上述实施例可知，本发明由发霉玉米中分离出一株液化淀粉芽孢杆菌 DSM32119。经由形态、生化鉴定，以及16S rRNA基因定序结果，证实菌株DSM32119于分类 学上确实属于液化淀粉芽孢杆菌。液化淀粉芽孢杆菌菌株DSM32119不仅具有极佳的玉米 烯酮解毒能力，不具溶血性、不产生肠毒素、可于pH 2或3的酸性环境中存活、可于含有胆 盐的培养基中生长，且具有聚木糖酶、羧甲基纤维素酶、淀粉酶与蛋白酶等酵素活性。因此， 液化淀粉芽孢杆菌DSM32119适合用于受玉米烯酮毒素污染的食物或饲料中，以去除玉米 烯酮的危害。
【主权项】
1. 一种可去除玉米烯酮毒素的液化淀粉芽孢杆菌DSM32119。2. -种液化淀粉芽孢杆菌用于去除玉米烯酮毒素的用途，其中该液化淀粉芽孢杆菌 DSM32119。3. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述液化淀粉芽孢杆菌DSM32119是与含 有玉米烯酮毒素物质接触有效时间。4. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述有效时间为24-36小时。5. 根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述有效时间为24小时，该玉米烯酮降解 率为100%。6. 根据权利要求所述的用途，其特征在于，所述含有玉米烯酮毒素物质包含被玉米烯 酮污染的玉米、小麦、大米、大麦、小米或燕麦。7. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述液化淀粉芽孢杆菌DSM32119添加于 食物或食材中。8. 根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述液化淀粉芽孢杆菌DSM32119系添加 于饲料中。9. 一种可去除玉米烯酮毒素的组成物，包含液化淀粉芽孢杆菌DSM32119。
【文档编号】A23L5/20GK105985921SQ201510847191
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年11月27日
【发明人】刘嚞睿, 郑光成, 李恩
【申请人】刘嚞睿