调整gre3基因表达活性的酿酒酵母重组菌株及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种调整酿酒酵母1308-P中的GRE3基因表达活性的基因工程菌株。本发明发现酿酒酵母中GRE3基因可导致木糖代谢时产生副产物木糖醇，并与发酵木糖过程中的耐受性相关。本发明还发现，虽然GRE3基因是负调控基因，但不应完全敲除。本发明经实验证实，通过敲除1308-P中的一个GRE3基因得到的工程菌株能够提高木糖发酵乙醇的效率，降低副产物木糖醇的生成。而且，该改造菌还具有不影响出发菌原有的葡萄糖利用率，同时抑制物耐受力高等优点。
【专利说明】
调整GRE3基因表达活性的酿酒酵母重组菌株及其应用
技术领域：
[0001] 本发明涉及一种新的代谢木糖的基因工程菌株，具体涉及调整酿酒酵母1308-P 中的GRE3基因表达活性的得到的基因工程菌株。
【背景技术】：
[0002] 大多数工业酿酒酵母菌株不能代谢木糖，原因是其自身缺乏木糖到木酮糖的代谢 途径。
[0003] 酿酒酵母重组菌株1308-P是转入了 Piromyces sp. njaul菌株XI基因的工程菌 株，将自然界中木糖转化的代谢途径引入酿酒酵母并得到活性表达，提高了它们在厌氧条 件下发酵葡萄糖和木糖产乙醇的能力。
[0004] 但是，目前所获得的酿酒酵母重组菌株1308-P尚不能达到工业化生产要求，还有 相当大的差距。该菌有两个主要缺点，一是在发酵过程中生成较多副产物木糖醇，降低了木 糖发酵乙醇的效率；二是该菌在代谢木糖时，会受到木质纤维素水解物中所含的糠醛和羟 甲基糠醛等的明显抑制作用，导致乙醇发酵难以达到最优效果。
[0005] 因此，如果能够通过进行酿酒酵母1308-P的基因改造，得到新的基因工程菌株， 能够提尚对抑制物的耐受力，尚效共发酵匍甸糖和木糖，并且在代谢木糖时降低副广物木 糖醇生成，将会推进和加快秸杆乙醇生产技术的实用化进程，具有重要的经济和社会效益。
【发明内容】
：
[0006] 本发明的目的在于对酿酒酵母1308-P进行基因改造，得到一种新的能够高效共 发酵葡萄糖和木糖的基因工程菌株，并且能够降低木糖醇生成，提高其对抑制物的耐受力。
[0007] 本发明的研究工作得到了如下发现：
[0008] 1、发现酿酒酵母中GRE3基因是负调控基因，导致木糖转化为乙醇的效率下降
[0009] 本发明人发现，GRE3基因可导致木糖代谢时产生副产物木糖醇
[0010] 发明人对转入了 Piromyces sp. njaul菌株XI基因的工程酵母菌株1308-P，以秸 杆糖化液进行培养，发现有明显的木糖醇生成，从而导致木糖转化为乙醇的效率下降。初步 判断是通过GRE3基因（GeneID :856504)编码的内源性醛糖还原酶将木糖还原为木糖醇；
[0011] 2、发现虽然GRE3基因是负调控基因，但不应完全敲除，只能合理调整GRE3基因的 表达活性
[0012] 工程酵母菌株1308-P是双倍体，有两条等位GRE3基因。
[0013] GRE3基因编码的内源性醛糖还原酶将木糖还原为木糖醇，会降低木糖发酵乙醇的 产率。因此，理论上来讲，敲除GRE3基因可以提高表达木糖异构酶酿酒酵母的木糖利用率。
[0014] 现有技术中，对具有负调控作用的两条GRE3等位基因的改造方法通常是：要么完 全保留，要么完全敲除掉，使之完全丧失功能。
[0015] 然而，由GRE3基因编码的醛糖还原酶属于应激蛋白，完全敲除有可能影响酵母对 抑制物的耐受能力。合理调整GRE3基因的表达活性可以在不影响抑制物耐受力的前提下， 有效降低副产物木糖醇的生成进而提高木糖转化为乙醇的效率。
[0016] 本发明的解决问题的技术方案：
[0017] 本发明对1308-P中GRE3基因表达活性进行了合理调整，即，利用双倍体的酵母的 两条等位基因，敲除其中一条，使GRE3基因的表达活性下降，但又不完全丧失功能。通过 此，证实了本发明的上述发现。
[0018] 具体如下：
[0019] 1)以质粒pUG6为模板，用所设计的引物克隆两端包含loxp位点的Kanr基因，其 大小为1815bp，胶回收PCR敲除组件片段，连接T载体，测序；
[0020] 2)用GRE3基因的敲除组件化转酿酒酵母1308-P，筛选转进G418抗性片段的菌 株；
[0021 ] 3)化转pSH65到以上所得的G418抗性菌株中，用YPG液体培养基诱导表达pSH65 质粒上Cre基因表达将酿酒酵母基因组上Kanr基因切除，最终得到敲除一个GRE3基因的 工程菌 1308-GRE3A 1。
[0022] GRE3 序列如 SEQ ID NO: 1 所示（Gene ID:856504)
[0023] 敲除GRE3基因的GRE3A序列如SEQ ID N0:2所示。
[0024] 本发明的有益结果：
[0025] 本发明通过敲除一个GRE3基因得到的工程菌株1308-P-GRE3A 1达到了本发明的 目的。
[0026] 通过与对照菌株（即，敲除二个GRE3基因得到的工程菌株1308-P-GRE3 Δ 2,以及 出发菌株1308-P)所进行的生理生化的测定比较，1308-P-GRE3 Δ 1具有如下有益效果：
[0027] 1)提高了生长速率和对抑制物的耐受力
[0028] 在抑制物糠醛存在的情况下，工程菌株1308-P-GRE3A1生长速率比出发菌株 1308-P约有提升（2. 4% )，说明抑制物耐受力没有下降；
[0029] 而1308-P-GRE3A2比出发菌株1308-P生长速率下降了 9. 21%，明显受到抑制物 糠醛的抑制，抑制物耐受力下降明显。说明仅敲除一个GRE3基因比完全敲除GRE3基因效 果好。
[0030] 2)不影响出发菌原有的葡萄糖的利用率
[0031] 1308-P-GRE3A 1培养基的葡萄糖均几乎完全利用完；表明该工程菌株不影响葡 萄糖的利用。
[0032] 3)木糖利用率高，生成副产物木糖醇少
[0033] 经过48h培养，出发菌株1308-P木糖利用率达到41. 2%，副产物木糖醇最高达到 5. 65g/L ；
[0034] 而工程菌株1308-P-GRE3 Δ 1木糖利用率达到43. 7%，副产物木糖醇相比出发菌 株降低了 75. 1% ;
[0035] 虽然1308-P-GRE3 Δ 2副产物木糖醇和1308-P-GRE3 Δ 1相当，但木糖利用率低的 多，仅为35. 4%。
[0036] 4)乙醇产量均比出发菌株和完全敲除GRE3基因的菌株高
[0037] 在48h，工程菌株1308-P-GRE3 Δ 1比出发菌株1308-P提高了 7. 46 %，比 1308-P-GRE3A2 也提高了 8. 11%。
[0038] 此外，本发明通过以上实验首次发现并证明：
[0039] 酿酒酵母中GRE3基因是影响其抑制物耐受力的因素之一，合理调整GRE3基因的 表达活性可以在不影响抑制物耐受力的前提下，有效降低副产物木糖醇的生成进而提高木 糖转化为乙醇的效率。
【附图说明】：
[0040] 图1是实验菌株1308-P-GRE3 Δ 1、对照菌株1308-P-GRE3 Δ 2、对照菌株1308-P三 个菌株的生长速率比较；横坐标为培养时间，纵坐标为菌体密度0D600值；
[0041] 图2-4是发酵实验，其中，图2是1308-P发酵实验；图3是1308-P-GRE3 Δ 1发酵 实验；图4是1308-P-GRE3 Δ 2发酵实验；
[0042] 具体为：1308-P-GRE3 Δ 1、1308-P-GRE3 Δ 2与1308-P葡萄糖利用、木糖利用、乙醇 生成和木糖醇生成的比较；横坐标为培养时间，纵坐标为浓度。
【具体实施方式】：
[0043] 以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本 发明的实质内容加以限制。
[0044] 以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》 (第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0045] 试验材料和试剂
[0046] 1、菌株及载体：质粒pUG6、pSH65均购自Invitrogen公司，酿酒酵母工业菌株 1308 (双倍体酵母）由所在实验室保存。
[0047] 2、酶类及其它生化试剂：糠醛、连接酶购自NEB公司，其它试剂如未作具体说明都 为国产试剂（均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0048] 3、培养基：
[0049] (1)大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0· 5%酵母提取物、1% NaCl，ρΗ7· 0)。
[0050] (2)酵母培养基YPD (1 %酵母提取物、2 %蛋白胨、2 %葡萄糖，平板添加2 %琼脂）
[0051] (3)选择培养基SC(0. 67% ΥΝΒ、2%葡萄糖，平板添加2%琼脂）
[0052] (4)含有抑制物的酵母发酵培养基（0.67% YNBU4%葡萄糖，7%木糖，0.2%糠 醛）
[0053] 实施例1酿酒酵母1308-Ρ中GRE3基因的敲除
[0054] 根据已知的GRE3基因和质粒pUG6的核甘酸序列，设计引物：设计方向为需要扩 增的方向，引物长度为63-64bp，退火温度在60-65 °C。并将它们命名为敲5 ' GRE3: : hphMX、 3' GRE3: :hphMX (下游特异性引物）见表1。
[0055] 表1GRE3基因敲除及验证引物
[0056]
[0057] 通过PCR得到敲除组件（1815bp)，扩增得到产物胶回收后送华大基因测序，通过 比对分析测序序列，证实获得的序列与理论设计引物序列一致。
[0058] 实施例2敲除组件化转酿酒酵母1308-P
[0059] ⑴活化酿酒酵母1308-P，用灭菌去离子水清洗两遍后加入1ml灭菌去离子水取 100 y 1备用；
[0060] ⑵鲑鱼精50 μ 1放入沸水中煮lOmin备用；
[0061] (3) PEG3350取240 μ 1及LiAC36 μ 1加入以上酿酒酵母与鲑鱼精和敲除组件涡悬 混匀后放入30°C水浴中30min，再入于42°C 45min ;
[0062] ⑷加入lmlYH)培养基于30°C 120rpm培养lh ;
[0063] (5)取20 μ 1涂于含有G418抗生素的YPD平板上48h左右观察。
[0064] 实施例3以上工程菌株化转pSH65及Kanr基因的切除（敲除组件中抗性筛选标 记的去除）
[0065] ⑴活化转进敲除组件的酿酒酵母1308-P，用灭菌去离子水清洗两遍后加入1ml灭 菌去离子水取100 μ 1备用；
[0066] ⑵鲑鱼精50 μ 1放入沸水中煮lOmin备用；
[0067] (3) PEG3350取240 μ 1及LiAC36 μ 1加入以上酿酒酵母与鲑鱼精和敲除组件涡悬 混匀后放入30°C水浴中30min，再入于42°C 45min ;
[0068] ⑷加入lmlYH)培养基于30°C 120rpm培养lh ;
[0069] (5娵20 μ 1涂于含有抗生素腐草霉素的YPD平板上48h左右观察。
[0070] (6)将转进PSH65的菌株用YPG培养基（葡萄糖换成半乳糖）培养4-7h，诱导质粒 PSH65上ere基因表达，切除基因组上Kanr基因，去除抗性；
[0071] (7)用YTO培养基传代丢失酿酒酵母中质粒pSH65,得到gre3缺失的 1308-P-GRE3 Δ 1。重复操作去除工业酵母另一个GRE3等位基因，得到1308-P-GRE3 Δ 2。
[0072] 实施例4各工程菌株生理生化的测定比较
[0073] 1、实验目的
[0074] 1)对比缺失一个或两个GRE3基因的工业酵母工程菌与出发菌的葡萄糖和木糖糖 利用率、生长速率和乙醇产率
[0075] 2)研究考核GRE3基因的作用，以发现如何合理调整GRE3基因的表达活性。
[0076] 2、实验对象
[0077] 实验菌株：1308-P_GRE3A 1，为缺失一个GRE3基因并含pYES-PXI的工业酵母工程 菌；
[0078] 对照菌株1 :1308-P，为含pYES-PXI的工业酵母菌；
[0079] 对照菌株2 :1308-P-GRE3 Δ 2,为缺失两个GRE3基因并含pYES-PXI的工业酵母工 程菌。
[0080] 3、实验方法
[0081] 分别将各菌株在以葡萄糖/木糖的混合物（分别为140g/L和分别为70g/L的初 始浓度）为唯一碳源并加有抑制物糠醛的发酵培养基中，30°C 180rpm摇培71h;
[0082] 间隔6h到12h取样一次；
[0083] 用高效液相色谱法（HPLC)测定上清葡萄糖和木糖含量；
[0084] 比较各菌株的葡萄糖和木糖糖利用率、生长速率和乙醇产率。
[0085] 以上实验均重复3次以上。
[0086] 4、实验结果
[0087] 1)生长速率和抑制物耐受力
[0088] 在抑制物糠醛存在的情况下，工程菌株1308-P-GRE3 Δ 1的生长速率比出发菌株 1308-P约有提升（2. 4% )，说明对抑制物耐受力没有下降；
[0089] 而与1308-P-GRE3 Δ 2相比，1308-P生长速率下降了 9. 21 %，明显受到抑制物糠醛 的抑制，抑制物耐受力下降明显。
[0090] 结果数据见图1、表2。
[0091] 2)葡萄糖利用率
[0092] 经过48h培养，实验菌株1308-P-GRE3A 1与对照菌株1308-P以及 1308-P-GRE3 △ 2 -样，培养基的葡萄糖均几乎完全利用；表明本实验菌株不影响葡萄糖的 利用。
[0093] 结果数据见图2-4、表2。
[0094] 3)木糖利用率和副产物木糖醇生成
[0095] 经过48h培养，出发菌株1308-P培养基的木糖利用率仅达到41. 2%，木糖醇最高 达到 5. 65g/L ;
[0096] 1308^1?3八2木糖利用率达到35.4%，副产物木糖醇最高仅为1.398/1，相比 对照菌株1308-P降低了 75. 4% ;
[0097] 实验菌株1308-P-GRE3 Δ 1的木糖利用率最高，达到43. 7%，副产物木糖醇最高仅 为1.41g/L，和1308-P-GRE3A2相当，相比出发菌株1308-P降低了 75. 1%，。
[0098] 结果数据见图2-4、表2。
[0099] 4)乙醇产量
[0100] 实验菌株1308-P-GRE3A1比出发菌株1308-P在48h高了 7. 46%，比对照菌株 1308-P-GRE3A2 提高 了了 8. 11%。
[0101] 结果数据见图2-4、表2。
[0102] 表2菌株发酵数据
[0103]
[0104] 4、结论
[0105] 1) 1308-P-GRE3 Δ 1生长速率高，比出发菌株1308-P有提升；
[0106] 2)与出发菌株相比，1308-P-GRE3A 1可显著提高乙醇产量；
[0107] 去除一个GRE3基因，菌的生长速率不会受到抑制物的抑制；
[0108] 3)证明合理调整酿酒酵母中GRE3基因的表达活性非常关键
[0109] 从以上实验中可看到：
[0110] A去除GRE3基因不影响出发菌原有的葡萄糖利用率；
[0111] B去除GRE3基因可显著降低副产物木糖醇的生成；
[0112] C去除一个GRE3基因与去除两个GRE3基因对降低木糖醇生成的影响相当；
[0113] D本发明通过合理调整GRE3基因的表达活性，不仅提高了木糖转化为乙醇的效 率，而且有效降低副产物的生成。
【主权项】
1. 一种基因工程菌株，特征是在酿酒酵母1308-P中缺失一个具有SEQ ID N0:1所示核 苷酸序列的GRE3基因。2. 权利要求1所述菌株的构建方法，其特征在于用SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列替 换酿酒酵母1308-P中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列。3. 权利要求2所述的方法，其步骤包括：构建GRE3基因敲除组件、将GRE3基因敲除组 件转入酵母、敲除GRE3基因\去除抗性标记，最终得到缺失一个GRE3基因的重组菌株。4. 权利要求1所述菌株在发酵葡萄糖和木糖中的应用。5. 权利要求1所述菌株在乙醇生产中的应用。6. -种重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。7. 包含权利要求6所述基因的载体。8. 用权利要求7所述的载体转化的宿主细胞。9. 权利要求6所述基因在构建发酵葡萄糖和木糖的工程菌株中的应用。 10. SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的基因在调整木糖转化为乙醇的效率及调整木糖 醇生成中的应用。
【文档编号】C12R1/865GK105985915SQ201510066855
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月9日
【发明人】王智, 顿宝庆, 王林风, 杨付伟, 路明
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所, 河南天冠企业集团有限公司