次血红素6肽衍生物及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明涉及一种次血红素6肽衍生物，其具有Dh-β-AH-CPP结构，其中CPP代表细胞膜穿透肽，所述Dh-β-AH与所述CPP是通过共价键偶联的。本发明还涉及该次血红素6肽衍生物的制备方法，涉及包含该次血红素6肽衍生物的组合物，涉及该次血红素6肽衍生物在制备用于预防和/或治疗疾病或预防衰老的药剂中的用途。所述次血红素6肽衍生物特别适于口服。
【专利说明】
次血红素6肽衍生物及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及次血红素6肽衍生物及其制备方法和用途。具体地，本发明涉及次血 红素6肽衍生物Dh-β -AH-CPP、包含其的组合物、其制备方法及其在制备具有抗坏血酸过 氧化物酶活性的药剂中的用途。
【背景技术】
[0002] 次血红素 6 肽（Deuterohaemin- β -Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys，Dh_ β -AHTVEK，Dh HP-6)作为一种铁卟啉的肽类衍生物，是抗坏血酸过氧化物酶的模拟酶，体内/体外试验结 果表明其具有良好的抗氧化活性，在预防和/或治疗糖尿病、白内障、心脑血管疾病、衰老、 炎症方面均显示较好的功效。
[0003] 然而，次血红素6肽作为一种多肽，由于分子量大、不易透过细胞膜，因此常规的 给药途径是注射。然而，从患者使用的方便、安全及顺应性角度考虑，尤其是例如糖尿病这 类需要长期用药的情况，这样的给药方式并不理想。相较于注射给药，口服给药是各种给药 方式中较为理想的方式之一。虽然目前通过多肽链修饰技术（参见CN 103450341 A)显著 提高了多肽的稳定性，从而可提高多肽的生物利用度，为口服给药奠定了基础，但是这些修 饰却不能显著改善次血红素6肽的肠道细胞透过性，因此，仍然不适于口服。
[0004] 为了解决上述问题，需要对次血红素6肽进一步改造，以使其适于口服。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的在于提供适于口服的次血红素6肽衍生物。
[0006] 本发明人发现，将次血红素6肽的序列截短，得到具有抗坏血酸过氧化物酶活性 的最小单元--Dh-β-AH，再将此活性单元与细胞膜穿透肽（cell penetrating peptide， CPP)化学偶联，可获得具有活性的口服次血红素6肽衍生物Dh-i3-AH-CPP。所述次血红素 6肽衍生物Dh- β -AH-CPP具有很好的穿膜性能，跨肠道细胞能力增加。
[0007] 因此，在本发明的第一个方面，提供了具有下式结构的次血红素6肽衍生物：
[0008] Dh- β -AH-CPP,
[0009] 其中CPP代表细胞膜穿透肽，并且所述CPP与所述Dh- β -AH是化学偶联的。
[0010] 所述化学偶联是指所述CPP与所述Dh- β -AH是通过共价键连接在一起的。
[0011] 优选地，所述 CPP 为 GRKKRRQRRRPPQ、RRRRRRRR、KLALKLALKALKAALKLA、 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV、 RQIKIWFQNRRMKWKK、 KKTWWKTWWTKWSQPKKKRKV 或 AGYLLGKINLKALAALAKKILo
[0012] 在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明的次 血红素6肽衍生物和可药用的载体。
[0013] 在本发明的第三方面，提供了本发明的次血红素6肽衍生物的制备方法，所述方 法包括以下步骤：
[0014] 1)在固相载体上，按照Fmoc固相合成法从C端（羧基端）至N端（氨基端）顺序 地偶联经Fmoc保护的CPP序列各个氨基酸以及Fmoc-His-〇H、Fmoc- β -Ala-OH从而得到经 保护的ΝΗ2-β -Ala-His-CPP-固相载体；
[0015] 2)偶联次血红素；
[0016] 3)脱除保护基团，同时将所得的Dh-β -AH-CPP从固相载体上切割下来，得到含有 Dh-0-AH-CPP 的溶液。
[0018] 优选地，所述固相载体为Fmoc固相合成法中常用的载体。优选地，所述固相载体 为 Rink amide MBHA 树脂。
[0019] 优选地，对3)中得到的含有Dh- β -AH-CPP的溶液进行纯化，纯化方法例如洗涤、 重结晶及色谱法（例如HPLC)等。优选色谱法，更优选HPLC。
[0020] 由于本发明的次血红素6肽衍生物（Dh- β -AH-CPP)具有抗坏血酸过氧化物酶活 性，并且细胞透过性好，因此可以口服的方式作为抗坏血酸过氧化物酶用于疾病的治疗和/ 或预防。
[0021] 因此，本发明的第四方面提供了本发明的次血红素6肽衍生物在制备用于预防和 /或治疗疾病或用于预防衰老的药剂中的用途，所述疾病可以使用抗坏血酸过氧化物酶或 者具有抗坏血酸过氧化物酶活性的化合物治疗，具体而言，所述疾病可以选自糖尿病、白内 障、心脑血管疾病、炎症，所述药剂特别适于口服给药。
【具体实施方式】
[0022] 在本文中公开了一系列多肽的氨基酸序列，本领域技术人员能够理解的是，在以 三字母的氨基酸残基或单个字母表示某一序列时，该序列从左至右表示的是该多肽从Ν端 (氨基端）至C端（羧基端）的序列。例如当使用"Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys"表示某 一多肽的序列时，意为该多肽的序列为"N端-Ala-His-Thr-Val-Glu-Lys-C端"，而当使用 "AHTVEK"表示某一多肽的序列时，意为该多肽的序列为"N端-AHTVEK-C端"。
[0023] 当没有具体标明氨基酸的构型时，其是指α -氨基酸。
[0024] 对本发明中所用英文及缩写及其含义说明如下：
[0025]
[0027] 在本发明的一个实施方案中，提供了具有下式结构的次血红素6肽衍生物：
[0028] Dh- β -AH-CPP,
[0029] 其中CPP代表细胞膜穿透肽，其为GRKKRRQRRRPPQ、RRRRRRRR、 KLALKLALKALKAALKLA、 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV、 RQIKIWFQNRRMKWKK、 KKTWWKTWffTKWSQPKKKRKV 或 AGYLLGKINLKALAALAKKIL，所述 CPP 与 Dh- β -AH 通过共价键连 接。
[0030] 上述次血红素6肽衍生物可以作为抗坏血酸过氧化物酶用于预防和/或治疗疾病 或预防衰老，所述疾病是可以使用抗坏血酸过氧化物酶或者具有抗坏血酸过氧化物酶活性 的化合物治疗的疾病，具体而言，所述疾病选自糖尿病、白内障、心脑血管疾病、炎症。
[0031] 本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物中包括一种或多种本发明的次 血红素6肽衍生物和一种或多种可药用的载体。
[0032] "可药用的载体"是指在生物学上或其他方面不会具有不良作用的物质，即可以将 所述物质与本发明的次血红素6肽衍生物一同给予受试者，同时不会引起任何不良的生物 学影响或以有害的方式与含有它的药物组合物的任何其他组分相互作用。显然应当选择可 使活性成分在受试者体内的任何降解降到最低以使任何不良副作用减到最小的载体，这是 本领域技术人员所熟知的。合适的载体包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂和 稀释剂、乳化剂、悬液剂、溶剂、填充剂、增量剂、缓冲剂、载体、冲淡剂、赋形剂和/或药用佐 剂。
[0033] 在本发明的另一个实施方案中，提供了本发明的次血红素6肽衍生物的制备方 法，所述方法包括以下步骤：
[0034] 1)在固相载体上，按照Fmoc固相合成方法从C端（羧基端）至N端（氨基端）顺 序地偶联经Fmoc保护的CPP序列各个氨基酸以及Fmoc-His-〇H、Fmoc-β -Ala-ΟΗ，从而得 到经保护的ΝΗ2-β -Ala-His-CPP-固相载体；
[0035] 2)偶联次血红素；
[0036] 3)脱除保护基团，同时将Dh- β -AH-CPP从固相载体上切割下来，得到含有 Dh-0-AH-CPP 的溶液。
[0037] 优选地，其中所述 CPP 为 GRKKRRQRRRPPQ、RRRRRRRR、KLALKLALKALKAALKLA、 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV、 RQIKIWFQNRRMKWKK、 KKTWWKTWWTKWSQPKKKRKV 或 AGYLLGKINLKALAALAKKILo
[0038] 优选地，所述固相载体为Fmoc固相合成法中常用的载体。优选地，所述固相载体 为 Rink amide MBHA 树脂。
[0039] 优选地，对步骤3)中得到的含有Dh- β -AH-CPP的溶液进行纯化，纯化方法例如洗 涤、重结晶及色谱法（例如HPLC)等，优选色谱法，更优选HPLC。
[0040] 在本发明的另一个实施方案中，提供了本发明的次血红素6肽衍生物在制备用于 预防和/或治疗疾病或预防衰老的药剂中的用途，所述疾病是可以使用抗坏血酸过氧化物 酶或者具有抗坏血酸过氧化物酶活性的化合物治疗的疾病，具体而言，所述疾病选自糖尿 病、白内障、心脑血管疾病、炎症，所述药剂特别适于口服给药。
[0041] 用于口服给药时可采用片剂、延迟型片剂、舌下片剂、胶囊剂、吸入型气溶胶、吸入 型溶液剂、干粉吸入剂或液体制剂（例如混合物、溶液剂、酏剂、糖浆剂或悬液剂）的形式， 所有剂型均含有本发明的次血红素6肽衍生物；所述制剂可通过本领域公知的方法来制 备。
[0042] 如果组合物为片剂的形式，可使用通常用于制备固体制剂的任意药物载体。所述 载体的实例包括硬脂酸镁、滑石、凝胶、阿拉伯胶、硬脂酸、淀粉、乳糖和蔗糖。
[0043] 片剂可任选与一种或多种辅助成分一起压制或模制来制备。压制片剂可通过在适 合的机器中压制任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合的 呈自由流动形式（例如粉末或颗粒）的活性成分来制备。模制片剂可通过在适合的机器中 将由惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物模制来制备。所述片剂可任选包覆包衣 或经刻痕且可进行调配以提供缓慢或控制地释放其中的活性成分。
[0044] 对于片剂剂型，视剂量而定，所述次血红素6肽衍生物可组成剂型的1重量％至80 重量％，更通常组成剂型的5重量％至60重量％。
[0045] 除所述次血红素6肽衍生物外，片剂通常含有崩解剂。崩解剂的实例包括羟基乙 酸淀粉钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、聚乙烯吡咯 烷酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低级烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶凝化淀粉以及海 藻酸钠。崩解剂通常会构成剂型的1重量％至25重量％、优选5重量％至20重量％。
[0046] 片剂还可含有粘合剂。粘合剂通常用来赋予片剂制剂以黏着性质。适合的粘合剂 包括微晶纤维素、凝胶、糖类、聚乙二醇、天然和合成的胶、聚乙烯吡咯烷酮、预胶凝化淀粉、 羟丙基纤维素以及羟丙基甲基纤维素。粘合剂的量通常为片剂的约10重量％至约90重 量％。
[0047] 片剂还可含有稀释剂，例如乳糖（一水合物、喷雾干燥的一水合物、无水物等）、甘 露糖醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、微晶纤维素、淀粉以及二水合磷酸氢钙。稀释剂的 量通常为片剂的约〇重量％至约85重量％的稀释剂。
[0048] 片剂还可任选包含表面活性剂，例如月桂基硫酸钠以及聚山梨醇酯80,以及助流 剂，例如二氧化硅和滑石。如果存在，表面活性剂的量通常为片剂的〇. 2重量％至5重量％， 且助流剂的量通常为片剂的0. 2重量％至1重量％。
[0049] 片剂通常还包含润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酰富马酸钠，以 及硬脂酸镁与月桂基硫酸钠的混合物。润滑剂通常以片剂的〇. 25重量％至10重量％，优 选〇. 5重量％至3重量％的量存在。其他常规成分包括抗氧化剂、着色剂、调味剂、防腐剂 以及掩味剂。
[0050] 示例性的片剂含有最高达约80重量％的所述次血红素6肽衍生物、约2重量％至 约10重量％的崩解剂、约10重量％至约90重量％的粘合剂、约0重量％至约85重量％的 稀释剂，以及约〇. 25重量％至约10重量％的润滑剂。片剂混合物可通过直接压缩或通过 乳辊来压缩形成片剂。或者，片剂混合物或混合物的部分可在制片前湿法制粒、干法制粒或 熔融法制粒、熔融凝结或挤压。最终制剂可包含一层或多层且可被包衣或不包衣；或囊封。
[0051] 如果药剂为胶囊的形式，任何常规的囊封均适合，例如在硬凝胶胶囊中使用上述 载体。如果药剂呈软凝胶胶囊形式，可考虑任何通常用于制备分散剂或悬液剂的药物载体 (例如水性胶、纤维素、硅酸盐或油类）并将其纳入软凝胶胶囊中。
[0052] 用于口服给药的固体制剂可配制为即释和/或修饰释放。修饰释放制剂包括延迟 释放、持续释放、脉动释放、控制释放、靶向释放以及程序释放。
[0053] 液体制剂包括悬液剂、溶液剂、糖浆剂及酏剂。所述制剂可用作软胶囊或硬胶囊中 的填充剂且通常包括载体（例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素或适合的油），以 及一种或多种乳化剂和/或悬液剂。溶液剂可以为活性化合物的水溶性盐或其他衍生物结 合，例如，蔗糖以形成糖浆。液体制剂还可以通过复原例如小药袋里的固体来制备。
[0054] 实施例
[0055] 下面结合实施例对本发明作进一步说明。以下实施例是为了使本领域普通技术人 员能够更好地理解本发明，这仅仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力 确保有关数字（如数量、温度等）的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。除非另 有说明，份数为重量份数，温度以°c为单位或者为环境温度，压力接近或等于常压。
[0056] 主要试剂、仪器及其来源：
[0057] Rink amide MBHA resin、Fmoc-β-Ala-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Asn (Trt)-OH、 Fmoc_Asp(OtBu)-〇H、 Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、 Fmoc-Cys(Trt)-〇H、 Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、 Fmoc-Gln(Trt)-〇H、 Fmoc-Gly-〇H、 Fmoc-His(Trt)-〇H、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Met-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-〇H、 Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc_Trp(Boc)-〇H、Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、Fmoc-Val-OH、DIC、HOBt、 PyBop、DIEA、哌啶、三氟乙酸、苯甲醚、苯酚：上海吉尔生化公司
[0058] DMEM 培养基、胎牛血清、HBBS、D-HBBS :德国 GIBCO Invitrogen 公司
[0059] 高效液相色谱仪：美国Agilent公司
[0060] MALDI-T0F-T0F 58〇0 质谱仪：美国 AB Sciex 公司
[0061] NanoDrop 2000 紫外分光光度仪：美国 Thermo scientific 公司
[0062] C02培养箱：美国Thermo公司
[0063] SW-CJ-2F净化工作台：苏州安泰公司
[0064] YMC 0DS-A色谱柱：日本YMC公司
[0065] Eclipse XDB C18 色谱柱：美国 Agilent 公司
[0066] 内插式24孔细胞培养板、Millicel-ERS2电阻仪：美国Millipore公司
[0067] 实施例 1. Dh- β -AHTVEK 的制备
[0068] 溶胀：将0. lmmol的Rink amide MBHA树脂（取代度为0. 33mmol/g)置于反应器 中，加入4ml DMF，于27°C、130rpm振摇30min进行溶胀，使用10ml DMF洗涤树脂，每次洗涤 3min，共洗涤6次，洗涤完毕后抽干。
[0069] 脱保护：向反应器中加入4111120%哌啶-01^溶液，在27°(：以130印111振摇201^11， 用10ml DMF洗树脂，每次洗涤3min，共洗涤6次，洗涤完毕后抽干。
[0070] 偶联：将 Fmoc-Lys (Boc) -〇H(0. 3mmol)、PyBop (0· 3mmol)、HOBt (0· 3mmol)、喊试剂 NMM(0. 6mmol)溶于4ml DMF中，然后加入反应器中，在27°C下以130rpm振摇lh。用lOmlDMF 洗树脂，每次洗涤3min，共洗涤6次，洗涤完毕后抽干，得到Fmoc-Lys (Boc)-Rink amide MBHA。
[0071] 重复上述脱保护及偶联步骤，依次将Fmoc-Glu (OtBu) -〇H、Fmoc-Val-〇H、 Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-β-Ala-OH 连接到 Fmoc-Lys (Boc)-Rink amide MBHA 上，最后脱除 Fmoc 保护基，NH2- β -Ala-His (Trt) -Thr (tBu) -Val-Glu (OtBu) _L ys (Boc)-Rink amide MBHA 树脂。
[0072] 将次血红素（0· 3mmol)、PyBop (0· 3mmol)、HOBt (0· 3mmol)、喊试剂 NMM(0. 6mmol) 溶于4ml DMF中，然后加入到反应器中，在27°C下以130rpm振摇lh。然后抽干，得到Dh-β -Ala-His (Trt) -Thr (tBu) -Val-Glu (OtBu) -Lys (Boc) -Rink amide MBHA 树脂。
[0073] 将所得的树脂肽用10ml DMF及10ml甲醇分别洗3min/次X 6次，真空干燥 12-15h〇
[0074] 每次脱保护及偶联反应后，取少量树脂粒，加入Kaiser ninhydrin试剂（A，6%讳 三酮的乙醇溶液；B，80%苯酚的乙醇溶液；C，0. 001M KCN的吡啶溶液各2滴），于120°C下 反应5min，若树脂为蓝色（伯胺）表明氨基暴露，反应完成。
[0075] 切割：向树脂肽中加入4ml切割液--TFA:苯甲醚：苯酚：水 (92. 5:2. 5:2. 5:2. 5)，在27°C下以130rpm振摇lh，过滤除去树脂，得到含有粗肽的切割液。
[0076] 沉淀：将上述含有粗肽的切割液滴入到50ml冷乙醚中，先在-20°C放置lh，然后 在4°C下以8000rpm离心10min，用20ml乙醚洗涤沉淀2次，离心，收集粗肽沉淀，真空干燥 12-15h〇
[0077] 纯化：将干燥后的粗肽溶于水，使用半制备HPLC以下文所述的色谱条件进行纯 化。分部收集目标色谱峰，合并纯度大于95%的组分。收集液在37°C、50mbar减压下 旋转蒸发以除去乙腈，将剩余的水溶液冷冻干燥24h，得到纯肽。色谱条件：色谱柱YMC ODS-A(250X 20mm，10 μ m)，流动相A为水，B为乙腈（均含0. 1 % TFA)，梯度洗脱，60min内 B相的比例由10%增至70%，流速20ml/min，柱温25°C，386nm下进行紫外检测。
[0078] 结构鉴定：将纯品肽以RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS进行鉴定。色谱条件：将干燥 后的纯品肽用纯水溶解，浓度为lmg/ml。色谱柱EclipseXDBC18(4·6X150mm，5μm)，流动 相A为10%乙腈-水，B为90%乙腈-水（均含0. 1 % TFA)，梯度洗脱，在5min内B相的比 例由10%增至20%，再经lOmin增至50%，最后5min增至70%，流速1.0ml/min，386nm下 进行紫外检测，柱温25°C。质谱条件：将干燥后的纯品肽用纯化水溶解，浓度为0. lmg/ml。 将0· 5 μ L纯化的Dh- β -AHTVEK与0· 5 μ L基质（浓度为50mM的溶于乙腈的R-氰基-4-羟 基肉桂酸）混合均匀，点样于不锈钢测试板上，室温干燥。反射模式，阳离子扫描。鉴定结 果表明，所得的纯品肽序列与理论一致，纯度98. 3%。
[0079] 实施例2Dh- β -AHTVE的制备
[0080] 采用与实施例1相同的合成方法和纯化方法，依次将Fmoc-Glu (OtBu) -0Η、 Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr (tBu) -〇H、Fmoc-His (Trt) -〇H、Fmoc- β -Ala-〇H 和次红血素连接到 Rink amide MBHA上，然后切割、沉淀、纯化，得到Dh-β-ΑΗ??Ε纯肽。并采用与实施例1相 同的方法用RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯 品肽序列与理论一致，纯度97. 6%。
[0081] 实施例3Dh- β -AHTV的制备
[0082] 采用与实施例1相同的合成方法和纯化方法，依次将Fmoc-Val-〇H、 Fmoc-Thr (tBu)-〇H、Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-β-Ala-OH 和次红血素连接到 Rink amide MBHA上，然后切割、沉淀、纯化，得到Dh-β -AHTV纯肽。并采用与实施例1相同的方法用 RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯品肽序列与 理论一致，纯度98. 7%。
[0083] 实施例4Dh_ β -AHT的制备
[0084] 采用与实施例1相同的合成方法和纯化方法，依次将Fmoc-Thr (tBu) -0Η、 卩111〇(3-]^8(1'1'1:)-〇!1、？1]1〇〇-0-41&-〇!1和次红血素连接到1?;[111<:&111丨(16]\〇3撤上，然后切割、纯 化、沉淀，得到Dh-β -AHT纯肽。并采用与实施例1相同的方法用RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯品肽序列与理论一致，纯度98.0%。
[0085] 实施例roh- β -AH的制备
[0086] 采用与实施例1相同的合成方法和纯化方法，依次将Fmoc-Hi s (Trt) -0Η、 Fmoc-β -Ala-〇H和次红血素连接到Rink amide MBHA上，然后切割、纯化、沉淀，得到 Dh-β -AH纯肽。并采用与实施例1相同的方法用RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进 行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯品肽序列与理论一致，纯度97. 3%。
[0087] 实施例6Dh- β -A的制备
[0088] 采用与实施例1相同的合成方法和纯化方法，依次将Fmoc- β -Ala-ΟΗ和次红血素 连接到Rink amide MBHA上，然后切割、纯化、沉淀，得到Dh-β-A纯肽。并采用与实施例1 相同的方法用RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的 纯品肽序列与理论一致，纯度97. 7%。
[0089] 实施例 7Dh- β -AH-GRKKRRQRRRPPQ 的制备
[0090] 采用与实施例1相同的合成方法和纯化方法，依次将Fmoc-Gln (Trt) -0Η、 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、 Fmoc-Gln (Trt)-〇H、Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、 Fmoc-Gly-〇H、 Fmoc_His(Trt)-〇H、 Fmoc-0-Ala-〇H、次红血素连接到Rink amide MBHA树脂上，然后切割、沉淀、纯化，得到 Dh-β -AH-GRKKRRQRRRPPQ纯肽。并采用与实施例1相同的方法用RP-HPLC和MALDI-T0F-T0F MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯品肽序列与理论一致，纯度98. 3%。
[0091] 实施例 8Dh- β -AH-RRRRRRRR 的制备
[0092] 采用与实施例1相同的合成方法及纯化方法，依次将Fmoc-Arg (Pbf) -0Η (重复偶 联 8 次）、Fmoc_His (Trt) -〇H、Fmoc_ β -Ala-〇H、次红血素连接到 Rink amide MBHA 树脂上， 然后切割、沉淀、纯化，得到Dh- β -AH-RRRRRRRR纯肽。并采用与实施例1相同的方法用 RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯品肽序列与 理论一致，纯度97. 2%。
[0093] 实施例 9Dh- β -AH-KLALKLALKALKAALKLA 的制备
[0094] 采用与实施例1相同的合成方法和纯化方法，依次将Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、 Fmoc-Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Leu-〇H、 Fmoc-Ala-〇H、 Fmoc-Ala-〇H、 Fmoc-Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-β -Ala-〇H、次红血素连接到 Rink amide MBHA树脂上，然后切割、 沉淀、纯化，得到Dh- β -AH-KLALKLALKALKAALKLA纯肽。并采用与实施例1相同的方法用 RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯品肽序列与 理论一致，纯度97. 9%。
[0095] 实施例 10Dh- β -AH-MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV 的制备
[0096] 采用与实施例1相同的合成方法和纯化方法，依次将Fmoc-Val-〇H、 Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Cys (Trt)-〇H、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、 Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、Fmoc-Arg (Pbf)-〇H、 Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Met-OH、 Fmoc-His (Trt)-〇H、Fmoc-β -Ala-〇H、次红血素连接到 Rink amide MBHA树脂上，然后切割、 沉淀、纯化，得到Dh-β -AH-MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV纯肽。并采用与实施例1相同的方法 用RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯品肽序列 与理论一致，纯度97. 5%。
[0097] 实施例 1 lDh- β -AH-RQIKIWFQNRRMKWKK 的制备
[0098] 采用与实施例1相同的合成方法和纯化方法，依次将Fmoc-Lys (Boc) -0Η、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc_Trp(Boc)-〇H、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Met-OH、 Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Asn(Trt)-〇H、Fmoc-Gln(Trt)-〇H、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc_Trp(Boc)-〇H、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Gln(Trt)-〇H、Fmoc_Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-His(Trt)-〇H、Fmoc-0_Ala-〇H 连接到 Rink amide MBHA树脂上，然后切割、沉淀、纯化，得到Dh-β -AH-RQIKIWFQNRRMKWKK。并采用与实 施例1相同的方法用RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明， 所得的纯品肽序列与理论一致，纯度97. 6%。
[0099] 实施例 12Dh- β -AH-KKTWWKTWffTKWSQPKKKRKV 的制备
[0100] 采用与实施例1相同的合成方法及纯化方法，依次将Fmoc-Val-〇H、 Fmoc-Lys (Boc)-〇H、Fmoc-Arg(Pbf)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、 Fmoc_Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc_Gln(Trt)-〇H、 Fmoc_Ser(tBu)-〇H、 Fmoc-Trp (Boc)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Trp(Boc)-〇H、 Fmoc-Trp (Boc)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Trp(Boc)-〇H、 Fmoc-Trp (Boc)-〇H、Fmoc-Thr(tBu)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、Fmoc-Lys(Boc)-〇H、 Fmoc-His(Trt)-〇H、Fmoc-0 -Ala-〇H、次红血素连接到Rink amide MBHA树脂上，然后切割、 沉淀、纯化，得到Dh-β -AH-KKTWWKTWffTKWSQPKKKRKV纯肽。并采用与实施例1相同的方法 用RP-HPLC和MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯品肽序列 与理论一致，纯度98. 0%。
[0101] 实施例 13Dh- β -AH-AGYLLGKINLKALAALAKKIL 的制备
[0102] 采用与实施例1相同的合成方法及纯化方法，将Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ile-〇H、 Fmoc-Lys (Boc)-〇H、Fmoc-Lys (Boc)-〇H、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Leu-〇H、Fmoc-Ala-〇H、 Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys (Boc)-〇H、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Asn (Trt)-〇H、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys (Boc)-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、 Fmoc-Gly-〇H、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-His(Trt)-〇H、 Fmoc-f3-Ala-OH、次红血素连接到Rink amide MBHA树脂上，然后切割、沉淀、纯化，得 到Dh- β -AH-AGYLLGKINLKALAALAKKIL。并采用与实施例1相同的方法用RP-HPLC和 MALDI-TOF-TOF MS对纯肽进行结构鉴定。鉴定结果表明，所得的纯品肽序列与理论一致，纯 度 97.8%。
[0103] 实施例14过氧化物酶活性
[0104] 将实施例1-13中所得到的纯肽用纯水置成浓度为200 μM/L的肽溶液，然后按照 如下方法分别测量所得的纯肽的过氧化物酶活性：
[0105] 取 2. 5ml 50mM 磷酸二氢钠（ρΗ7· 4) -0· ImM EDTANagl 冲液，20 μ 1 抗坏血酸 (0. 5mM)，10 μ 1 Η202 (0. 3mM)，20 μ 1肽溶液，加入lcm石英比色皿内，终体积3ml，其中不加 抗坏血酸和H202为空白对照，室温25°C监测290nm吸光度在60s (spot/5s)内的降低。
[0106] 活性单位定义为每分钟转化1 μ mol抗坏血酸所需的肽的量，比活定义为每μ mol 肽所具有的活性。计算公式如下，U比活（Unit/ymol)，AA吸光度差，ε抗坏血酸的消光 系数（2. 8mM、cm 4，c肽浓度（μ Μ)，1000单位换算系数。
[0108] 如表1结果所示，随着DhHP-6序列被进一步截短，其酶活力逐渐降低（次血红素6 肽衍生物2-6)，其中Dh- β -AH为最小活性单元，活性约为DhHP-6的50 %，而Dh- β -A基本 无活性。这表明His咪唑环与Dh铁原子在轴向配位，对于电子传递起重要作用。将Dh- β -AH 偶联富含亲水性氨基酸的穿膜肽后（次血红素6肽衍生物7-13)，其酶活力显著提高，达到 与DhHP-6相当的水平。
[0109] 表1实施例1-13所得的肽的过氧化物酶活性
[0110]
[0111] 实施例15Cac〇-2细胞透过性
[0112] Caco-2细胞（来自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）以DMEM培养 基（添加10%胎牛血清，1%非必需氨基酸（德国6让(： 〇)，21111谷氨酰胺）传代培养（37°(：， 5% C02)。取60~66代次细胞，按2. 5 X 105细胞/cm2铺种于聚碳酸酯膜上（内插式24孔 细胞培养板，孔径〇. 4 μ m，表面积0. 6cm2)。每2天更换上述DMEM培养基，待生长至21~ 23天，细胞单层完全分化，跨膜电阻趋于稳定（500~800 Ω . cm2)，可以用于膜透过测定。细 胞用HBSS(Hank' s平衡盐缓冲液）洗2次，加入400 μ 1 HBSS，在37°C下孵育30min。将 实施例中所得的肽样品以HBSS溶解（肽溶度为ImM)，经0. 22 μ m滤膜除菌，取200 μ 1加 入到细胞顶侧，400 μ 1 HBSS加入到细胞基底侧，37°C孵育120min。收集基底侧HBSS，以 HPLC测定所收集的HBSS中的肽含量，计算单位时间内次血红素肽的透过量，即透过速率， 进而计算表观渗透系数。公式如下，P app表观渗透系数（cm/s)，C。肽的初始浓度，A膜表面 积（0. 6cm2)，dQ/dt次血红素肽透过速率：
[0114] 表2结果显示，最小活性单元Dh-β -AH与DhHP-6的表观渗透系数相当，Papp在 3X10scm/s范围，均为小肠吸收不良的化合物。尽管Dh-β-ΑΗ的脂溶性增加、分子量降 低，但并未改善其细胞膜穿透性，说明Dh-β -AH仍是依赖浓度梯度的胞间被动扩散。将 Dh- β -AH偶联穿膜肽后（次血红素6肽衍生物7-13)，偶联有各穿膜肽序列的Dh- β -AH跨 Caco-2细胞的透过性均显著提高（Papp增加6-7倍），其中富含两亲性氨基酸（表2中编号 为5、7、8和9)的穿膜肽效果更优。而将Dh- β -AH与穿膜肽物理混合，不能提高Dh- β -AH 的表观渗透系数（表观渗透系数为3. 1 X 10 Scm/s)，说明其必须通过化学键与穿膜肽连接 才能提高跨细胞的透过性。综上，Dh-i3-AH-CPP跨细胞性能极大改善，可作为先导结构开 发口服药物。
[0115] 表2实施例1-13所得的肽的Caco-2细胞透过性
[0116]
[0118] 实施例16. 口服片剂
[0119] 组成：
[0120] 100mg实施例7制备的次血红素6肽衍生物Dh- β -AH-GRKKRRQRRRPPQ、50mg乳糖 (一水合物）、50mg玉米淀粉（天然）、lOmg聚乙烯吡咯烷酮（PVP 25)和2mg硬脂酸镁。
[0121] 片重212mg、直径8mm、曲率半径12mm。
[0122] 制备：
[0123] 将实施例7制备的Dh- β -AH-GRKKRRQRRRPPQ、乳糖和淀粉的混合物用5 % (w/w) 的PVP25的水溶液制粒。将所述颗粒干燥，然后与硬脂酸镁混合5分钟。该混合物在常规 压片机中进行压缩。压缩用的指导值为15kN的压力。
[0124] 实施例17. 口服悬液剂
[0125] 组成：
[0126] lOOmg实施例9制备的次血红素6肽衍生物Dh- β -AH-KLALKLALKALKAALKLA、 l〇〇mg 浓度为 96%的乙醇水溶液、40mgRh〇digel? (购自 FMC，Pennsylvania，USA 的黄原 胶）和9. 9g水。
[0127] lOOmg本发明的次血红素6肽衍生物9的单一剂量对应于10ml 口服悬液剂。
[0128] 制备：
[0129] 将Rhodigel悬浮在96 %的乙醇水溶液中，将实施例9制备的 Dh-f3-AH-KLALKLALKALKAALKLA加入到悬液中。在搅拌下加入水。将所述混合物搅拌约6h 直到黄原胶Rhodigel?完全膨胀。
[0130] 实施例18. 口服溶液剂
[0131] 组成：
[0132] 500mg 实施例 13 制备的次血红素 6 肽衍生物 Dh- β -AH-AGYLLGKINLKALAALAKKIL、 2. 5g聚山梨酸酯（聚合度为80)和97g聚乙二醇400。100mg Dh-β -AH-AGYLLGKINLKALAALAKKIL 的单一剂量对应于 20g 口服溶液剂。
[0133] 制备：
[0134] 在搅拌下，将实施例13制备的Dh-β -AH-AGYLLGKINLKALAALAKKIL悬浮在聚乙二 醇400和聚山梨酸酯的混合物中。持续搅拌直至Dh-β -AH-AGYLLGKINLKALAALAKKIL完全 溶解。
【主权项】
1. 一种次血红素6肽衍生物，其具有Dh- β -AH-CPP结构，其中CPP代表细胞膜穿透肽， 所述Dh- β -AH与所述CPP是通过共价键偶联的。2. 权利要求1的次血红素6肽衍生物，其中CPP为GRKKRRQRRRPPQ、 RRRRRRRR、 KLALKLALKALKAALKLA、 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV、 RQIKIWFQNRRMKWKK、 KKTWWKTWffTKWSQPKKKRKV 或 AGYLLGKINLKALAALAKKIL。3. -种药物组合物，其包括一种或多种权利要求1或2的次血红素6肽衍生物和可药 用的载体。4. 权利要求3的药物组合物，其中所述可药用的载体选自抗氧化剂、防腐剂、着色剂、 调味剂、稀释剂、乳化剂、悬液剂、溶剂、填充剂、增量剂、缓冲剂、载体、冲淡剂、赋形剂和/ 或药用佐剂。5. -种制备权利要求1或2的次血红素6肽衍生物的方法，所述方法包括以下步骤： 1) 在固相载体上，按照Fmoc固相合成法从C端至N端顺序地偶联经保护的 所述CPP中的各个氨基酸、Fmoc-His-OH和Fmoc- β -Ala-OH，从而得到经保护的 ΝΗ2-β -Ala-His-CPP-固相载体； 2) 偶联次血红素； 3) 脱除保护基团，同时将Dh-β -AH-CPP从固相载体上切割下来，得到含有 Dh-0-AH-CPP 的溶液。6. 权利要求5的方法，其中所述CPP为GRKKRRQRRRPPQ、RRRRRRRR、 KLALKLALKALKAALKLA、 MVTVLFRRLRIRRACGPPRVRV、 RQIKIWFQNRRMKWKK、 KKTWWKTWffTKWSQPKKKRKV 或 AGYLLGKINLKALAALAKKIL。7. 权利要求5或6的方法，还包括对在步骤3)中得到的次血红素6肽衍生物进行纯化 的步骤，纯化方法为洗涤、重结晶和色谱法中的一种或多种。8. 权利要求1或2的次血红素6肽衍生物在制备用于预防和/或治疗疾病或用于预防 衰老的药剂中的用途，所述疾病为可以使用抗坏血酸过氧化物酶或者具有抗坏血酸过氧化 物酶活性的化合物治疗的疾病。9. 权利要求8的用途，其中所述疾病选自糖尿病、白内障、心脑血管疾病、炎症。10. 权利要求8或9的用途，其中所述药剂用于口服。
【文档编号】A61K38/05GK105985441SQ201510041700
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年1月27日
【发明人】董庆光, 李惟, 陈妍
【申请人】长春百益制药有限责任公司