一种具有苯骈罩酚酮结构化合物的纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有苯骈罩酚酮结构化合物的纯化方法，包括：(1)将含有苯骈罩酚酮结构化合物的粗品溶解过滤后，微晶纤维素吸附，用10 %以下的乙醇梯度洗脱，收集洗脱液；(2)洗脱液进一步上样于装有纤维素衍生物的吸附柱，吸附后，用乙醇的水洗脱，收集目标产物，干燥，得目标产物纯度提高 2倍以上的纯化制品；(3)纯化制品以醇水(含50 mmol/L以下的磷酸二氢钾)溶解后,上样于装有Sephadex LH-20凝胶的层析柱，以低于15 % (v/v)乙酸乙酯的水(保持50 mmol/L以下的磷酸二氢钾和20 %( v/v)的乙醇在水中浓度不变)梯度洗脱，收集干燥得目标单体化合物。
【专利说明】
一种具有苯骈罩酚酮结构化合物的纯化方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种茶鲜叶中天然合成产物的纯化方法，特别涉及一种以柱层析的方 式从茶儿茶素的酶促氧化聚合产物中分离、纯化含苯骈罩酚酮结构化合物的方法。
【背景技术】
[0002] 茶（CaweWia (L. ) 0? Ktze)为山茶科山茶属植物，茶鲜叶含有茶儿 茶素（图1)、茶氨酸、咖啡碱、茶多糖，等活性成分。茶树所萌发的新梢叶片可通过传统的 萎调、揉捻及通氧"发酵"等工序制备成红茶，长期饮用，有益身心健康。红茶中含有的茶 黄素类化合物（Theaflavins)通常是由偶合的表型儿茶素与表没食子型茶儿茶素（Paired Catechins)经多酸氧化酶（teapolyphenol oxidase, TPP0)酶促氧化缩聚而成，即表儿 茶素（Epi-Catechin, EC)联合表没食子儿茶素（Epigallo-Catechin, EGC)、EC 联合表 没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallo-Catechin Gallate, EGCG)、表儿茶素没食子酸酯 (Epi-Catechin Gallate，ECG)联合EGC、ECG联合EGCG组合物在酶促合成条件下相对应分 别生成茶黄素（Theaflavin, TF)、茶黄素-3^ -单没食子酸酯（Theaflavin-3' -gallate, TF-3 ' -G)、茶黄素-3-单没食子酸酯（Theaflavin3-gallate，TF-3-G)、茶黄 素 _3,3'-双没食子酸酯（Theaflavin-3,3，-digallate，TF_3,3' -G)。茶黄素为 红茶品质因子之一，呈橘黄色，经核磁共振鉴定（Adrienne L. Davis, Ya Cai and Alan P. Davies. XH and 13C NMR Assignment of Theaflavin, Theaflavin Monogallate and Theaflavin Digallate. Magnetic Resonance in Chemistry, 1995，33 (7):549-552.)具 有苯骈罩酷酮（benzotropolone skeleton)结构：
其合成过程示意如下：
荼黄素最初是由Roberts等于1957年从红荼提取物中分离鉴定，并因固体呈 橙黄色而得名荼黄素具有体外抗氧化（Shengmin Sang，Shiying Tian，Jin-woo Jhoo，Hsin Wang，Ruth E. Stark, Robert T. Rosen, Chung S. Yang and Chi-Tang Ho. Chemical studies of the antioxidant mechanism of theaflavins: radical reaction products of theaflavin 3, 3' -digallate with hydrogen peroxide. Tetrahedron Letters, 2003， 44(30): 5583-5587. ||Ziyin Yang， Guoliang Jie， Fang Dong, Yi Xu, Naoharu ffatanabe, Youying Tu. Radical-scavenging abilities and antioxidant properties of theaflavins and their gallate esters in H202_mediated oxidative damage system in the HPF-1 cells. Toxicology in Vitro, 2008， 22(5):1250-1256. | |Nicholas J. Miller, Cinzia Castelluccio，Lilian Tijburg， Catherine Rice-Evans. The antioxidant properties of theaflavins and their gallate esters - radical scavengers or metal chelators ? FEBS Letters, 1996，392 (1):40-44. | |Lai Kwok Leung, Yalun Su，Ruoyun Chen, Zesheng Zhang, Yu Huang and Zhen-Yu Chen. Theaflavins in Black Tea and Catechin in Green Tea Are Equally Effective Antioxidants. The Journal of Nutrition, 2001， 131(9): 2248-2251.)、降低心脑血管疾病（Henryk Dreger，Mario Lorenz，Alexandra Kehrer， Gert Baumann, Karl Stangl， and Verena Stangl. Characteristics of Catechin- and theaflavin-Mediated Cardioprotection. Experimental Biology and Medicine, 2008，233(4): 427-433. | | David J. Maron，Guo Ping Lu，Nai Sheng Cai，Zong Gui ffu, Yue Hua Li, Hui Chen, Jian Qiu Zhu, Xue Juan Jin, Bert C. ffouters, Jian Zhao. Cholesterol-Lowering Effect of a Theaflavin-Enriched Green tea Extract. Archives of Internal Medicine，2003，163: 1448-1453.)、诱导肿瘤细胞凋亡（Seewan Kim and Young-Eun Joo. Theaflavin inhibits LPS-Induced IL_6， MCP-1， and ICAM-1 Expression in Bone Marrow-Derived Macrophages Through the Blockade of NF~kB and MAPK Signaling Pathways. Chonnam Medical Journal, 2011， 47:104-110. ||Jiebo Lu, Chi-Tang Ho， Geetha Ghai， et al. Diferential Effects of Theaflavin Monogallates on Cell Growth, Apoptosis, and Cox~2 Gene Expression in Cancerous versus Normal Cells. Cancer Research, 2000, 60(22): 6465-6471. | | Susanne M. Henning, William Aronson, Yantao Niu， Francisco Conde， Nicolas H. Hee， Navindra P. seeram， Ru-Po Lee， Jinxiu Lu， Diane M. Harris, Aune Moro， Jenny Hong, Leung Pak-Shan， R. James Barnard, Hossein G. Ziaee, George Csathy, Vay L. ff. Go, Hejing Wang, and David Heber. Tea Polyphenols and theaflavins Are Present in Prostate Tissue of Humans and Mice after Green and Black tea Consumption. The Journal of Nutrition，2006，136(7): 1839-1843.)、调节免疫细胞功能（李晓娟，胡义平，刘 燕，等.TF3-H4对⑶4+⑶25+调节T细胞和⑶ 4+⑶25效应性T细胞早期活化的影响.中国 药理学通报，2012，28(3): 371-374.)、抗流感病毒（李湘潋，刘叔文，杨洁.茶黄素 衍生物抗甲型流感病毒的作用研究?中草药，2013，44(17): 2437-2441. || Chia-Nan Chen, Coney P. C. Lin, Kuo-Kuei Huang, ffei-Cheng Chen, Hsin-Pang Hsieh, P〇-Huang Liang and John T. -A. Hsu. Inhibition of SARS-COV 3C_like Protease Activity by Theaflavin-3,3'-digallate (TF3). eCAM, 2005，2(2):209-215?)及HIV病毒（毛芹超? 天然来源化合物抗HIV的活性筛选和ADS-Jl抑制HIV进入的作用机制研究.南方医科大 学药学院硕士学位论文，2013.)，等独特的作用，因此备受消费者及医药产业界的亲睐。
[0003] 茶黄素可由高速逆流色谱联合S印hadex LH-20凝胶色谱柱（江和源，程启 坤，杜琪珍.高速逆流色谱分离纯化茶黄素.天然产物研究与开发，1999，12(4): 35. | Changjun Yang, Daxiang Li, Xiaochun Wan. Combination of HSCCC and Sephadex LH-20 methods An Approach to isolation and purification of the main individual theaflavins from black tea. Journal of Chromatography B, 2008, 861(1):140-144)、大孔吸附树脂（CN 102229591 B| | 丁阳平.茶黄素类分离纯化技术及 其生理活性研究.湖南农业大学硕士学位论文，2005. ||王坤波.茶黄素的酶促合成、分 离鉴定及功能研究.湖南农业大学博士学位论文，2007. | |贾振宝，陈文伟，关荣发， 黄光荣，蒋家新?中草药，41(7): 1106-1109.)、硅胶柱联合S印hadex LH-20凝胶色谱 柱（Lai Kwok Leung, Yalun Su, Ruoyun Chen, Zesheng Zhang, Yu Huang and Zhen-Yu Chen. Theaflavins in Black Tea and Catechin in Green Tea Are Equally Effective Antioxidants. The Journal of Nutrition, 2001，131 (9): 2248-2251.)纯化制备。同 时中国专利（CN 102286565 B)公开了种制备茶黄素单没食子酸酯的方法，是以漆酶为酶源 在乙酸乙酯与水组成的双水相中完成的催化反应，并最终以4-甲基-2-戊酮作为萃取剂酯 相萃取制备。纤维素类填料可作为天然产物的分离富集手段应运于叶绿素（杨善元.用微 晶纤维素柱层析法分离纯化叶绿素a、b.植物生理学通迅，1983，（2) : 45-47.)和核糖 核酸（贾成禹，窦永泽，余路，李筱平.微晶纤维素柱层析分离纯化鸡mRNA.四川动 物，（3): 28-30.)的制备。纤维素类分离介质在茶多酚中的富集集应用已有相关科学报 道，本发明首先通过微晶纤维素及其衍生物低取代羟丙基纤维素作为分离和纯化手段富集 含苯骈罩酚酮结构的茶黄素类成分，并进一步以Sephadex LH-20凝胶获取茶黄素双没食子 酸酯。本发明利用常规的"绿色"且生态友好型材质，通过特定的洗脱方式，来达到纯化的 目的。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种以微晶纤维素、低取代度羟丙基纤维素及Sephadex LH-20凝胶纯化制备具有苯骈罩酚酮结构化合物及其单体的方法（图2)。本发明提供的一 种具有苯骈罩酚酮结构化合物的纯化方法，包括： 一种具有苯骈罩酚酮结构化合物的纯化方法，包括： (1) 用含醋酸和乙醇的水溶解含有目标产物的粗品，过滤，得溶解液； (2) 将步骤（1)的溶解液吸附于微晶纤维素； (3) 用10 % (v/v)以下的乙醇洗脱，收集洗脱液； (4) 将步骤（3)的洗脱液在减压条件下吸附于低取代羟丙基纤维素； (5) 用35 % (v/v)以下的乙醇在减压条件下进行洗脱； (6) 用45-65 % (v/v)的乙醇在减压条件下进行洗脱，并收集目标产物洗脱液； (7) 浓缩步骤（6)的目标产物洗脱液，获得浓缩液； (8) 向步骤（7)的浓缩液中加入乙酸乙酯，充分振荡萃取，静置分层后，得乙酸乙酯 萃取液； (9) 浓缩并干燥步骤（7)的乙酸乙酯萃取液，得纯化制品； (10) 以含磷酸二氢钾和乙醇的水溶解步骤（9)中的纯化制品，得纯化制品溶解液； (11) 将步骤（10)的纯化制品溶解液上样并吸附于SephadexLH-20凝胶； (12) 以低于15 % (v/v)乙酸乙酯的水（保持50 mmol/L以下的磷酸二氢钾和20 %( v/v)的乙醇在水中浓度不变）梯度洗脱，收集含目标单体化合物的洗脱液； (13) 浓缩步骤（12)的含目标单体化合物的洗脱液，得浓缩液； (14) 向步骤（13)的浓缩液中加入乙酸乙酯，充分振荡萃取，静置分层后，得乙酸乙 酯萃取液； (15) 将步骤（14)的乙酸乙酯萃取液和水充分振荡，静置分层后，留取乙酸乙酯萃取 液； (16) 浓缩步骤（15)的萃取液；和 (17) 任选地干燥步骤（16)的产品，得目标单体化合物。
[0005] 优选地，其中步骤（1)中所述的含醋酸和乙醇的水中，醋酸含量< 0.05 % (v/ v)，乙醇含量彡10 % ( v/v)。
[0006] 优选地，其中步骤（1)中所述的醋酸和乙醇含量分别为0.05 % (v/v)和5 %( v/v) 〇
[0007] 优选地，其中步骤（1)中所述的含有目标产物的粗品来源于红茶提取物、茶鲜叶 或茶多酚中的茶儿茶素经多酚氧化酶酶促氧化而得的提取物。
[0008] 优选地，其中步骤（4)中所述的低取代羟丙基纤维素，其羟丙基的取代度为 7-16〇
[0009] 优选地，其中步骤（4)、（5)和（6)中所述的减压真空度在-0.02 MPa~ _0. 03 MPa下进行。
[0010] 优选地，其中步骤（7)、（9)、（13)和（16)在真空度-0.07 MPa~-0? 1 MPa 和温度50 °C以下进行。
[0011] 优选地，其中步骤（10)中所述的磷酸二氢钾和乙醇的水中，磷酸二氢钾含量< 50 mmol/L，乙醇含量 < 20 %( v/v)。
[0012] 优选地，其中步骤（15)中加水洗涤2-3次，以去除残留的磷酸二氢钾。
[0013] 有益效果 本发明所采用常规的微晶纤维素和低取代羟丙基纤维素，具有价格廉价和环境友好的 特点，所富集的产品安全可靠，适合当前产业的发展趋势。另外，通过微晶纤维素和低取代 羟丙基纤维素可有效脱除强吸附性的天然有机化合物，从而可以避免在后续分离其中单体 时样品中非目标物污染S印hadex LH-20凝胶。
【附图说明】
[0014] 图1是四种主要的茶儿茶素结构示意图。
[0015] 图2是纯化的技术路线示意图。
[0016] 图3从上至下分别是粗品、纯化制品及S印hadex LH-20凝胶分离的目标单 体化合物的高效液相色谱图，其中图中1，2,3,4分别代表茶黄素（Theaflavin，TF)、 茶黄素-3-单没食子酸酯（Theaf lavin3-gallate，TF-3-G)、茶黄素-3 '-单没食 子酸酯（Theaflavin-3' -gallate，TF-3' -G)、茶黄素 _3,3'-双没食子酸酯 (Theaflavin-3, 3r -digallate, TF-3, 3r -G) 〇
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例，更进一步阐述本发明的主旨。
[0018] 下述实施例用来解释而非限制本发明，在本发明的精神和权利要求前提下，对本 发明作出的任何修改均被认为落入本发明的保护范围。
[0019] 下述实施例中目标产物的分析采用高效液相色谱法。Waters高效液相色谱 仪（1525栗、柱温箱、2487紫外可见双通道检测器、717-plus自动进样器、价從说控制 软件包），色谱柱为 Phenomenex Luna 5 Mm Phenyl-Hexyl, 250 mm X 4. 6 mm，柱温 为35 °C，检测波长为278 nm，进样量10 ML。采用双相梯度洗脱的方式，其中A相为水相 (含2 %的醋酸和9 %的乙腈，v/v)，B相为有机相（含2 %的醋酸和80 %的乙腈，v/v); 梯度为 〇 至 2 min (100 % A) - 2 至 7 min (85 % A) - 7 至 27 min (85 % A) - 27 至 28 min (70 % A) - 28 至 38 min (70 % A) - 38 至 39 min (100 % A) - 39 至 45 min (100 % A)。同浓度的粗品和纯化制品的高效液相色谱分析如图3所示，其中茶黄 素（Theaflavin, TF)、茶黄素-3-单没食子酸酯（Theaflavin3_gallate, TF-3-G)、茶黄 素-3^ -单没食子酸酯（Theaflavin-3^ -gallate, TF-3' -G)、茶黄素-3,3^ -双没食 子酸酯（Theaflavin-3,3' -digallate, TF-3,3' -G)在各样品中的积分面积如表1所示。
[0020] 表1粗品和纯化制品中各单体成分的高效液相色谱峰积分面积
下述实验例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021] 实施例 准确称取含目标产物的粗品6 g置于烧杯中，加入300 mL的水（含0.05 % (v/v)的 醋酸和5 % (v/v)的乙醇），充分搅拌溶解，过滤以去除不溶物，得溶解液；将溶解液，在常 压下，上样于装有60 g微晶纤维素的玻璃柱（7 cm X 100 cm)，并收集以10 % (v/v)以 下的乙醇常压洗脱至接近无色为止的洗脱液3 L。
[0022] 将上述的3 L洗脱液在减压条件下（-0.02 MPa~-0.03 MPa)吸附于50 g低取 代羟丙基纤维素，用35 % (v/v)以下的乙醇在减压条件下进行洗脱后，接着收集用45-65 % (v/v)的乙醇在减压条件下（-0.02 MPa~-0.03 MPa)进行洗脱的洗脱液3.5 L，并在 真空度-0.07 MPa~-0.1 MPa和温度50 °C以下进行浓缩，同时回收乙醇，得浓缩液。
[0023] 向浓缩液中加入等体积的水饱和乙酸乙酯，充分振荡萃取，静置分层后，得乙酸乙 酯萃取液；并在真空度-0.07 MPa~-0.1 MPa和温度50 °C以下进行浓缩，同时回收乙酸 乙酯，得含目标产物的纯化制品1 g。
[0024] 以含有低于50 mmol/L的磷酸二氢钾和20 % ( v/v)的乙醇水溶解纯化制品， 并上样和吸附于Sephadex LH-20凝胶柱（1. 5 cm X 100 cm)。进一步以低于15 % (v/ v)乙酸乙酯的水（保持50 mmol/L以下的磷酸二氢钾和20 %( v/v)的乙醇在水中浓度 不变）梯度洗脱，梯度洗脱会出现明显的三条条带，根据条带及高效液相色谱检测结果，收 集含目标单体化合物的洗脱液。在真空度-0.07 MPa~-0.1 MPa和温度50 °C以下浓缩 含目标单体化合物的洗脱液，得浓缩液，并向浓缩液中加入等体积的乙酸乙酯，充分振荡萃 取，静置分层后，得乙酸乙酯萃取液；收集的乙酸乙酯萃取液进一步和水充分振荡，静置分 层后，留取乙酸乙酯萃取液，重复2-3次，以去除残留的磷酸二氢钾，浓缩并干燥得目标产 物单体，其中的单体之一的高效液相色谱检测结果见图3。
【主权项】
1. 一种具有苯骈罩酚酮结构化合物的纯化方法，包括： (1) 用含醋酸和乙醇的水溶解含有目标产物的粗品，过滤，得溶解液； (2) 将步骤（1)的溶解液吸附于微晶纤维素； (3) 用10 % (v/v)以下的乙醇洗脱，收集洗脱液； (4) 将步骤（3)的洗脱液在减压条件下吸附于低取代羟丙基纤维素； (5) 用35 % (v/v)以下的乙醇在减压条件下进行洗脱； (6) 用45-65 % (v/v)的乙醇在减压条件下进行洗脱，并收集目标产物洗脱液； (7) 浓缩步骤（6)的目标产物洗脱液，获得浓缩液； (8) 向步骤（7)的浓缩液中加入乙酸乙酯，充分振荡萃取，静置分层后，得乙酸乙酯 萃取液； (9) 浓缩并干燥步骤（7)的乙酸乙酯萃取液，得纯化制品； (10) 以含磷酸二氢钾和乙醇的水溶解步骤（9)中的纯化制品，得纯化制品溶解液； (11) 将步骤（10)的纯化制品溶解液上样并吸附于SephadexLH-20凝胶； (12) 以低于15 % (v/v)乙酸乙酯的水（保持50 mmol/L以下的磷酸二氢钾和20 %( v/v)的乙醇在水中浓度不变）梯度洗脱，收集含目标单体化合物的洗脱液； (13) 浓缩步骤（12)的含目标单体化合物的洗脱液，得浓缩液； (14) 向步骤（13)的浓缩液中加入乙酸乙酯，充分振荡萃取，静置分层后，得乙酸乙 酯萃取液； (15) 将步骤（14)的乙酸乙酯萃取液和水充分振荡，静置分层后，留取乙酸乙酯萃取 液； (16) 浓缩步骤（15)的萃取液；和 (17) 任选地干燥步骤（16)的产品，得目标单体化合物。2. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（1)中所述的含醋酸和乙醇的水中，醋酸含量 彡 0.05 % (v/v)，乙醇含量彡 10 % ( v/v)。3. 如权利要求2所述的方法，其中步骤（1)中所述的醋酸和乙醇含量分别为0. 05 % (v/v)和 5 %( v/v) 〇4. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（1)中所述的含有目标产物的粗品来源于红 茶提取物、茶鲜叶或茶多酚中的茶儿茶素经多酚氧化酶酶促氧化而得的提取物。5. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（4)中所述的低取代羟丙基纤维素，其羟丙基 的取代度为7-16。6. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（4)、（5)和（6)中所述的减压真空度 在-0.02 MPa ~-0.03 MPa 下进行。7. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（7)、（9)、（13)和（16)在真空度-0.07 MPa~-0.1 MPa和温度50 °C以下进行。8. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（10)中所述的磷酸二氢钾和乙醇的水中，磷 酸二氢钾含量< 50 mmol/L，乙醇含量< 20 %( v/v)。9. 如权利要求1所述的方法，其中步骤（15)中加水洗涤2-3次，以去除残留的磷酸二 氢钾。
【文档编号】C07D311/62GK105985307SQ201510084246
【公开日】2016年10月5日
【申请日】2015年2月16日
【发明人】涂云飞, 杨秀芳, 张士康, 朱跃进, 谭蓉, 王静
【申请人】中华全国供销合作总社杭州茶叶研究所