一种全细胞生物催化制备手性(s)-乙偶姻的方法
【专利摘要】本发明公开了一种全细胞生物催化制备手性(S)?乙偶姻的方法，包括以下步骤：首先将丁二酮还原酶基因以及甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达，得到重组大肠杆菌；然后以所述重组大肠杆菌休止细胞为全细胞生物催化剂，丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为辅酶NADH再生的氢供体，在水相中不对称还原反应生成(S)?乙偶姻。本发明利用细胞本身完整的辅酶再生系统，只需要添加适量的甲酸或甲酸盐作为氢供体，提高菌体的转化能力，不需要添加昂贵的辅酶NADH，(S)?乙偶姻产量可高达46.1 g/L，工艺简单高效，生产成本低，解决了传统生物转化效率低以及成本高的问题，具有极高的经济价值，适于规模化商业应用。
【专利说明】
一种全细胞生物催化制备手性(S)-乙偶姻的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物化工领域，具体涉及一种全细胞生物催化剂制备手性(s)-乙偶姻 的方法。
【背景技术】
[0002] 乙偶姻(acetoin)具有明显的奶酪香、脂香特征，天然地存在于玉米、葡萄、苹果、 草莓、黄油、干酪、酒类、可可等各类食品中，国家标准GB2760-86规定其为允许添加食用的 食品香料。乙偶姻主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生产。此外，乙偶姻是一种重要 的化学合成中间体，美国能源部将乙偶姻列为30种优先开发利用的平台化合物之一，可广 泛应用于食品、制药、化工等领域。乙偶姻存在（S)-乙偶姻和(R)-乙偶姻两种旋光异构体， 天然微生物发酵产生的都是（S)-乙偶姻和(R)-乙偶姻的旋光异构体混合物。手性乙偶姻 (即单一构型的旋光异构体）除了具有旋光异构体混合物上述应用之外，还具有特殊的用 途，例如用于合成手性药物和液晶复合材料【Lett. Appl.Microbiol.，2013,57:274-281; Bioresource Techno1.,2013,137:111-115；Bioresource Technol·，2011，10741-10744; PLoS ONE,2010,5:e8860；Crit.Rev.Microbiol.,2007,33,127-140；Biotechno1.Adv., 2011，29,351-364】。
[0003] 手性乙偶姻的生产方法主要分为两类:化学法与生物法。化学法合成过程繁琐，最 后还需要进行工艺复杂的手性拆分，存在成本高、收率低、光学纯度低、高能耗、高污染的问 题，且原料来源于不可再生的化石资源一一石油，原料来源受到限制。生物法是一种十分具 有发展前景的环境友好合成方法，近年来受到了越来越多的关注。然而，常规生物发酵法获 得的都是旋光异构体混合物，手性拆分成本较高，而纯酶催化法需要破碎细胞和分离纯化 酶，而且需要加入昂贵的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶NADPH)或者还原型烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶NADH)，成本较高。
[0004] 全细胞生物催化的本质是利用细胞内的酶进行催化，综合了发酵法和酶法催化这 两种技术的优点，并克服了发酵法和酶法存在的诸多缺点，具有高立体选择性，不需要添加 外源性辅酶、破碎细胞和分离纯化酶，因此近年来更多的被应用于高值化合物合成。2013 年，Gao等在大肠杆菌中表达Gluconobacter oxydans的幾基还原酶和Bacillus Subtills 的葡萄糖脱氢酶，利用纯化后的羧基还原酶和葡萄糖脱氢酶进行催化反应，当添加辅酶 NADPH时，（S)-乙偶姻产量为 12 · 2g/L【Bioresource Technology; 2013，（ 137): 111-115】；该 研究使用的是纯酶作为催化剂，没有使用全细胞催化系统。2014年，谢能中等公开了利用辅 酶再生系统，构建丁二酮还原酶和葡萄糖脱氢酶基因共表达系统生产（S)-乙偶姻的方法， 具体是将 Paenibacillus polymyxa的丁二酮还原酶基因（dar)和 Bacillus subtil is的葡 萄糖脱氢酶基因（gdh)在大肠杆菌中共表达，并以此重组大肠杆菌休止细胞为生物催化剂， 以丁二酮和葡萄糖为底物，生产手性(S)-乙偶姻【中国专利申请CN104087601A】。该发明工 艺简单高效，（S)-乙偶姻的光学纯度高，但产量还是偏低，仅28g/L。
[0005] 经过广泛的文献和专利检索，我们发现迄今为止尚未有同时将丁二酮还原酶基因 和甲酸脱氢酶基因导入大肠杆菌中进行共表达，并以此重组菌株制备全细胞催化剂实现
[5] -乙偶姻合成与辅酶NADH再生相偶联的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，在现有技术的基础上，优化还原酶和脱氢酶的共 表达系统的组成，提高辅酶再生能力，在较高的光学纯度下，显著提高（S)_乙偶姻的产量， 并保持工艺简单高效的特点，从而使成本大幅降低。
[0007] 本发明提出了一种引入甲酸脱氢酶协同丁二酮还原酶共表达生产（S)-乙偶姻的 新方法，技术方案具体是:一种全细胞生物催化剂制备手性(S)-乙偶姻的方法，首先将丁二 酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因导入大肠杆菌中进行共表达，得到重组大肠杆菌;然后以 所述重组大肠杆菌休止细胞为全细胞生物催化剂，丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为辅酶 NADH再生的氢供体，在水相中不对称还原反应生成（S)-乙偶姻，实现手性(S)-乙偶姻的高 效低成本合成。
[0008] 本发明是利用丁二酮还原酶可以催化丁二酮不对称还原生成手性(S)-乙偶姻，以 及甲酸脱氢酶能够实现胞内辅酶NADH再生的性质，将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因 导入大肠杆菌中进行共表达，使重组大肠杆菌的休止细胞具有同步还原丁二酮和再生辅酶 NADH的能力，并将其作为全细胞催化剂实现手性(S)-乙偶姻的高效低成本生产。
[0009] 其中，所述丁二酮还原酶基因可来源于肠杆菌属（Enterobacter)、红球菌属 (Rhodococcus)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、类芽抱杆菌(Paenibacillus)、芽抱杆菌属 (Bacillus)和沙雷菌属（Serratia);所述甲酸脱氢酶基因可来源于酵母属 (Saccharomyces )、假单胞菌属（Pseudomonas )、毕赤酵母属（Pichia)和假丝酵母属 (Candida)〇
[0010] 进一步的，所述丁二酮还原酶基因来源菌株优选Enterobacter cloacae、 Rhodococcus erythropolis或Klebsiella pneumoniae ;甲酸脱氢酶基因来源菌株优选 Saccharomyces cerevisiae。
[0011] 进一步，所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述丁二酮还原 酶基因的核苷酸序列如SEQIDN0.3、SEQIDN0.4或SEQIDN0.5所示。
[0012] 上述的重组大肠杆菌是采用常规（参考科学出版社出版的《精编分子生物学指 南》）的方法将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因同时插入表达质粒并转化到大肠杆菌 (优选大肠杆菌E.coli BL21 (DE3))中，然后经筛选获得。
[0013]所述用于构建含丁二酮还原酶基因的大肠杆菌表达载体的出发载体可以是pET-22b、pET-28a、pET-32、pETDuet-l或pTrc99a。重组大肠杆菌含有异源的丁二酮还原酶和甲 酸脱氢酶基因，为革兰氏阴性菌，需氧或兼性厌氧生长，较佳培养温度为37 °C，其休止细胞 可用于催化丁二酮生产手性(S)-乙偶姻。
[0014] 更具体的，本发明所述全细胞生物催化制备手性(s)-乙偶姻的方法，包含以下步 骤：
[0015] (1)重组大肠杆菌:将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共 表达，得到重组大肠杆菌；
[0016] (2)平板培养:将步骤(1)所得的重组大肠杆菌划线到含有琼脂和筛选抗生素的LB 平板培养基上，37 °C过夜培养；
[0017] (3)种子培养:在超净台用牙签挑取步骤(2)平板上的一个单菌落，然后接种到含 有筛选抗生素的LB液体培养基中，37 °C培养6~12h;
[0018] (4)诱导培养:在无菌条件下，取步骤(3)所得的种子培养液接种到含有筛选抗生 素的LB液体培养基中，25~40°C培养1~5h，然后再加入终浓度为0.1~2mM的IPTG，16~30 °C诱导10~20h，得到诱导培养物；
[0019] (5)收集菌体:将步骤(4)所得的诱导培养物于转速为5,000~8,000印111的条件下 离心5~15min，分离得到菌体沉淀;将所述菌体沉淀用生理盐水洗涤2~3遍，然后悬浮于pH =6~8的缓冲液中，得到重组大肠杆菌全细胞生物催化剂；
[0020] (6)转化反应制备手性(S)-乙偶姻:取步骤(5)得到的细胞干重浓度为1~20g/L的 重组大肠杆菌全细胞生物催化剂，在16~42°C、pH=6~9,50~200rpm条件下对底物进行转 化;所述底物为丁二酮，其转化初始浓度为5~25g/L，同时加入与底物丁二酮同等摩尔浓度 的甲酸或甲酸盐以补充反应所需辅酶NADH的消耗;整个转化反应过程中，通过间隔补料使 反应体系中的丁二酮浓度维持在5~25g/L之间，甲酸或甲酸盐浓度维持与丁二酮相同的摩 尔浓度，当（S)-乙偶姻的浓度不再增加时，停止转化。
[0021] 其中，上述步骤(2)~（4)中所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉， 10g/L NaCl，LB固体培养基包含15g/L琼脂，121°C条件下灭菌15min。
[0022 ]步骤(5)所述缓冲液为磷酸钾缓冲液。
[0023] 步骤(6)所述重组大肠杆菌全细胞生物催化剂的细胞干重浓度为3~15g/L，转化 反应温度为20~37°C;所述底物转化初始浓度为10~20g/L，补料反应中维持底物浓度在10 ~20g/L之间。
[0024] 作为上述方法的进一步说明，所述甲酸盐选自甲酸钠、甲酸钾。
[0025] 通过本发明方法，实现了在大肠杆菌中共表达丁二酮还原酶和甲酸脱氢酶，并以 此重组大肠杆菌休止细胞为全细胞生物催化剂，丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为辅酶NADH 再生的氢供体，高效低成本的生产手性(S)-乙偶姻。
[0026]本发明具有以下优点：
[0027] (1)本发明调整了还原酶和脱氢酶的共表达系统的组成，提高了辅酶再生能力，提 供了一种优化的引入甲酸脱氢酶协同丁二酮还原酶共表达生产(S)-乙偶姻的新方法。 [0028] (2)本发明（S)-乙偶姻产量可达46. lg/L，相比葡萄糖酸脱氢酶和丁二酮还原酶共 表达方法28g/L的产量提高了64.2%，取得了显著效果。
[0029] (3)本发明菌株要求的培养基简单、成本低，利用全细胞作为生物催化剂进行转 化，不需要破碎细胞和分离纯化酶，操作过程简单，不需要添加昂贵的辅酶NADH，产物分离 方便，也不需要复杂的手性拆分步骤，技术水平领先，工艺简单高效，生产成本低，具有极高 的技术经济价值。
【附图说明】
[0030] 图1是标准品的气相色谱图谱。其中A为(R)-乙偶姻，B为(S)-乙偶姻，C为(S，S)-2， 3-丁一醇，D为(R，R) -2，3-丁 一醇，E为meso-2，3-丁 一醇。
[0031] 图2是重组大肠杆菌全细胞催化合成(S)-乙偶姻的气相色谱图谱。
【具体实施方式】
[0032]以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，本实施例仅是对本发明作更 清楚的说明，而不是对本发明的限制。
[0033]以下实施例中所述的LB培养基配方为：10g/L蛋白胨，5gAJ孝母粉，10g/L NaCl， 121°C条件下灭菌15min。
[0034] 实施例1
[0035] 本实施通过对比试验来证实本发明甲酸脱氢酶协同丁二酮还原酶共表达生产 (S)-乙偶姻的新方法在生产效率、产量、光学纯度方面均优于葡萄糖脱氢酶共表达系统。 [0036] 1、重组大肠杆菌的制备
[0037] 将来源于5&(^11&1'01115^68 06代￥丨8丨&6的甲酸脱氢酶基因 €(111和来源13.811131：；[118 168的葡萄糖脱氢酶基因 gdh，经过密码子优化后进行人工合成，并将其克隆到表达载体 pETDuet-1 上，获得了重组质粒pETDuet-f dh和pETDuet-gdh。将来源于Enterobacter cloacae的丁二酮还原酶基因 bdh，经过密码子优化后人工合成，并将其分别克隆到质粒 pETDuet-1、pETDuet-gdh 和pETDuet-f dh 上，获得了重组质粒 pETDuet-bdh、pETDuet_bdh-gdh和pETDuet-bdh-fdh，将其转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)感受态细胞，可得到重组大 肠杆菌E · coli BL21 (DE3)/pETDuet_bdh、E · coli BL21 (DE3)/pETDuet_bdh-gdh和E · coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh。经人工合成密码子优化的甲酸脱氢酶基因 fdh、葡萄糖脱氢 酶基因 gdh和丁二酮还原酶基因 bdh的核苷酸序列如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID NO. 3所示。
[0038] 2、重组大肠杆菌休止细胞的制备，包括如下步骤：
[0039] (1)平板培养：将重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh、E.coli BL21 (DE3)/pETDuet-bdh-gdh和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh分别划线到含有质量体积 比为1.8 %琼脂和含有100yg/mL氨苄青霉素的LB平板培养基上，37 °C过夜培养8~12h;
[0040] (2)种子培养:在无菌的超净台条件下，用牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落， 然后接种到20mL的含有100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养6~12h;
[0041] (3)诱导培养:在无菌条件下，取步骤(2)所得的液体种子以2%的接种量接种到含 有100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C培养2h，然后再加入终浓度为0.5mM的 IPTG，16°C诱导10h，停止培养，得到诱导培养物；
[0042] (4)收集菌体:将步骤(3)培养得到的诱导培养物于转速为8，000rpm的条件下离心 5min，分离得到菌体沉淀;将所得菌体沉淀用生理盐水洗涤2遍，然后悬浮于pH=7.0的磷酸 钾缓冲液中，得到重组大肠杆菌休止细胞，置于4°C的冰箱中保藏或者直接使用。
[0043] 3、生物催化合成手性(S)-乙偶姻
[0044] (1)取上述细胞干重浓度为4g/L的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh 和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-gdh休止细胞分别作为全细胞生物催化剂，在温度为30 °C、pH = 7.0的条件下，180rpm摇床震荡，对底物进行转化;所述底物为丁二酮，其转化初始 浓度为15g/L，同时加入与底物丁二酮等摩尔浓度的葡萄糖以提供反应所需辅酶NADH的消 耗；
[0045] (2)取上述细胞干重浓度为4g/L的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet- bdh-fdh休止细胞作为全细胞生物催化剂，在温度为30°C、pH = 7.0的条件下，180rpm摇床震 荡，对底物进行转化;所述底物为丁二酮，其转化初始浓度为15g/L，同时加入与底物丁二酮 等摩尔浓度的甲酸钠以提供反应所需辅酶NADH的消耗。
[0046] 待反应完全后，对转化液上清进行气相色谱分析测定(S)-乙偶姻的浓度及光学纯 度。（S)-乙偶姻光学纯度= [S]/([S] + [R])X100%。
[0047] 结果如表1所示，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh单基因表达，由于没有辅酶再生 系统持续提供NADH，（S)_乙偶姻的产量极低，仅 1.59g/L;E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-gdh与E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh相比较，后者不但在反应时间上缩短一半，（S)-乙偶姻产量提高近一倍，（S)_乙偶姻光学纯度也大幅提高。由此证实了本发明引入的甲酸 脱氢酶协同丁二酮还原酶共表达生产（S)-乙偶姻的新方法在生产效率、产量、光学纯度方 面均优于葡萄糖脱氢酶共表达系统。
[0048] 表l:E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-gdh和 E. co 1 i BL21 (DE3) /pETDuet-bdh-fdh作为全细胞催化剂催化合成手性(S)-乙偶姻
[0049]
[0050] 实施例2
[0051 ] 1、重组大肠杆菌的制备
[0052] 将来源于Rhodococcus erythropolis的丁二酮还原酶基因 adr，经过密码子优化 后人工合成，并将其克隆到实施例1所得重组质粒pETDuet-fdh上，获得了重组质粒 pETDuet-adr-fdh，将其转化大肠杆菌E. col i BL21 (DE3)感受态细胞，得到重组大肠杆菌 E.coli BL21 (DE3)/pETDuet-adr-fdh。人工合成密码子优化的Rhodococcus erythropolis 丁二酮还原酶基因 adr的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0053] 2、重组大肠杆菌休止细胞的制备，包括如下步骤：
[0054] (1)平板培养：将重组大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)/pETDuet-adr-fdh划线到含有 质量体积比为1.8%琼脂和含有100yg/mL氨苄青霉素的LB平板培养基上，37°C过夜培养；
[0055] (2)种子培养:在无菌的超净台条件下，用牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落， 然后接种到20mL的含有100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养10h;
[0056] (3)诱导培养:在无菌条件下，取步骤(2)所得的液体种子以2%的接种量接种到含 有100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养2.5h，然后再加入终浓度为0.5mM的 IPTG，16°C诱导10h，停止培养，得到诱导培养物；
[0057] (4)收集菌体:将步骤(3)培养得到的诱导培养物于转速为8，000rpm的条件下离心 5min，分离得到菌体沉淀;将所得菌体沉淀用生理盐水洗涤2遍，然后悬浮于pH=7.0的磷酸 钾缓冲液中，得到重组大肠杆菌休止细胞，置于4°C的冰箱中保藏或者直接使用。
[0058] 3、生物催化合成手性(S)-乙偶姻
[0059] 取上述获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-adr-fdh休止细胞作为 全细胞生物催化剂，在6g/L细胞干重、30°C、pH=7.0~9.0条件下，180rpm摇床震荡，对底物 进行转化;所述底物为丁二酮，其转化初始浓度为15g/L，同时加入等摩尔浓度的甲酸钠以 提供反应所需辅酶NADH的消耗;整个转化反应过程中，每隔2h取样，气相色谱法监测转化液 上清中丁二酮的浓度，间隔补加丁二酮和甲酸钠，使反应体系中丁二酮浓度维持在10~ 20g/L之间，甲酸钠浓度维持与丁二酮相同的摩尔浓度;同时气相色谱分析测定转化液上清 中（S)-乙偶姻的浓度及光学纯度，直到(S)-乙偶姻浓度不再增加，停止转化。
[0060] 以下实施例3~7的制备过程与实施例2基本一致，区别在于原料配比用量和工艺 参数的不同，因此，仅用列表说明，制备过程不再累述。
[0061]
[0062]停止转化后，通过气相色谱分析测定实施例2~7转化液上清(S)-乙偶姻的最终浓 度及光学纯度。结果列表如下：
[0064] 实施例8
[0065] 1、重组大肠杆菌的制备
[0066] 将来源于Saccharomyces cerevisiae的甲酸脱氢酶基因 fdh经过密码子优化后进 行人工合成，并将其克隆到表达载体pETDuet-Ι上，获得了重组质粒pETDuet-fdh。将来源于 Enterobacter cloacae的丁二酮还原酶基因 bdh，经过密码子优化后人工合成，并将其克隆 到质粒pETDuet-fdh上，获得了重组质粒pETDuet-bdh-fdh，然后将其转化大肠杆菌E·coli BL21(DE3)感受态细胞，可得到重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh。经人工 合成密码子优化的甲酸脱氢酶基因 fdh、丁二酮还原酶基因 bdh的核苷酸序列如SEQ ID N0.1、SEQIDN0.3K*。
[0067] 2、重组大肠杆菌休止细胞的制备，包括如下步骤：
[0068] (1)平板培养:将上述制备而得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh- fdh划线到含有质量体积比为1.8 %琼脂和含有100yg/mL氨苄青霉素的LB平板培养基上，37 °C过夜培养；
[0069] (2)种子培养:在无菌的超净台条件下，用牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落， 然后接种到20mL的含有100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养10h;
[0070] (3)诱导培养:在无菌条件下，取步骤(2)所得的液体种子以2%的接种量接种到含 有100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C培养2h，然后再加入终浓度为0.5mM的 IPTG，20 °C诱导15h，停止培养，得到诱导培养物；
[0071] (4)收集菌体:将步骤(3)培养得到的诱导培养物于转速为8,000rpm的条件下离心 5min，分离得到菌体沉淀;将所得菌体沉淀用生理盐水洗涤2~3遍，然后悬浮于pH=7.0的 磷酸钾缓冲液中，得到重组大肠杆菌休止细胞，置于4°C的冰箱中保藏或者直接使用。
[0072] 3、生物催化合成手性(S)-乙偶姻
[0073] 取上述获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh_fdh休止细胞作为 全细胞生物催化剂，在6g/L细胞干重、33°C、pH=6.5~8.5条件下，180rpm摇床震荡，对底物 进行转化;所述底物为丁二酮，其转化初始浓度为15g/L，同时加入等摩尔浓度的甲酸钠以 提供反应所需辅酶NADH的消耗;整个转化反应过程中，每隔2h取样，气相色谱法监测转化液 上清中丁二酮的浓度，间隔补加丁二酮和甲酸钠，使反应体系中丁二酮浓度维持在10~ 20g/L之间，甲酸钠浓度维持与丁二酮相同的摩尔浓度;同时气相色谱分析测定转化液上清 中（S)-乙偶姻的浓度及光学纯度直到(S)-乙偶姻浓度不再增加，停止转化。
[0074]以下实施例9~12的制备过程与实施例8基本一致，区别在于表达载体、原料配比 用量和工艺参数的不同，因此，仅用列表说明，制备过程不再累述。
[0076]停止转化后，通过气相色谱分析测定实施例8~12转化液上清（S)_乙偶姻的最终 浓度及光学纯度。结果列表如下：
[0078] 实施例14
[0079] 1、重组大肠杆菌的制备
[0080] 将来源于Saccharomyces cerevisiae的甲酸脱氢酶基因 fdh经过密码子优化后进 行人工合成，并将其克隆到表达载体pETDuet-Ι上，获得了重组质粒pETDuet-fdh。将来源于 Klebsiella pneumonia的丁二酮还原酶基因 budc，经过密码子优化后人工合成，并将其克 隆到质粒pETDuet-fdh上，获得了重组质粒pETDuet-budc-fdh，然后将其转化大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，可得到重组大肠杆菌E.coli BI^UDESVpETDuet-budc-fdh。经人工合成密码子优化的甲酸脱氢酶基因 fdh、丁二酮还原酶基因 budc 的核苷酸序列 如SEQIDN0·1、SEQIDN0·5所示。
[0081 ] 2、重组大肠杆菌休止细胞的制备，包括如下步骤：
[0082] (l)平板培养：将上述制备而得的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-budc-fdh划线到含有质量体积比为1.8%琼脂和含有10(^ 8/1^氨苄青霉素的1^平板培养基 上，37 °C过夜培养；
[0083] (2)种子培养:在无菌的超净台条件下，用牙签挑取步骤(1)平板上的一个单菌落， 然后接种到20mL的含有100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养10h;
[0084] (3)诱导培养:在无菌条件下，取步骤(2)所得的液体种子以2%的接种量接种到含 有100yg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37 °C培养3h，然后再加入终浓度为0.8mM的 IPTG，25 °C诱导12h，停止培养，得到诱导培养物；
[0085] (4)收集菌体:将步骤(3)培养得到的诱导培养物于转速为8,000rpm的条件下离心 5min，分离得到菌体沉淀;将所得菌体沉淀用生理盐水洗涤2~3遍，然后悬浮于pH=7.0的 磷酸钾缓冲液中，得到重组大肠杆菌休止细胞，置于4°C的冰箱中保藏或者直接使用。
[0086] 3、生物催化合成手性(S)-乙偶姻
[0087] 取上述获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-budc_fdh休止细胞作为 全细胞生物催化剂，在l〇g/L细胞干重、33 °C、pH = 7.0~8.0条件下，150rpm摇床震荡，对底 物进行转化;所述底物为丁二酮，其转化初始浓度为15g/L，同时加入等摩尔浓度的甲酸钠 以提供反应所需辅酶NADH的消耗;整个转化反应过程中，每隔2h取样，气相色谱法监测转化 液上清中丁二酮的浓度，间隔补加丁二酮和甲酸钠，使反应体系中丁二酮浓度维持在10~ 20g/L之间，甲酸钠浓度维持与丁二酮相同的摩尔浓度;同时气相色谱分析测定转化液上清 中（S)-乙偶姻的浓度及光学纯度直到(S)-乙偶姻浓度不再增加，停止转化。
[0088] 以下实施例15~19的制备过程与实施例14基本一致，区别在于表达载体、原料配 比用量和工艺参数的不同，因此，仅用列表说明，制备过程不再累述。
[0090]停止转化后，通过气相色谱分析测定实施例14~19转化液上清(S)_乙偶姻的最终 浓度及光学纯度。结果列表如下：
【主权项】
1. 一种全细胞生物催化制备手性（幻-乙偶姻的方法，其特征在于，将丁二酮还原酶基 因和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达，得到重组大肠杆菌；以所述重组大肠杆菌 休止细胞为全细胞生物催化剂，丁二酮为底物，甲酸或甲酸盐为辅酶NADH再生的氢供体，在 水相中不对称还原反应生成（幻_乙偶姻。2. 如权利要求1所述的全细胞生物催化制备手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，所述 丁二酮还原酶基因来源菌株选自7?ieroAacier c_/oacae、7?Aoc/ococct/s erjiArOjOoiis或 /wet/fficMiae;所述甲酸脱氢酶基因来源菌株是?SaccAaroffijces cererisiae。3. 如权利要求1或2所述的全细胞生物催化制备手性（幻-乙偶姻的方法，其特征在于， 所述甲酸脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述丁二酮还原酶基因的核苷酸 序列如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示。4. 如权利要求3所述的全细胞生物催化制备手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，所述 用于构建含丁二酮还原酶基因的大肠杆菌表达载体的出发载体选自pET-22b、pET-28a、 pET_32、pETDuet_l或pTrc99a。5. 如权利要求1、2、4任一所述的全细胞生物催化制备手性（幻-乙偶姻的方法，其特征 在于，所述方法包含如下步骤： (1) 重组大肠杆菌:将丁二酮还原酶基因和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中进行共表达， 得到重组大肠杆菌； (2) 平板培养:将步骤（1)所得的重组大肠杆菌划线到含有琼脂和筛选抗生素的LB平板 培养基上，37° C过夜培养； (3) 种子培养:在超净台用牙签挑取步骤(2)平板上的一个单菌落，然后接种到含筛选 抗生素的LB液体培养基中，37°C培养6~12 h; (4) 诱导培养:在无菌条件下，取步骤(3)所得的种子培养液接种到含筛选抗生素的LB 液体培养基中，25~40°C培养1~5 h，然后再加入终浓度为0.1~2 mM的IPTG，16~30°C诱 导10~20 h，得到诱导培养物； (5) 收集菌体:将步骤(4)所得的诱导培养物于转速为5,000~8,000印111的条件下离心 5~15 min，分离得到菌体沉淀;将所述菌体沉淀用生理盐水洗涤2~3遍，然后悬浮于pH=6 ~8的缓冲液中，得到重组大肠杆菌全细胞生物催化剂； (6) 转化反应制备手性（幻_乙偶姻：取步骤(5)得到的细胞干重浓度为1~20 g/L的重 组大肠杆菌全细胞生物催化剂，在16~42° C、pH=6~9，50~200 rpm条件下对底物进行转 化;所述底物为丁二酮，其转化初始浓度为5~25 g/L，同时加入与底物同等摩尔浓度的甲 酸或甲酸盐以补充反应所需辅酶NADH的消耗;整个转化反应过程中，通过间隔补料使反应 体系中的丁二酮浓度维持在5~25 g/L之间，甲酸或甲酸盐浓度维持与丁二酮相同的摩尔 浓度，当（幻-乙偶姻的浓度不再增加时，停止转化。6. 如权利要求5所述的全细胞生物催化制备手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，步骤 (5) 所述缓冲液为磷酸钾缓冲液。7. 如权利要求5所述的全细胞生物催化制备手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，步骤 (6) 所述重组大肠杆菌全细胞生物催化剂的细胞干重浓度为3~15g/L，转化反应温度为20 ~37°C;所述底物转化初始浓度为10~20 g/L，补料反应中维持底物浓度在10~20 g/L之 间。8.如权利要求5所述的全细胞生物催化制备手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，所述 甲酸盐选自甲酸钠、甲酸钾。
【文档编号】C12P7/26GK105969812SQ201610541952
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】谢能中, 李检秀, 黄日波, 黄艳燕, 杜奇石, 严少敏, 陈先锐, 刘祺霞
【申请人】广西科学院