簇毛麦nam-v1基因及其分子标记和应用
【专利摘要】本发明涉及簇毛麦NAM?V1基因及其分子标记和应用。本发明提供的来源于簇毛麦V染色体组的NAM?V1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。基因NAM?V1在小麦籽粒蛋白质积累方面发挥重要作用，并和小麦抗白粉病基因Pm21共分离，NAM?V1基因在高蛋白质和抗白粉病小麦新品种培育中具有潜在的应用价值。另外，本发明还提供用于特异检测NAM?V1基因的分子标记CauNAM?V1及其应用，该标记能够特异检测小麦品种中是否存在NAM?V1基因，还可以检测小麦材料中是否含有抗白粉病基因Pm21，可同时用作小麦高蛋白和抗白粉病筛选的分子标记。
【专利说明】
簇毛麦NAM-V1基因及其分子标记和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及簇毛麦NAM-V1基因及其 分子标记和应用。
【背景技术】
[0002] 小麦目前是全球第一大粮食作物，全世界约有35 %~40 %的人口将其作为主要的 食物来源，约占全球卡路里消费总量的20%，全球小麦年产量7亿吨左右，提供约7000万吨 的蛋白质。因此，增加小麦籽粒的蛋白含量不仅能够改良小麦的品质，而且有助于大幅度提 高食用蛋白质的总量。小麦籽粒蛋白含量(grain protein concentration，GPC)及其组成 决定着小麦的加工品质和营养品质。小麦的籽粒蛋白含量是典型的数量性状，而且容易受 到环境条件的影响(Groos et al.，2003)。2006年，1^1^等通过图位克隆获得了控制蛋白含 量的基因 NAM-B1，该基因位于小麦6BS染色体上，编码一种NAC转录因子（Uauy et al.， 2006)。簇毛麦(Haynaldia ￥丨11〇83,211 = 21=14，￥基因组)属小麦族，为一年生或多年生异 株授粉二倍体植物。簇毛麦基因耐寒、分蘖力强、抗病、耐盐、抗旱和籽粒蛋白含量高等优良 特性，是小麦遗传改良的重要基因资源(G rqdzi e 1 e w ska, 2 0 0 6)。小麦-簇毛麦易位系是利 用簇毛麦优异基因资源的重要途径，例如，6VS · 6AL易位系携带抗白粉病基因 Pm21，对小麦 白粉病表现抗性强、抗谱广，育成的品种累计推广面积达到340万公顷(Cao et al.，2011)。 除了抗白粉病基因，在簇毛麦6VS染色体上还定位了副硫α-醇溶蛋白（Sulfur-richa-prolamins)基因 Gli_V2、抗条锈（Stripe rust)基因 Yr26等优异性状（Blanco et al·， 1991;Ma et al.，2001)。但是目前还没有簇毛麦中控制籽粒蛋白含量性状的基因报道。
[0003] 白粉病是一种严重影响小麦产量和品质的世界性病害，在各国小麦产区均有发 生。近二十年来，小麦白粉病发生的范围和面积不断扩大，危害程度日益加重，目前，小麦白 粉病已成为影响小麦产量的重要限制因素。小麦白粉病的病原菌为禾本科布氏白粉菌小麦 专化型，属子囊菌亚门真菌，该病菌具有多个生理小种，在不同地理生态环境中与寄主互作 过程中变异速度快，目前一些大面积生产应用的品种已经或正在丧失抗性，因此白粉病害 处于随时大面积流行的严重态势。农药防治对防控白粉病起到了一定的作用，但是会耗费 大量的人力和财力资源，不利用生态环境。利用现代生物技术，不断鉴定和挖掘小麦中的抗 白粉病基因或QTL位点，将抗白粉病基因或QTL位点通过分子基因工程或分子标记辅助选择 培育和推广抗病品种，是防治小麦白粉病最为安全、经济和有效的途径。目前已经鉴定的小 麦抗白粉病基因/位点有70多个，随着这些基因在小麦育种上的应用和推广，病原菌的生理 小种也发生了很大的变化。目前大部分的抗白粉病已经失去了抗性。抗白粉病基因 Pm21来 源于簇毛麦，Pm21抗国内所有的白粉病菌株及检测过的120个欧洲生理小种，是目前世界上 抗谱最广、抗性最稳定的抗白粉病基因 （Cao et al.，2011)，因此，开发与Pm21连锁的分子 标记对于小麦抗白粉病抗病育种具有重要意义。目前，在现有文献中小麦抗白粉病基因 Pm21的分子标记报道较少，而且大部分Pm21的分子标记是基于SDS-PAGE电泳的标记，使用 不方便，限制了抗白粉病基因 Pm21在小麦抗病育种中的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供簇毛麦NAM-V1基因，以及NAM-V1基因在增加小麦籽粒蛋白质 含量中的作用，并且证明在小麦中该基因与抗白粉病基因 Pm21共分离。
[0005] 本发明的另一目的是提供簇毛麦NAM-V1基因分子标记CauNAM-Vl及其应用，利用 该标记特异检测小麦品种中是否存在NAM-V1基因，还用于检测小麦材料中是否含有抗白粉 病基因 Pm21，同时用作小麦高蛋白和抗白粉病筛选的分子标记。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的簇毛麦NAM-V1基因，其为控制小麦籽粒蛋白 质含量的基因，利用该基因可提尚小麦轩粒的蛋白含量。
[0007] 簇毛麦NAM-V1基因的核苷酸序列为：
[0008] i)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或
[0009] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核昔酸序列;或
[0010] iii)在严格条件下与SEQ ID N0:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0011] iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。
[0012]本发明还提供由上述簇毛麦NAM-V1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0: 2所示。
[0013] 本发明还提供含有所述簇毛麦NAM-V1基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因 细胞系。
[0014] 本发明还提供所述簇毛麦NAM-V1基因，含有所述NAM-V1基因的表达盒、重组载体、 重组菌或转基因细胞系在提高作物蛋白含量中的应用。
[0015] 本发明中涉及的作物包括但不限于小麦、大麦、黑麦、燕麦、簇毛麦。
[0016] 携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和 Corey,1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0017] 例如，可将含有所述NAM-V1基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系通过 农杆菌介导、花粉管导入或基因枪的方法转入作物中，培育高籽粒蛋白含量的转基因作物。
[0018] 本发明还提供所述簇毛麦NAM-V1基因的分子标记CauNAM-Vl，用于特异性PCR扩增 该分子标记的引物为：正向引物F5 ' -TCCCCGGTATGCCATGTC-3 '和反向引物R5 ' -AAGATACCGCTAGACCGTGA-3，。
[0019] 本发明还提供所述分子标记CauNAM-Vl在检测作物中NAM-V1基因和/或Pm21基因 中的应用，
[0020] 本发明还提供所述分子标记CauNAM-Vl在小麦高蛋白含量和/或抗白粉病的分子 标记辅助育种中的应用。
[0021] 本发明还提供所述分子标记CauNAM-Vl在筛选和鉴定兼具高蛋白含量和抗白粉病 的小麦新品种中的应用。
[0022]本发明还提供用于检测作物中NAM-V1基因和/或Pm21基因的引物，包括正向引物 F5 ' -TCCCCGGTATGCCATGTC-3 ' 和反向引物R5 ' -AAGATACCGCTAGACCGTGA-3 '。
[0023]本发明进一步提供含有所述引物F和R的检测试剂盒。
[0024] 本发明从簇毛麦V染色体中克隆获得一个小麦NAM家族基因，命名为NAM-V1，该基 因全长1528bp，具有完整的开放阅读框，包括3个外显子和2个内含子，在小麦6VS · 6AL易位 系中NAM-V1基因替换NAM-A1基因后提高了籽粒蛋白的含量，说明NAM-V1基因能够提高小麦 籽粒的蛋白质含量。根据NAM-V1基因的核苷酸序列，开发出特异检测NAM-V1基因的分子标 记CauNAM-Vl，在小麦6VS · 6AL易位系的分离群体中证明该标记和小麦抗白粉病基因 Pm21 共分离，证明该标记可同时检测NAM-V1基因和Pm21基因。因此，利用NAM-V1基因能够提高小 麦籽粒的蛋白含量。利用CauNAM-Vl标记能同时检测小麦的抗白粉病基因 Pm21，该标用于小 麦的分子育种，能够筛选和获得兼具高蛋白和抗白粉病的小麦新品种。
[0025] 本发明具有以下优点：
[0026] ( - )小麦是世界上最重要的粮食作物之一，全球小麦年产量约7亿吨，如果小麦籽 粒蛋白含量增加1 %，相当于全球小麦蛋白含量增加700万吨。本发明的NAM-V1基因对小麦 籽粒蛋白质含量的贡献率最高超过了 1%，因此，NAM-V1基因对于增加全球的食用蛋白质供 应具有重要意义。
[0027] (二）小麦抗白粉病基因 Pm21是目前世界上抗谱最广、抗性最稳定的抗白粉病基 因，此前开发的抗白粉病基因 Pm21的标记大多是基于SDS-PAGE电泳技术的标记，操作过程 中制胶、染色步骤复杂，并且丙烯酰胺、TEMED等对人体具有很高的毒性。本发明的CauNAM-VI标记是基于琼脂糖电泳的标记，检测方法较为简单，可使用新型的核酸染料进行染色，更 加安全、实用。对于充分利用Pm21抗白粉病基因资源，促进小麦抗病育种具有重要意义。 [0028](三)本发明提供的CauNAM-Vl标记可同时检测控制小麦籽粒蛋白含量的基因 NAM-VI和抗白粉病基因 Pm21，即一个标记同时选择两种性状，对于提高小麦分子育种的效率，实 现多性状的聚合育种具有重要的意义。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明实施例1中对克隆获得的簇毛麦NAM-V1基因的电泳检测结果以及基 因结构分析结果;其中，a: NAM-V1基因组和cDNA的克隆;b: NAM-V1基因结构分析;c: NAM-V1 基因保守域预测。
[0030] 图2为本发明实施例2中构建的簇毛麦NAM-V1基因的系统进化树;其中，物种缩写： 山羊草(Aet)，硬粒小麦(Tt)，大麦(Hv)，水稻(Os)，拟南芥(At)，提莫非维小麦(G)。
[0031 ]图3为本发明实施例3中NAM家族基因序列比对结果及CauNAM-Vl分子标记的位置。 [0032]图4为本发明实施例4中分子标记CauNAM-Vl在不同小麦品种中的扩增情况。
[0033]图5为本发明实施例5中小麦抗白粉病基因 Pm21分离群体的表型分析结果。
[0034]图6为本发明实施例5中分子标记CauNAM-Vl在小麦Pm21分离群体中的扩增情况。 [0035]图7为本发明实施例6中NAM-V1基因调控小麦籽粒蛋白含量的效果。
【具体实施方式】
[0036]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，以下实 施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验 条件;所用原料均为市售商品。
[0037] 实施例1簇毛麦NAM-V1基因的克隆
[0038] 根据NCBI上公布的NAM-A1 (DQ869672)、NAM-D1 (DQ869675)、NAM-B1 (DQ869673)、 NAM-B2(DQ869676)、NAM-D2(DQ869677)基因的序列信息，设计两对克隆NAM基因完整编码区 的引物NAM0RF1和NAM0RF2，正向引物包括起始密码子，反向引物包括终止密码子。分别以簇 毛麦的基因组DNA和cDNA为模板，用引物对NAM0RF1和NAM0RF2进行PCR扩增。PCR反应体系 为：模板DNA3yl，正、反向引物各ΙμL，dNTP( 10mM)0.4μ1，高保真Taq DNA聚合酶（5UAU) 0.2ul，10 X PCR反应缓冲液2μ1，加 ddH20补足20μ1后混匀。PCR反应条件为：94°C3min; 94°C 3〇8,6〇1€3〇8,721€21^11，共33个循环;72 1€71^11，16°(：结束反应。？0?反应结束后，以1%琼脂 糖电泳检测扩增结果。电泳结果表明，从基因组DNA和cDNA中分别扩增得到了长度为1.5kb 和1.2kb左右的目的条带（图la)。将目的条带回收后连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌感 受态细胞。切胶回收目的DNA，连接到克隆载体(pMDl 8-T)上进行DNA序列的测定。将测序结 果和NCBI中已知基因（蛋白）进行BlastN(BlastXP)比对分析，结果表明该基因编码NAC转录 因子，是已报道的野生二粒小麦的NAM-B1基因，普通小麦的祖1^1、01、02、82的同源基因， 但序列差别较大，由于来源于簇毛麦的V染色组，因此命名为NAM-V1基因。NAM-V1基因全长 1528bp，包括3个外显子和2个内含子（图lb)。开放阅读框全长1224bp，编码407个氨基酸，预 测分子量为43kDa，等电点为8.39。NCBI的CDD预测表明NAM-V1蛋白的N端编码一个NAM_ superfamily的保守结构域（图lc) 〇
[0039] 表1引物序列信息
[0040]
[0041 ]实施例2簇毛麦NAM-V1基因的遗传进化分析
[0042] 利用比对软件ClustalW 1.83对簇毛麦的NAM-V1和小麦、拟南芥、水稻等植物的 NAC蛋白进行多序列同源比对，输出的文件通过B0XSHADE 3.21进行着色。采用Mega 4软件 中的邻位相连法(Neighbor-joining)构建系统进化树。对簇毛麦NAM-V1的编码蛋白与其他 物种中同源NAC蛋白进行系统进化树分析，结果如图2所示。不同来源的NAC蛋白分成了 4类 (Group)。其中簇毛麦NAM-V1属于Group I，Group I还包括水稻的NAC4,硬粒小麦的TtNAM-B1(6B染色体）、TtNAM-B2(2B染色体）和TtNAM-Al(6A染色体），山羊草的AetNAM-D2(2D染色 体)和AetNAM-Dl(6D染色体），大麦的NAM-1和NAM-2(H基因组），提莫非维小麦的NAM-G(G基 因组）。其中来源于簇毛麦的NAM-V1和来源于小麦A、D、B亚基因组的第6号染色体的TtNAM-Al、AetNAM-Dl和TtNAM-Bl亲缘关系最近，其次为来源于小麦A、D、B亚基因组的第2号染色体 TtNAM-B2、AetNAM-D2。这表明一方面，NAM-V1可能与祖1-81、六1、01、82、02具有相同的生物 学功能，即提高籽粒中蛋白质、铁、锌的含量。另一方面，来源于B和D亚基因组第2号染色体 的TtNAM-B2、AetNAM-D2是来源于第6号染色体NAM-B1、A1和D1的旁系同源基因，可能来源于 一次基因复制事件(Gene duplication events)。根据小麦族植物的遗传进化模型，预测这 一基因复制事件可能发生在A基因组祖先种和B(S)D基因组祖先种分离之后，B(S)基因组祖 先种和D基因组祖先种分离之前，即大约在5.8± 1MYA到2.6±0.8MYA之间；在Group II中只 有3个基因，都来自拟南芥，分别是AtNAC2、AtNAC18和AtNAC20。其中AtNAC2相应盐胁迫，并 且和侧根发育相关;Group III中包含3个基因，分别是水稻的0sABA91266、0sABA95705和小 麦的TaNACe^TaNACeg相应低温、干旱和盐胁迫，与小麦逆境下的适应性相关;Group IV中 包含3个基因，分别是小麦的TaNAC2、水稻的OsNP 912423和拟南芥的AtNAC3,其中TaNAC2和 AtNAC3也与植物抗逆相关。
[0043] 实施例3簇毛麦NAM-V1基因的序列比对和分子标记开发
[0044] 基因 NAM-V1 和 NAM-A1、NAM-B1、NAM-B2、NAM-D1、NAM-D2 的核苷酸序列比对结果表 明，在NAM-V1第247个碱基的位置有一个"ATGTC"的插入，在第785个碱基处有一个"G/T"的 SNP差异。根据这两个位点的侧翼序列，设计出用于特异检测NAM-V1基因的标记CauNAM-Vl (图3)。用于特异性PCR扩增标记CauNAM-Vl的引物见表1。
[0045] 实施例4利用分子标记CauNAM-Vl检测不同小麦材料中的NAM-V1基因
[0046] 为了检测CauNAM-Vl引物的特异性，同时也为了证明NAM-V1来源于簇毛麦的6VS染 色体，分别在中国春(CS)、粗山羊草(Aegilops tauschii)、乌拉尔图小麦(T.urartu)、栽培 一粒小麦(T.mononcoccum)、中国春小麦缺体四体系2B/2D和6A/6B、Pml2、Pm21感病单株和 Pm21抗病单株中进行扩增。结果显示，在含6V染色体短臂的Pm21抗病单株(6VS · 6AL易位 系）中能扩增出与预期大小相同的特异目的条带，而在其他供试材料中均未扩增到相应的 特异条带。证明CauNAM-Vl引物能够特异性的检测NAM-V1基因的存在。该结果也证明了NAM-VI基因来源于簇毛麦的6VS染色体(图4)。
[0047] 实施例5分子标记CauNAM-Vl在检测小麦Pm21抗病基因中的应用
[0048]构建小麦6VS · 6AL易位系的分离群体，对分离群体的后代单株经白粉病菌生理小 种E09感染后进行抗病性鉴定，抗病表型如图5所示。
[0049] 挑选10个抗病单株和10感病单株，进行CauNAM-Vl标记的PCR扩增，扩增结果表明， CauNAM-Vl标记呈现出抗白粉病特性共分离的现象，即在所有供试的抗病单株中均能检测 到特异性的目的条带，而在所有供试感病单株中均没有检测到相应的目的条带（图6)。结果 证实了 CauNAM-Vl是可以作为Pm21抗病基因检测的分子标记。
[0050] 实施例6NAM-V1基因在增加小麦籽粒蛋白含量中的应用
[0051 ]为了证明簇毛麦NAM-V1基因在小麦籽粒蛋白质含量中的作用，利用小麦6VS · 6AL 易位系，构建了NAM-V1基因的4个分离群体，分别是W50200、W50175、W50156和W50176。然后 用CauNAM-Vl标记分别检测了分离群体后代的基因型，并且单株测定了小麦籽粒的蛋白质 含量(图7)。结果表明，在含有NAM-V1基因和不含NAM-V1基因的情况下，在4个分离群体中的 籽粒蛋白含量分别为13.94%/13.42%、17.99%/16.88%、13.33%/13.31%、15.41%/ 14.33%，结果表明含有NAM-V1基因的后代材料中的籽粒蛋白质含量均有所增加，其中在 W50175和W50176分离群体中籽粒蛋白含量分别增加了 1.11 %和1.08%。以上结果表明，簇 毛麦的NAM-V1基因能够提高小麦籽粒的蛋白质含量。
[0052]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 [0053] 参考文献
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【主权项】
1. 簇毛麦NAM-V1基因，其特征在于，其核苷酸序列为： i) SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。2. 由权利要求1所述簇毛麦NAM-V1基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. 含有权利要求1所述簇毛麦NAM-V1基因的表达盒、重组载体或重组菌。4. 权利要求1所述簇毛麦NAM-V1基因，或权利要求2所述表达盒、重组载体或重组菌在 提高作物蛋白含量中的应用，优选所述作物为小麦、大麦、黑麦、燕麦、簇毛麦。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将权利要求3所述的表达盒、重组载体或重 组菌，通过农杆菌介导、花粉管导入或基因枪的方法转入作物中，培育高籽粒蛋白含量的转 基因作物。6. 权利要求1所述簇毛麦NAM-V1基因的分子标记CauNAM-Vl，其特征在于，用于特异性 PCR扩增该分子标记的引物为：正向引物F5 ' -TCCCCGGTATGCCATGTC-3 '和反向引物R5 ' -AAGATACCGCTAGACCGTGA-3，。7. 权利要求6所述分子标记在检测作物中NAM-V1基因和/或Pm21基因中的应用，优选所 述作物为小麦、大麦、黑麦、燕麦、簇毛麦。8. 权利要求6所述分子标记在小麦高蛋白含量和/或抗白粉病的分子标记辅助育种中 的应用。9. 权利要求6所述分子标记在筛选或鉴定高蛋白含量和/或抗白粉病小麦品种中的应 用。10. 用于检测作物中NAM-V1基因和/或Pm21基因的引物，其特征在于，包括正向引物 F5 ' -TCCCCGGTATGCCATGTC-3 ' 和反向引物R5 ' -AAGATACCGCTAGACCGTGA-3 '。
【文档编号】C12N15/29GK105969778SQ201610306058
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】解超杰, 孙其信, 倪中福, 赵传志, 李映辉, 耿妙苗, 李峰, 曹廷杰
【申请人】中国农业大学