一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种β?葡萄糖苷酶基因。所述β?葡萄糖苷酶基因从土壤总DNA中获取，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。本发明的β?葡萄糖苷酶不需要利用表面展示或者信号肽表达的技术就可直接使菌体利用纤维二糖，从而进行丁二酸的生产。
【专利说明】
一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶基因及其应用。
【背景技术】
[0002] β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21)属于水解酶。它可以水解并且结合末端、非还原性的 β-D-葡萄糖及相应配基。该酶可以将纤维二糖或短链葡聚糖水解成葡萄糖。因其参与纤维 素水解的最后一步，所以常被认为是纤维素水解糖化过程的限速酶。葡萄糖苷酶按照氨 基酸序列可以划分为糖苷水解酶家族1和糖苷水解酶家族3两类。糖苷水解酶家族1中的酶 主要来源于细菌、植物和哺乳动物;糖苷水解酶家族3中酶来源于真菌、细菌和植物。可见其 来源比较广泛。β-葡萄糖苷酶一般通过表面展示和信号肽表达的方式达到在胞外分解纤维 二糖为葡萄糖，以此供给细胞利用生长，目前尚未有葡萄糖苷酶不需要通过表面展示或 者信号肽表达就可以利用纤维二糖生长的报道。
【发明内容】
[0003]本发明的技术目的之一，在于提供一种来自土壤总DNA的β-葡萄糖苷酶基因，所述 的土壤总DNA采集自南京工业大学东操场边上小花园附近。
[0004] 为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 本发明所述的β-葡萄糖苷酶基因，来源于南京工业大学东操场边上小花园附近土 壤总DNA，其核苷酸序列如SEQ ID Ν0:1所示，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。
[0006] 所述的β-葡萄糖苷酶基因是通过构建土壤总DNA的基因组文库，经过一系列酶切、 酶连、转化等手段获得所需的阳性克隆，提取阳性克隆质粒测序，获得葡萄糖苷酶核苷酸 序列。再根据所得到序列设计引物通过PCR即获得目的基因。优点是方便快捷效率高。
[0007] 为获得本发明所述β-葡萄糖苷酶基因，具体步骤为：
[0008] (1)样品采集:土壤样品采自南京工业大学东操场边上小花园附近。
[0009] (2)土壤总DNA的提取:称取lg土壤样品，加入lmL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸缓冲液 和玻璃珠，振荡lmin，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最终浓度为2.5mg/mL，室温振荡15min，放置 冰箱30min，加125yL 20%SDS振荡处理15min后离心，加酚（1:1体积)抽提1次，氯仿-异戊醇 (1:1体积)抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置lh，离心，70%乙醇清洗，30yL TE溶解。 [0010] (3)构建土壤总DNA的基因组文库：用限制性内切酶EcoRI将总DNA部分酶切，再经 琼脂糖凝胶电泳分离回收2_3kb的DNA片段，与脱磷载体pUCl 18 (BamHI/BAP) (TaKaRa，Code: D3321)连接后，化学转化导入制备好的E.coli DH5a感受态细胞，构建基因组文库。
[0011] 限制性内切酶Ecoia酶切总DNA体系为：总DNA15yL，10Xbuffer H 3yL，EcoRI 3μ L，加双蒸水调至总体积30yL。
[0012] 37°C酶切30min。加入3yL 10 X loading buffer终止酶切反应。酶切产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收2-3kb DNA片段。回收按照试剂盒说明书进行。
[0013] 酶切片段与脱磷载体pUCl 18(BamHI/BAP)的连接：
[0014] 将lyL pUC118(BamHI/BAP)载体DNA转移到无菌微量离心管中，加入6yL总DNA的 EcoRI酶切回收片段，加水至8.5yL，于45 °C加温5min使重新退火的粘端解链，将混合物冷却 至lJ〇 °C。然后加入lyL 10 X T4DNA连接酶缓冲液，0.5yL T4DNA连接酶。16 °C连接反应12h以上。
[0015] ⑷酶连产物的转化和获取阳性克隆:将l〇yL酶连产物加入到200yL在冰上融化后 的E. coli DH5a感受态细胞中，冰浴30min，在42°C水浴锅中热激90s后，快速转移到冰浴中 冷却1~2min，向每管中加入800yL液体LB培养基，37°C摇床80-90rpm温育45min，复苏细胞。 4000rpm离心3min，剩余200yL感受态细胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨苄青霉素的LB琼 脂平板上，平板倒置于37°C培养箱培养，12-16h后出现菌落，选择有天然变色的克隆子，即 为含β-葡萄糖苷酶基因片段的阳性克隆子，同时对阳性克隆子进行编号。挑单菌落接种于 5mL LB液体试管，待长出菌悬液后提质粒验证。
[0016] (5)提取阳性克隆质粒测序，获取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：阳性克隆子插入片段 的测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。测序引物为pUC118(BamHI/BAP)载体上特 异性引物，并根据两端测序结果设计引物，直至将整个插入片段测通。
[0017] 将测序完成的序列在NCBI数据库中进行比对，并利用ORF finder工具鉴定插入片 段所含的0RF。
[0018] (6)引物的设计与合成:根据测序结果的基因序列设计PCR引物，引物设计如下： [0019]设计长度为50mer左右的引物，该引物分为两个部分，P1的第一部分是上游载体末 端同源序列，第二部分是基因特异性正向扩增序列。P2的第一部分是基因特异性反向扩增 序列，第二部分是下游载体末端同源序列。
[0020] 利用PCR进行β-葡萄糖苷酶基因扩增，在50yL反应体系中，P1、P2两个引物的添加 量为 lyL，扩增条件为:94°C 预热 10min;94°C，45s;60°C，45s;72°C，2.5min;72°C，10min，* 间三步共30个循环，使用的DNA聚合酶为2 XPhanta?Master Mix酶(诺唯赞公司，中国）。
[0021] PCR结束后，1.5 %琼脂糖胶回收片段，测定浓度。同时对于表达载体pET-28a( + )用 限制性内切酶EcoRI酶切线性化，1.5 %琼脂糖胶回收片段，测定浓度。计算最适克隆载体使 用量（=0.02 X克隆载体碱基对数)ng和最适插入片段使用量（=0.04 X插入片段碱基对 数)ng(例如，将长度为2kb的插入片段克隆至长度为5kb的克隆载体时，克隆载体的最适使 用量应为：0.02 X 5000 = 100ng;插入片段最适使用量应为：0.04 X 2000 = 80ng)。利用One Step Cloning Kit试剂盒(诺唯赞公司）进行重组反应。37°C反应30min后转化到DH5a感受 态中。获得长度为2775bp的SEQ ID N0:1序列的阳性克隆，即为本发明的β-葡萄糖苷酶基 因。
[0022] 本发明还提供了一种重组载体，所述重组载体含有上述的β-葡萄糖苷酶基因。
[0023] 本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述重组载体。
[0024]所述宿主细胞可为原核细胞。
[0025] 所述原核细胞可为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。
[0026]为实现上述技术目的，具体可采用如下技术方案:将上述SEQ ID N0:1序列直接与 原核表达载体pET-28a( + )连接，37°C反应30min。将该载体转化感受态大肠杆菌DH5a。将菌 液涂布在含30yg/mL卡那霉素霉素的固体LB培养基（2 %蛋白胨，1 %酵母粉，1 %NaCl，1~ 2%琼脂)培养后获得单菌落。挑取单菌落用5mL液体LB试管培养过夜，提质粒，进行单双酶 切验证。选取验证正确质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。将菌液涂布含30yg/mL卡那 霉素的固体LB培养基培养后获得单菌落。
[0027] 本发明还提供了本发明所述β-葡萄糖苷酶基因在生产丁二酸中的应用。
[0028] 本发明的β-葡萄糖苷酶是一种新型β-葡萄糖苷酶，它是一类应用非常广泛的生物 酶类。通过对该基因的原核表达和纯化，可以应用于该酶的工业化生产中。本发明的葡萄 糖苷酶不需要利用表面展示或者信号肽表达的技术就可直接使菌体利用纤维二糖，从而进 行丁二酸的生产。
【附图说明】
[0029]图1为以本发明β-葡萄糖苷酶基因在E.coli BL21(pET-28a( + ))中高效表达实验 方案图。
[0030] 图2为本发明β-葡萄糖苷酶的最适温度曲线图。
[0031] 图3位本发明β-葡萄糖苷酶的温度的稳定性曲线图。
[0032] 图4为本发明β-葡萄糖苷酶的最适pH曲线图。
[0033]图5为本发明β-葡萄糖苷酶的pH的稳定性曲线图。
[0034] 图6为金属离子对本发明β-葡萄糖苷酶酶活的影响柱状图。
[0035] 图7为有机溶剂对本发明β-葡萄糖苷酶酶活的影响柱状图。
【具体实施方式】
[0036]以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案 而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围， 其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0037] 本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥奥德里奇（Sigma-Aldrich)公 司。
[0038] 本发明涉及分子生物实验，若未特别注明，均参考自《分子克隆实验指南》一书(J. 萨姆布鲁克、D. W.拉塞尔著，2002，科学出版社。）
[0039] 实施例1获取β-葡萄糖苷酶基因
[0040] 本实施例说明获取本发明所述β-葡萄糖苷酶基因的方法。具体步骤如下：
[0041] (1)样品采集:土壤样品采自南京工业大学东操场边上小花园附近。
[0042] (2)土壤总DNA的提取:称取lg土壤样品，加入lmL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸缓冲液 和玻璃珠，振荡lmin，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最终浓度为2.5mg/mL，室温振荡15min，放置 冰箱30min，加125yL 20%SDS振荡处理15min后离心，加酚（1:1体积)抽提1次，氯仿-异戊醇 (1:1体积)抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置lh，离心，70%乙醇清洗，30yL TE溶解。 [0043] (3)构建土壤总DNA的基因组文库：用限制性内切酶EcoRI将总DNA部分酶切，再经 琼脂糖凝胶电泳分离回收2_3kb的DNA片段，与脱磷载体pUCl 18 (BamHI/BAP) (TaKaRa，Code: D3321)连接后，化学转化导入制备好的E.coli DH5a感受态细胞，构建基因组文库。
[0044] 限制性内切酶Ecoia酶切总DNA体系为：总DNA15yL，10Xbuffer H 3yL，EcoRI 3μ L，加双蒸水调至总体积30yL。
[0045] 37°C酶切30min。加入3yL 10 X loading buffer终止酶切反应。酶切产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收2-3kb DNA片段。回收按照试剂盒说明书进行。
[0046] 酶切片段与脱磷载体pUCl 18(BamHI/BAP)的连接：
[0047] 将lyL pUC118(BamHI/BAP)载体DNA转移到无菌微量离心管中，加入6yL总DNA的 EC0RI酶切回收片段，加水至8.5yL，于45 °C加温5min使重新退火的粘端解链，将混合物冷却 至lJ〇 °C。然后加入lyL 10 X T4DNA连接酶缓冲液，0.5yL T4DNA连接酶。16 °C连接反应12h以上。 [0048] (4)酶连产物的转化和获取阳性克隆：将10yL酶连产物加入到200yL在冰上融化后 的E. coli DH5a感受态细胞中，冰浴30min，在42°C水浴锅中热激90s后。快速转移到冰浴中 冷却1~2min，向每管中加入800yL液体LB培养基，37°C摇床80-90rpm温育45min，复苏细胞。 4000rpm离心3min，剩余200yL感受态细胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨苄青霉素的LB琼 脂平板上，平板倒置于37°C培养箱培养，12-16h后出现菌落，选择有天然变色的克隆子，即 为含β-葡萄糖苷酶基因片段的阳性克隆子，同时对阳性克隆子进行编号。挑单菌落接种于 5mL LB液体试管，待长出菌悬液后提质粒验证。
[0049] (5)提取阳性克隆质粒测序，获取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：阳性克隆子插入片段 的测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。测序引物为pUC118(BamHI/BAP)载体上特 异性引物，并根据两端测序结果设计引物，直至将整个插入片段测通。
[0050] 将测序完成的序列在NCBI数据库中进行比对，并利用ORF finder工具鉴定插入片 段所含的0RF。
[0051] (6)引物的设计与合成:根据测序结果的基因序列设计PCR引物，利用PCR进行β-葡 萄糖苷酶基因扩增，PCR结束后，用1.5%琼脂糖胶回收片段，测定浓度，即获取本发明所述 β-葡萄糖苷酶基因。
[0052]实施例2β_葡萄糖苷酶基因的扩增
[0053]本实施例说明β_葡萄糖苷酶基因扩增的具体过程。
[0054] 参看图1，用PCR方式来克隆本发明的β-葡萄糖苷酶基因。设计的引物分别如下：
[0055] 上游引物PI :Tm = 66.7,45mer;引物序列如下：
[0056] CAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAAGTAAAATCAACATGG；
[0057] 下游引物P2:Tm = 68.7,52mer;引物序列如下：
[0058] TTGTCGACGGAGCTCGAATTCTTACTTTTTTGCCTTTTCTGTAGAGGTTGCC；
[0059]利用PCR进行β-葡萄糖苷酶基因扩增，在50yL反应体系中，P1、P2两个引物的添加 量为 lyL，扩增条件为:94°C 预热 10min;94°C，45s;55°C，45s;72°C，2.5min;72°C，10min，* 间三步共30个循环，使用的DNA聚合酶为2 XPhanta?Master Mix酶(诺唯赞公司，中国）。 [0060] PCR结束后，1.5%琼脂糖胶回收片段，测定浓度。计算最适克隆载体使用量（= 0.02 X克隆载体碱基对数)ng和最适插入片段使用量（=0.04 X插入片段碱基对数)ng，利 用One Step Cloning Kit试剂盒(诺唯赞公司）进行重组反应。37°C反应30min后转化到DH5 α感受态中。获得长度为2775bp的阳性克隆，即为本发明的β-葡萄糖苷酶基因，其核苷酸序 列如SEQ ID Ν0:1所示。
[0061 ]实施例3β_葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中表达
[0062] 将上述SEQ ID Ν0:1序列直接与原核表达载体pET-28a( + )连接，37°C反应30min。 将该载体转化感受态DH5a。将菌液涂布含30yg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基(质量分数配 方为:2 %蛋白胨，1 %酵母粉，1 %NaCl，1~2 %琼脂)培养后获得单菌落。挑取单菌落用5mL 液体LB试管培养过夜，提质粒，进行单双酶切验证。选取验证正确质粒转化到大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)。将菌液涂布含30μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基培养后获得单菌落。 再挑取单菌落用5mL液体LB试管培养过夜，提质粒，进行单双酶切验证，选取验证正确的菌 落，接种到50mL液体LB培养基（2 %蛋白胨，1 %酵母粉，1 % NaCl)中，37 °C摇床培养，直到菌 液浓度达到OD600为0.6~0.8时，用终浓度为0.3mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行 诱导表达，25°(：，150印111，诱导2011。
[0063]实施例4β_葡萄糖苷酶的纯化
[0064]将实施例3最终获得的培养液在4°C，8000rpm离心10min获得菌体，用预冷的50mM Tris-HCl缓冲液(PH=8.5)洗涤三次，最后用预冷的lOOmMTris-HCl缓冲液(PH=8.5)重悬。 超声破碎得到初酶液，4°C下，12000rpm离心30min，用微孔滤膜过滤离心好的上清，用Ni-Agarose柱子纯化出目的蛋白。将目的蛋白透析后用蛋白保存液保存起来。
[0065]实施例5β_葡萄糖苷酶的酶动力学特性分析
[0066] β-葡萄糖苷酶动力学特性分析主要底物为pNPG。反应采用实施例4中的体系。主要 测定酶对底物的1和最大反应速度Vmax。也就是说在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物 浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度 的增加而迅速增加;随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加 到某种程度时，反应速度达到一个极限值(V max)。
[0067] 底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示：
[0069]式中：V-反应速度;Km_米氏常数;Vmax-酶反应最大速度；[S]-底物浓度。
[0070] 采用Linewaver-Burk作图法测定1(111、'\^￡?，该法是根据米氏方程的倒数形式，以1八 对1/[S]作图，得到一条直线。直线在横轴上的截距为-1/Km，纵截距为1/Vmax，求出K m与Vmax。 所述方程如下所示：
[0072]在这里我们所用的底物的浓度是：pNPG(从0.5mM到8mM)。所得到的结果如表1所 不。
[0073] 表 1
[0074]
[0075]实施例6β_葡萄糖苷酶的生理生化特性分析
[0076]对实施例4中保存的蛋白酶液做特定的生理生化特性分析。本过程是在下述酶反 应体系中进行的：80yL的lOOmM Tris-HCl缓冲液(ρΗ=8.5)加入100yL的8mM的pNPG底物，40 。(:预热2min后，加入20yL适当稀释的酶液开始反应，在40°C下反应10min，加入100yL的0.5M 的Na2C03终止反应。然后在405nm处测量对硝基酚的释放量。在这里我们定义一定数量的酶 在每分钟催化ΙμΜ的对硝基酚的活力为1U』-葡萄糖苷酶的蛋白浓度是使用Micro-Spectrophotometer K5500来分析的。
[0077] 我们分析的生理生化特性主要有酶的最适温度，酶的温度稳定性，酶的最适pH，pH 的稳定性，金属离子对酶活的影响，有机溶剂对酶活的影响。图中相对活性是指在最适温度 和最适pH条件下测定得到的酶活，以此为100%的基准，其他条件下测得活性与之比较从而 得到的比值即为该条件下的相对活性。
[0078] 在研究酶的最适反应的温度时，反应的温度从20°C开始，每隔10°C，一直到80°C。 每个体系做3个重复试验（以下每个反应都是3次重复），研究结果如图2所示，从图中可知， 本发明的葡萄糖苷酶在20-50°C具有较高酶活，其中最适温度为40°C，温度超过50°C的时 候酶活力快速下降，超过60 °C后基本没有酶活。
[0079] 在研究酶的温度稳定性时，主要测定酶在20,30,40和50°C这四个不同温度处理酶 液，然后在最适温度下测定酶的残余活性，研究结果如图3所示，从图中可知，本发明的β-葡 萄糖苷酶酶活力随着时间的增长逐渐降低。在20 °C条件下酶活最稳定，30-40°C条件下活力 依次下降，在50°C的情况下，酶稳定性迅速降低至无活性。可见较低的温度更适合保存该 酶。
[0080]在研究酶的最适pH时，选择不同的缓冲液，主要有柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液 (0· 1Μ，ρΗ4· 0-6.0)，磷酸盐缓冲液（0· 1Μ，ρΗ6· 0-8.0)，Tris-HCl缓冲液（0·05Μ，ρΗ8·0-9.0)，甘氨酸-似0!1缓冲液(0.051，？!18.5-10.0) ;研究结果如图4所示，从图中可知，不同？!1 对酶活力有影响，当pH处于酸性环境下，酶活力较低。其中最适pH为8.5,该酶在碱性环境下 比在酸性环境下有更好的酶活力。
[0081 ] 在研究酶的pH稳定性时，是先将酶在不同的pH缓冲液中，在4°C下处理24h，然后在 最适pH下测定酶的残余活性;研究结果如图5所示，从图中可知，该酶在碱性条件下比酸性 条件下更稳定，且在最适pH下稳定性最好。
[0082]在金属离子对酶活的影响，有机溶剂对酶活的影响是将酶用不同的影响因素处 理，然后在酶的最佳反应体系中测定酶的残余活性。研究结果如图6-图7所示，从图中可以 看出，基本所有的金属离子对该酶都有激活作用，其中Fe 2+的激活作用最明显;有机溶剂中 除了SDS和Tritonx-100对该酶有激活作用，其他有机试剂都起到抑制作用，尿素的抑制作 用最强。
[0083] 经实验验证，酶在40°C，pH8.5时活性最高。
[0084] 实施例7
[0085] 本实施例通过实验描述β-葡萄糖苷酶基因在生产丁二酸中的应用，来说明本发明 葡萄糖苷酶应用于工业化生产的优越性。
[0086] 采用本发明β-葡萄糖苷酶基因生产丁二酸的步骤具体如下：
[0087] (1)构建质粒pTrc99a_bglB，导入大肠杆菌DH5a感受态中。
[0088]其中β-葡萄糖苷酶基因(bg 1B)的获取方法。具体步骤如下：
[0089]①样品采集:土壤样品采自南京工业大学东操场边上小花园附近。
[0090] ②土壤总DNA的提取:称取lg土壤样品，加入lmL 0.1mol/mL、pH 8.0磷酸缓冲液和 玻璃珠，振荡lmin，加入溶菌酶5mg，使溶菌酶最终浓度为2.5mg/mL，室温振荡15min，放置冰 箱30min，加125yL 20%SDS振荡处理15min后离心，加酚（1:1体积)抽提1次，氯仿-异戊醇（1 :1体积)抽提2次，加0.6体积异丙醇，室温放置lh，离心，70%乙醇清洗，30yL TE溶解。
[0091] ③构建土壤总DNA的基因组文库：用限制性内切酶EcoRI将总DNA部分酶切，再经琼 脂糖凝胶电泳分离回收2-3kb的DNA片段，与脱磷载体pUC118(BamHI/BAP)(TaKaRa，C 〇de: D3321)连接后，化学转化导入制备好的E.coli DH5a感受态细胞，构建基因组文库。
[0092] 限制性内切酶EcoR頂每切总DNA体系为：总DNA15yL，10Xbuffer H 3yL，EcoRI 3μ L，加双蒸水调至总体积30yL。
[0093] 37°C酶切30min。加入3yL 10 X loading buffer终止酶切反应。酶切产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收2-3kb DNA片段。回收按照试剂盒说明书进行。
[0094] 酶切片段与脱磷载体pUCl 18(BamHI/BAP)的连接：
[0095] 将lyL pUC118(BamHI/BAP)载体DNA转移到无菌微量离心管中，加入6yL总DNA的 EC0RI酶切回收片段，加水至8.5yL，于45 °C加温5min使重新退火的粘端解链，将混合物冷却 至lJ〇 °C。然后加入lyL 10 X T4DNA连接酶缓冲液，0.5yL T4DNA连接酶。16 °C连接反应12h以上。 [0096]④酶连产物的转化和获取阳性克隆：将10yL酶连产物加入到200yL在冰上融化后 的E. coli DH5a感受态细胞中，冰浴30min，在42°C水浴锅中热激90s后。快速转移到冰浴中 冷却1~2min，向每管中加入800yL液体LB培养基，37°C摇床80-90rpm温育45min，复苏细胞。 4000rpm离心3min，剩余200yL感受态细胞涂布于含8mM pNPG和100mg/l氨苄青霉素的LB琼 脂平板上，平板倒置于37°C培养箱培养，12-16h后出现菌落，选择有天然变色的克隆子，即 为含β-葡萄糖苷酶基因片段的阳性克隆子，同时对阳性克隆子进行编号。挑单菌落接种于 5mL LB液体试管，待长出菌悬液后提质粒验证。
[0097]⑤提取阳性克隆质粒测序，获取β-葡萄糖苷酶核苷酸序列：阳性克隆子插入片段 的测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。测序引物为pUC118(BamHI/BAP)载体上特 异性引物，并根据两端测序结果设计引物，直至将整个插入片段测通。
[0098] 将测序完成的序列在NCBI数据库中进行比对，并利用0RF finder工具鉴定插入片 段所含的0RF。
[0099]⑥用PCR方式来克隆本发明的β-葡萄糖苷酶基因。设计的引物分别如下：
[0100] 上游引物PI :Tm = 66,40mer;引物序列如下：
[0101] GCCTGCAGGTCGACTCTAGATTACTTTTTTGCCTTTTCTG；
[0102] 下游引物？2:1'111 = 63,4〇11161';引物序列如下：
[0103] GGAAACAGACCATGGAATTCGTGAAAGTAAAATCAACATG；
[0104]利用PCR进行β-葡萄糖苷酶基因扩增，在50yL反应体系中，P1、P2两个引物的添加 量为 lyL，扩增条件为:94°C 预热 10min;94°C，45s;55°C，45s;72°C，2.5min;72°C，10min，* 间三步共30个循环，使用的DNA聚合酶为2 XPhanta?Master Mix酶(诺唯赞公司，中国）。 [0105] PCR结束后，1.5 %琼脂糖胶回收片段，测定浓度。同时对于表达载体pTrc99a用限 制性内切酶EcoRI和Xbal酶切线性化，1.5%琼脂糖胶回收片段，测定浓度。计算最适克隆载 体使用量（=〇. 02 X克隆载体碱基对数)ng和最适插入片段使用量（=0.04 X插入片段碱基 对数)ng，利用One Step Cloning Kit试剂盒(诺唯赞公司）进行重组反应。37°C反应30min 后转化到DH5a感受态中。
[0106] (2)提取质粒，验证质粒正确后，将正确的质粒导入大肠杆菌SUC260感受态中，继 续验证，完成菌株构建suc26〇-pTrc99a_bglB。
[0107] (3)以菌suc260-pTrc99a为对照菌，进行厌氧发酵。先在5mL LB试管里过夜生长， 再转接到50mL LB的摇瓶中，37°C，200rpm生长，至OD600为0.6~0.8时用IPTG诱导，终浓度为 0.3mM; 25°C，150rpm培养6~8h。用离心管收集菌液后用纯水洗3遍，目的是为了洗掉原来的 LB培养基。最后用纯水重悬菌泥，使最终OD55Q控制在4左右，然后向血清瓶中加入菌液，接种 量为10%，其中，血清瓶内的培养基为AM1培养基，唯一碳源为30g/L的纤维二糖，装液量为 30mL。接种前用C0 2气体预先混匀培养基中的纤维二糖和碱式碳酸镁，约混匀lmin，然后进 行接种，取初样后向每个血清瓶中再次通C0 2气体，目的是是菌液和培养基充分混匀并且保 证厌氧状态。37°C，180rpm培养。培养结束后取终样。经检测，发酵产物中丁二酸的质量收率 为0.85g/g(即丁二酸对纤维二糖的收率）。
【主权项】
1. 一种β-葡萄糖苷酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2. -种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶基 因。3. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2所述的重组载体。4. 根据权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞。5. 根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)〇
【文档编号】C12N1/21GK105969751SQ201610424102
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月14日
【发明人】姜岷, 薛梦蕾, 董维亮, 马江锋
【申请人】南京工业大学