一种基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法
【专利摘要】本发明提供一种基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，包括以下步骤：S1：取含有疏水性有机物降解菌的土壤、污泥或污水，用无菌生理盐水洗涤形成含有混合菌种的菌悬液；S2：将S1得到的菌悬液接种到筛选体系中，接种量为5～20mL/L，摇床培养，得到含有机物降解菌的初筛菌悬液；S3：将S2得到的初筛菌悬液分离得到单一纯菌株，分别接种到含有疏水性有机物的无机盐培养基中，筛选出具有较强降解能力的疏水性有机物降解菌。通过本发明提供的筛选方法，可以筛选出比传统水溶液系统和快速分相浊点系统更多、降解效率更高效的降解菌。
【专利说明】
一种基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种有机污染物降解菌的筛选方法，具体地是一种基于浊点系统的疏 水性有机物降解菌筛选方法。
【背景技术】
[0002] 疏水性有机物包括脂肪烃、单环芳烃、多环芳烃、卤代烃、卤代芳烃和塑化剂等疏 水性有机物的降解，往往难以降解，容易导致环境污染等危害。塑化剂是一种疏水性高分子 有机物，长期食用可能引起生殖系统异常、甚至造成畸胎、癌症的危险。疏水性有机物的降 解菌筛选具有重要意义。
[0003] 疏水性有机物在传统的筛菌体系-水溶液中的溶解度很低，以至于水中可生物利 用的底物含量有限，影响降解菌的生长繁殖。此外，在传统的水溶液筛选过程中，在水溶液 中底物含量无差异的情况下，疏水性有机物穿越不同降解菌细胞膜速率的快慢，显著影响 着不同降解菌的生长速率。也就是说吸收疏水性有机物更快的降解菌，生长速率更快，这会 导致很多虽然生长速率较慢、但降解能力强效率更高的疏水性有机物降解菌筛选难度变 大，或者被漏筛。
[0004] 因此，现有的疏水性有机物降解菌的筛选存在以下问题，一方面，疏水性底物的生 物利用度较低，降解菌难以利用；另一方面，生长速率较快的降解菌常常会抑制生长速率较 慢的降解菌，导致后者筛选困难或者无法筛选到。
[0005] 中国专利申请201510529421.8公开了浊点系统中萃取微生物降解疏水性有机物 的方法，其中公开了一种将浊点系统用于疏水性有机物生物降解的新应用，即采用一种或 一种以上非离子表面活性剂形成的浊点系统，该浊点系统适用于疏水性有机污染物的生物 降解。
[0006] 现有技术尚无将浊点系统有效用于疏水性有机物降解菌的筛选的报道。
【发明内容】
[0007] 为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种基于慢速分相浊点系统的疏水性有 机物降解菌的筛选方法，筛选出比传统水溶液系统和快速分相浊点系统更多、降解效率更 高效的降解菌。
[0008] 本发明提供一种基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，包括以下步骤：
[0009] S1:取含有疏水性有机物降解菌的土壤、污泥或污水，用无菌生理盐水洗涤形成含 有混合菌种的菌悬液；
[0010] S2:将S1得到的菌悬液接种到筛选体系中，接种量为5~20mL/L，摇床培养，得到含 有机物降解菌的初筛菌悬液；
[0011] S3:将S2得到的初筛菌悬液分离得到单一纯菌株，分别接种到含有疏水性有机物 的无机盐培养基中，筛选出具有较强降解能力的疏水性有机物降解菌；
[0012] 所述筛选体系为非离子表面活性剂加入含有疏水性有机物的无机盐培养基中在 20~30°C形成的浊点系统；所述非离子表面活性剂选自泊洛沙姆嵌段聚合物，所述非离子 表面活性剂的体积百分含量为2~8%，所述疏水性有机物的含量为0.2~0.8g/L。
[0013] 采用上述技术方案，通过加入泊洛沙姆嵌段聚合物形成慢速分相浊点系统，并将 该慢速分相浊点系统作为疏水性有机物降解菌的筛选介质，不影响降解菌细胞生物活性， 进而提高降解菌的筛选效率，获得更多、降解效率更高的浊点菌。一方面，通过该浊点系统 的慢速分相作用，强化了增溶在凝聚层相中的疏水性有机物向水相的传质作用，提高了底 物利用效率；另一方面，慢速分相浊点系统的形成，将有机物降解菌处理成渗透细胞，有机 物进入慢速生长降解菌细胞和快速生长降解菌细胞的速率差异将减小，有利于不同降解菌 的同步生长。本发明中形成的浊点系统在培养温度下分相时间长达1周以上，属于慢速分相 浊点系统。本发明通过形成并利用慢速分相浊点系统筛选疏水性有机物降解菌，通过慢速 分相和对降解菌细胞的渗透处理作用，进而提高降解菌的筛选效率。
[0014] 优选地，所述非离子表面活性剂选自泊洛沙姆嵌段聚合物31R1、L61、L101、L121、 L31、L92和N3中的一种或多种。泊洛沙姆的英文名为Pluronic，商品名为普兰尼克，本发明 中的泊洛沙姆嵌段聚合物为常规市售产品，如购自SIGMA-ALDRICH中国有限公司。
[0015]更优选地，所述非离子表面活性剂由泊洛沙姆嵌段聚合物L61与N3以3~6:1的质 量比组成。
[0016] 进一步优选地，所述非离子表面活性剂由泊洛沙姆嵌段聚合物L61与N3以5:1的质 量比组成。
[0017] 优选地，所述疏水性有机物为塑化剂。
[0018] 更优选地，所述疏水性有机物为邻苯二甲酸二辛酯。
[0019] 优选地，所述摇床培养的条件为30°C、150r/min、恒温培养2天。
[0020]优选地，所述分离采用稀释涂布法。
[0021]优选地，所述无机盐培养基包括水、（NH4)2S〇4、Na2HP〇4、KH2P〇4、MgS〇4 · 7H20、 FeCl3 · 3H2〇、CaCl2 · 2Η20、（ΝΗ4)6Μ〇7〇24 · 4H20〇
[0022] 此外，本发明还提供浊点系统在疏水性有机物降解菌筛选中的用途，所述浊点系 统由泊洛沙姆嵌段聚合物加入无机盐培养基中在20~30°C形成。
[0023] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:本发明通过添加泊洛沙姆嵌段聚合 物非离子表面活性剂，形成慢速分相的浊点系统，作为降解菌筛选体系。这种慢速分相作用 提高了疏水性有机物在两相间的传质作用，进一步提高了底物的生物利用度;另一方面，添 加的非离子表面活性剂改变了降解菌细胞膜的渗透性，将降解菌细胞处理成渗透细胞。有 机物进入不同降解菌渗透细胞的速度差异，将明显减小，以至于不同降解菌的生长世代时 间将明显趋于一致。这一有机物降解菌筛选过程的关键在于慢速分相的浊点系统提高了底 物在两相间的传质作用，增强了底物的生物利用度。同时，所选择的泊洛沙姆嵌段聚合物非 离子表面活性剂形成的慢速分相浊点系统能够在不影响细胞生物活性的基础上，将降解菌 细胞处理成渗透细胞，解除了有机物进入降解菌细胞的速度差异，提高了降解菌的筛选效 率，可获得更多、降解效率更高的浊点菌。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法的原理图。
【具体实施方式】
[0025] 以下实例将对本发明作进一步说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实 施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0026] 如图1所示，为本发明基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法的原理图。 [0027]其中，平板培养基为LB固体培养基（1L水中胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼 脂粉20g)在30°C条件下培养2天。
[0028] 含有疏水性有机物的无机盐培养基：1L水中（NH4)2S〇4 lg，Na2HP〇4 0.8g，KH2P〇4 0.2g，MgS〇4.7H20 0.2g，FeCl3.3H2〇 0.005g，CaCl2.2H20 0.1g，（NH4)6M〇7〇24.4H20 0.0 Olg，底物邻苯二甲酸二辛酯含量为0.4g。
[0029] 传统水溶液筛选体系组成为:在容量为250mL的三角瓶中，加入30mL含有疏水性有 机物的无机盐培养基。自然pH，在30 °C、150r/min的摇床中培养2天。
[0030] 快速分相浊点系统筛选体系组成为:在容量为250mL的三角瓶中，加入30mL含有疏 水性有机物的无机盐培养基，并添加1.2g非离子表面活性剂（由Brij30和Tergitol TMN-3 以1:1重量比组成），形成总浓度为每升筛选培养基含40g非离子表面活性剂的浊点系统。自 然pH，在30°C、150r/min的摇床中培养2天。
[0031]本发明慢速分相浊点系统第一筛选体系组成为:在容量为250mL的三角瓶中，加入 30mL含有疏水性有机物的无机盐培养基，并添加1.2g的泊洛沙姆嵌段聚合物L61，形成总浓 度为每升筛选培养基含40g非离子表面活性剂的浊点系统。自然pH，在30°C、150r/min的摇 床中培养2天。
[0032]本发明慢速分相浊点系统第二筛选体系组成为:在容量为250mL的三角瓶中，加入 30mL含有疏水性有机物的无机盐培养基，并添加1.2g由L61与N3以5:1的质量比组成的泊洛 沙姆嵌段聚合物，形成总浓度为每升筛选培养基含40g非离子表面活性剂的浊点系统。自然 pH，在30°C、150r/min的摇床中培养2天。
[0033]邻苯二甲酸二辛酯的浓度主要采用高效液相色谱在223nm处测定，出峰时间3.8分 钟，记录峰面积。邻苯二甲酸二辛酯的降解用降解率来表示，其运算公式为:降解率=(邻苯 二甲酸二辛酯初始浓度-邻苯二甲酸二辛酯降解后浓度）/邻苯二甲酸二辛酯初始浓度* 100%〇
[0034] 实施例1邻苯二甲酸二辛酯降解菌的筛选
[0035] 分别使用传统水溶液筛选体系、快速分相浊点系统筛选体系、慢速分相浊点系统 第一筛选体系和慢速分相浊点系统第二筛选体系，进行塑化剂邻苯二甲酸二辛酯降解菌的 筛选。筛选方法的步骤如下：
[0036] S1:取工厂排污口的含邻苯二甲酸二辛酯降解菌的污泥样品5g，用30mL无菌生理 盐水洗涤形成含有混合菌种的菌悬液；
[0037] S2:将S1得到的菌悬液分别接种到传统水溶液筛选体系、快速分相浊点系统筛选 体系、慢速分相浊点系统第一筛选体系和慢速分相浊点系统第二筛选体系中，接种量为 10mL/L筛选体系，30°C、150r/min的摇床中培养2天，得到含有机物降解菌的初筛菌悬液；
[0038] S3:将S2得到的初筛菌悬液，在平板培养基上通过稀释涂法分离得到多个单一纯 菌株，分别接种到上述筛选体系中，筛选出具有较强降解能力的疏水性有机物降解菌。
[0039] 传统水溶液筛选体系筛选得到的降解菌用对照菌表示，快速分相浊点系统筛选体 系筛选得到的降解菌用快速分相浊点菌表示，慢速分相浊点系统第一筛选体系筛选得到的 降解菌用第一浊点菌表示，慢速分相浊点系统第二筛选体系筛选得到的降解菌用第二浊点 菌表不 。
[0040] 下面列出培养5天后，上述筛选体系筛选得到的降解菌及其邻苯二甲酸二辛酯降 解率如表1所示。
[0041] 表1筛选体系筛选得到的降解菌及其邻苯二甲酸二辛酯降解率
[0043] 从表1可知，传统水溶液筛选体系筛选得到1株降解菌（对照菌1)，降解率只有 39.25%;快速分相浊点系统筛选体系筛选得到2株降解菌，降解率分别为66.23%和 42.80%;慢速分相浊点系统第一筛选体系筛选得到3株降解菌，降解率分别为85.16%、 54.58%和67.04% ;慢速分相浊点系统第二筛选体系筛选得到5株降解菌，降解率分别为 70.38%、92.15%、47.60%、81.56%和83.92%。
[0044] 因此，应用本发明提供的筛选方法，能显著提高降解菌的筛选效率，减少漏筛，筛 选出的高效降解菌有利于控制环境污染，从而产生显著的社会效益和环境效益。
[0045] 以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护范围。
【主权项】
1. 一种基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，其特征在于，包括以下步骤： S1:取含有疏水性有机物降解菌的土壤、污泥或污水，用无菌生理盐水洗涤形成含有混 合菌种的菌悬液； S2:将S1得到的菌悬液接种到筛选体系中，接种量为5~20mL/L，摇床培养，得到含有机 物降解菌的初筛菌悬液； S3:将S2得到的初筛菌悬液分离得到单一纯菌株，分别接种到含有疏水性有机物的无 机盐培养基中，筛选出具有较强降解能力的疏水性有机物降解菌； 所述筛选体系为非离子表面活性剂加入含有疏水性有机物的无机盐培养基中在20~ 30°C形成的浊点系统;所述非离子表面活性剂选自泊洛沙姆嵌段聚合物，所述非离子表面 活性剂的体积百分含量为2~8%，所述疏水性有机物的含量为0.2~0.8g/L。2. 根据权利要求1所述的基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，其特征在于， 所述非离子表面活性剂选自泊洛沙姆嵌段聚合物311?1、1^61、1^101、1^121、1^31、1^92和似中的 一种或多种。3. 根据权利要求2所述的基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，其特征在于， 所述非离子表面活性剂由泊洛沙姆嵌段聚合物L61与N3以3~6:1的质量比组成。4. 根据权利要求3所述的基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，其特征在于， 所述非离子表面活性剂由泊洛沙姆嵌段聚合物L61与N3以5:1的质量比组成。5. 根据权利要求1所述的基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，其特征在于， 所述疏水性有机物为塑化剂。6. 根据权利要求5所述的基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，其特征在于， 所述疏水性有机物为邻苯二甲酸二辛酯。7. 根据权利要求1所述的基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，其特征在于， 所述摇床培养的条件为30 °C、150r/min、恒温培养2天。8. 根据权利要求1所述的基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，其特征在于， 所述分离采用稀释涂布法。9. 根据权利要求1所述的基于浊点系统的疏水性有机物降解菌筛选方法，其特征在于， 所述无机盐培养基包括水、（NH4)2S〇4、Na 2HP〇4、KH2P〇4、MgS〇4.7H20、FeCl3.3H20、CaCl 2· 2Η20、（ΝΗ4)6Μ〇7〇24 · 4H20。10. 浊点系统在疏水性有机物降解菌筛选中的用途，其特征在于，所述浊点系统由泊洛 沙姆嵌段聚合物加入无机盐培养基中在20~30°C形成。
【文档编号】C12N1/00GK105969663SQ201610450993
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月21日
【发明人】潘涛, 范海龙, 周丽君, 符冠豪, 田先培, 辛桥, 董伟
【申请人】江西理工大学