具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物及其制备方法，黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物由摩尔比为0.33:17.03:1.00:0.41的甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成；黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物分子量为715.17kDa。本发明通过大量实验优选提取分离工艺，采用水提醇沉法得到粗多糖，再脱蛋白，然后采用DEAE?52纤维素树脂进行纯化，制得纯度高的黄蜀葵茎叶多糖，再采用酸法水解得到黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物。本发明充分利用废弃的黄蜀葵茎叶资源，变废为宝，得到可提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物，可实现中药资源的可持续化应用，具有很好的经济价值。
【专利说明】
具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物及其制 备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种植物多糖，具体涉及一种具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖的 酸法降解产物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 中药资源是保障国民健康、发展民族医药的坚实基础。近年来中药及天然药用生 物资源的生产面积已超过2.40 X 106hm2，药材产量可达5.40 X 106t，而废弃的植物根系以及 地上茎叶的生物量高达1.1 X 107~1.6 X 107t，是药材产量2~3倍，造成了严重的资源浪费 和环境污染。因此，在中药资源产业化过程中提高药用生物资源的利用价值、尤其是提升其 药用价值，对于中医药产业的健康发展以及发展资源节约型、环境友好型的经济具有重大 意义。
[0003] 黄蜀葵(Abelmoschus manihot L.Medic)为锦葵科秋葵属植物，始载于《嘉祐本 草》，《本草纲目》中记载："其花气味甘、寒、滑、无毒，主治小便淋及催生，治诸恶疮脓水久不 瘥者，作末敷之即愈，为疮家要药"等。其根、茎、叶均具有一定的药用价值。黄蜀葵花为主要 用药部位，在采收过程中其茎叶部分多被丢弃或是焚烧，造成了黄蜀葵茎叶资源的极大浪 费以及环境的污染。
[0004] 多糖作为一类重要的生物大分子，具有广泛的生物活性，在食品、医药和化妆品等 领域应用广阔。然而，天然多糖的分子质量大、水溶性差，不利于吸收以及生物活性的发挥， 极大地限制了多糖的发展和应用；大量研究表明，小分子多糖在某些方面具有比大分子多 糖更好的生物活性。因此，降解植物多糖已成为开发、提高多糖生物活性的重要方向之一。 酸水解法是利用植物多糖在酸性溶液中不稳定、易发生糖苷键的断裂，形成的多糖片段具 有一定的分子量分布。酸法降解操作较简便，降解速度可控，在实验研究中应用较普遍。
[0005] 目前，国内外对黄蜀葵茎叶多糖的研究主要集中在理化性质以及单糖的分析，对 其活性的研究较少。因此，应用酸法水解改变黄蜀葵茎叶多糖的结构、改善其理化性质，获 得真正具有活性的多糖，对黄蜀葵茎叶资源的高效利用以及生态环境的保护意义重大。
【发明内容】
[0006] 发明目的：本发明的目的是为了解决现有技术的不足，以黄蜀葵茎叶废弃物为原 料，通过优选方法制备得到黄蜀葵茎叶粗多糖，然后采用酸法水解，得到具有提高免疫活性 的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物。本发明另一个目的是提供黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解 产物的制备方法和其应用。本发明充分利用废弃的黄蜀葵茎叶资源，变废为宝，得到可提高 免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物，可实现中药资源的可持续化应用，具有很好 的经济价值和生态环境的保护意义。
[0007] 技术方案:为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：
[0008] -种黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物，黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物由摩尔比 为0.33:17.03:1.00:0.41的甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成;黄蜀葵茎叶多糖的 酸法降解产物分子量为715.17kDa。
[0009] 本发明所述的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (1)取黄蜀葵茎叶乙醇提取后的药渣，加入药渣重量10~30倍体积的水，回流提取 2~3次，每次1~2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩;Sevag法除蛋白，离心，取上清液，加入无 水乙醇，醇沉过夜，抽滤，取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干，得黄蜀葵茎叶粗 多糖；
[0011] (2)黄蜀葵茎叶粗多糖的分级
[0012] 称取步骤（1)制备得到的黄蜀葵茎叶粗多糖，加蒸馏水溶解，加样于DEAE-52层析 柱中，用0.0、0.1、0.3、0.5111 〇1/1^&(：1溶液梯度洗脱，并采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，分 别收集不同的洗脱峰，减压浓缩，透析，最后将透析液真空冷冻干燥，获得黄蜀葵茎叶多糖；
[0013] (3)黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解
[0014]取步骤(2)制备得到的黄蜀葵茎叶多糖，溶于酸中，搅拌水解，反应结束后，用NaOH 调节pH至中性，将溶液置于透析袋内透析，取透析液减压浓缩，冻干，得黄蜀葵茎叶多糖的 酸法降解产物。
[0015] 作为优选方案，以上所述的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物的制备方法，步骤(3) 为:取步骤(2)制备得到的黄蜀葵茎叶多糖40mg，溶于20mL 0 . Olmol/L盐酸，于50°C搅拌水 解3h，反应结束后，用0.05mol/LNa0H调节pH至中性，将溶液置于透析袋内透析，取透析液减 压浓缩，冻干，得黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物。
[0016] 本发明所述的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物在制备提高免疫力的药物或保健 品中的应用。
[0017] 作为优选方案，以上所述的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物在制备提高免疫力的 药物或保健品中的应用，把黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物和药学上可接受的载体制成片 剂、胶囊剂、颗粒剂或微囊剂型的药物。
[0018] 本发明在制成片剂时，将黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物和载体乳糖或玉米淀粉 混合均匀，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均匀，然后压片制成片剂。
[0019] 在制成胶囊剂时，将黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物和载体乳糖或玉米淀粉混合 均匀，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂。
[0020] 本发明在制成颗粒剂时，把黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物和稀释剂乳糖或玉米 淀粉混合均勾，整粒，干燥，制成颗粒剂。
[0021] 有益效果:本发明提供的具有提高免疫活性的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物和 现有技术相比具有以下优点：
[0022] 1、本发明通过大量实验优选提取分离工艺，首先采用水提醇沉法得到粗多糖，再 脱除蛋白，然后采用DEAE-52纤维素树脂进行纯化，制得纯度高的黄蜀葵茎叶多糖，然后再 酸进行水解，然后纯化，得到黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物。
[0023] 本发明充分利用废弃的黄蜀葵茎叶资源，变废为宝，制备得到可提高免疫活性的 黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物，可实现中药资源的可持续化应用，具有很好的经济价值 和生态环境的保护意义。
[0024] 2、本发明经过体外小鼠脾淋巴细胞的增殖活性试验表明，黄蜀葵茎叶多糖并无明 显的免疫调节活性，但是经酸法降解产物，在25~200yg/mL剂量范围内表现出显著的免疫 调节活性，在50yg/mL时具有最高的增殖作用，增值率为1.291，25yg/mL的增殖作用最低，为 1.206,而修饰前的最高刺激指数仅为1.078。取得了非常好的预料不到的技术效果。
【附图说明】
[0025]图1为黄蜀葵茎叶多糖及其酸法降解产物的脾细胞增殖活性柱状图。
【具体实施方式】
[0026]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0027]实施例1黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物的制备方法，包括以下步骤：
[0028] (1)黄蜀葵茎叶粗多糖的制备
[0029]取黄蜀葵茎叶粗粉100g，加入30倍量水，100 °C水浴回流提取3次，每次lh。过滤，合 并滤液，减压浓缩。Sevag法除蛋白，离心(4000r/min，lOmin)，取上清液，加入四倍体积的无 水乙醇，醇沉过夜，抽滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤三次，50°C烘干，即得黄蜀葵 茎叶粗多糖。
[0030] (2)黄蜀葵茎叶粗多糖的分级
[0031]称取粗多糖3g，加适量蒸馏水溶解，配制质量浓度为30mg/mL的多糖溶液，加样于 0￡八￡-52层析柱中。用0.0、0.1、0.3、0.5111〇1/〇^(：1溶液梯度洗脱，流速1.011117111111(10111111/ 管），采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，分别收集不同的洗脱峰，减压浓缩，透析，最后将透析 液真空冷冻干燥，获得黄蜀葵茎叶多糖。
[0032] (3)黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解
[0033] 取步骤(2)制备得到的黄蜀葵茎叶多糖，采用稀盐酸进行降解。准确称取黄蜀葵茎 叶多糖40mg，溶于20mL 0.01mol/L盐酸于50°C搅拌水解3h，反应结束后，用0.05mol/LNa0H 调节pH至中性，将溶液置于透析袋内透析3天，减压浓缩，冻干，得黄蜀葵茎叶多糖的酸法降 解产物。
[0034] 实施例2黄蜀葵茎叶多糖及其酸法降解产物的总糖以及糖醛酸含量的测定
[0035] 1、实验方法：以D-无水葡萄糖为标准品，采用苯酚-硫酸法测定硫酸化修饰前后黄 蜀葵茎叶多糖的总糖含量;采用间羟联苯法测定糖醛酸含量，以D-葡萄糖醛酸为标准品。 [0036] 2、实验结果：黄蜀葵茎叶多糖的总糖含量99.76%，降解产物的总糖含量有所下 降，为80.68% ;黄蜀葵茎叶多糖在降解前不含糖醛酸，降解后亦不含糖醛酸，这与单糖组成 的结果是一致的。
[0037]实施例3黄蜀葵茎叶多糖及其酸法降解产物单糖组成分析 [0038] 1、实验方法:采用三氟乙酸水解多糖样品，以混合单糖为标准品，PMP衍生多糖样 品以及混标，利用高效液相色谱法根据出峰时间确定单糖的组成，根据峰面积绘制各单糖 的标准曲线测定样品的单糖含量。
[0039] 2、实验结果:单糖组成分析，如表1所示：
[0040] 表1黄蜀葵茎叶多糖及其酸法降解产物的单糖组成摩尔比
[0042] 黄蜀葵茎叶多糖及酸解产物的单糖组成的摩尔比如表1所示，黄蜀葵茎叶多糖由 甘露糖、葡萄糖、半乳糖以及阿拉伯糖组成，其中葡萄糖的含量最多，其它三种糖的含量较 少。酸法降解后，降解产物的葡萄糖比例有所降低，降解成功。
[0043] 实施例4黄蜀葵茎叶多糖及其酸法降解产物分子量的测定
[0044] 1、实验方法:采用HPGPC-ELSD法测定黄蜀葵茎叶多糖酸降解前后的分子量，以葡 聚糖T系列为标准分子量制作标准曲线。
[0045] 2、实验结果:黄蜀葵茎叶多糖在盐酸降解前的分子量为760.24kDa，黄蜀葵茎叶多 糖降解后的分子量为715.17kDa。
[0046]实施例5黄蜀葵茎叶多糖及其酸法降解产物对小鼠脾淋巴细胞增殖试验 [0047] 1、实验方法:无菌取脾，制备小鼠脾淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为6 X 106个/mL， 于96孔板接种1 OOyL/孔，再分别加入培养液(空白对照）、1 Oyg/mL ConA(刀豆球蛋白A，阳性 对照)及不同浓度的本发明实施例1制备得到的黄蜀葵茎叶多糖及其酸法降解产物溶液各 100此/孔，每个浓度均设4个复孔，混合均匀后置于37 °C、5 % C02培养24h。培养结束前4h，每 孔加入MTT(5mg/mL) 10yL，于上述条件中继续培养4h，离心弃上清，加入lOOyL DMS0，充分震 荡后用酶标仪测定波长570nm的吸光值。
[0048]淋巴细胞增殖指数=样品组吸光值/空白对照组吸光值 [0049] 2、实验结果
[0050] 实验结果如图1所示，图1中a表示与对照组相比，增强作用差异显著(p<0.05) ;b 表示与对照组相比，增强作用差异极显著(P<〇.01) ;c表示与对照组相比，增强作用差异极 其显著(p<0.001) ;d表示与黄蜀葵茎叶多糖组相比，增强作用差异显著(p<0.05) ;e表示 与黄蜀葵茎叶多糖组相比，增强作用差异极显著(P<〇.01)。对照组的增殖指数为1.001，阳 性组为1.656。
[00511由图1结果表明：与对照组相比，黄蜀葵茎叶多糖在25~200yg/mL浓度范围内不能 刺激脾淋巴细胞的增殖，而黄蜀葵茎叶多糖酸降解产物具有显著的促增殖作用。黄蜀葵茎 叶多糖酸降解产物在各剂量的增殖指数相差不大，在50yg/mL时具有最高的增殖作用，增值 率为1.291，25yg/mL的增殖作用最低，为1.206,而修饰前的最高刺激指数仅为1.078,取得 了非常好的技术效果。
[0052]以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的 人了解本
【发明内容】
并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实 质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物，其特征在于，黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产 物由摩尔比为0.33:17.03:1.00:0.41的甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成;黄蜀葵茎 叶多糖的酸法降解产物分子量为715.17kDa。2. 权利要求1所述的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤： (1) 取黄蜀葵茎叶乙醇提取后的药渣，加入药渣重量10~30倍体积的水，回流提取2~3 次，每次1~2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩;Sevag法除蛋白，离心，取上清液，加入无水乙 醇，醇沉过夜，抽滤，取沉淀，依次用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干，得黄蜀葵茎叶粗多糖； (2) 黄蜀葵茎叶粗多糖的分级 称取步骤（1)制备得到的黄蜀葵茎叶粗多糖，加蒸馏水溶解，加样于DEAE-52层析柱中， 用0.0、0.1、0.3、0.5mol/LNaCl溶液梯度洗脱，并采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，分别收集 不同的洗脱峰，减压浓缩，透析，最后将透析液真空冷冻干燥，获得黄蜀葵茎叶多糖； (3) 黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解 取步骤⑵制备得到的黄蜀葵茎叶多糖，溶于酸中，搅拌水解，反应结束后，用NaOH调节 pH至中性，将溶液置于透析袋内透析，取透析液减压浓缩，冻干，得黄蜀葵茎叶多糖的酸法 降解产物。3. 根据权利要求2所述的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物的制备方法，其特征在于，步 骤(3)为:取步骤(2)制备得到的黄蜀葵茎叶多糖40mg，溶于20mL 0.01 mo 1 /L盐酸，于50°C搅 拌水解3h，反应结束后，用0.05mol/LNa0H调节pH至中性，将溶液置于透析袋内透析，取透析 液减压浓缩，冻干，得黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物。4. 权利要求1所述的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物在制备提高免疫力的药物或保健 品中的应用。5. 根据权利要求4所述的黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物在制备提高免疫力的药物或 保健品中的应用，其特征在于，把黄蜀葵茎叶多糖的酸法降解产物和药学上可接受的载体 制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或微囊剂型的药物。
【文档编号】A61K36/185GK105968221SQ201610490642
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】江曙, 潘欣欣, 段金廒, 朱悦, 钱大玮, 严辉
【申请人】南京中医药大学