一种新的羊毛甾烷型三萜类化合物及其制备方法和医药用图

一种新的羊毛甾烷型三萜类化合物及其制备方法和医药用图
【专利摘要】本发明公开了一种新的羊毛甾烷型三萜类化合物及其制备方法和医药用途。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的羊毛甾烷型三萜类化合物，可以从香鳞毛蕨的干燥地上部分中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物可直接抑制K562细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和作用时间的延长而增强。同时，该化合物可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的效应随着浓度和时间的增加而增加。化合物（Ⅰ）可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在的手段，可以用来开发成治疗慢性粒细胞白血病的药物。
【专利说明】
一种新的羊毛甾烷型三萜类化合物及其制备方法和医药用途
技术领域
[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及从香鳞毛蕨的干燥地上部分中分离得到的一 种具有治疗慢性粒细胞白血病作用的羊毛留烷型三萜类化合物及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 香鳞毛蕨/ragra/3s(L. )Schott.是一种野生多年生蕨类植物，系鳞毛 蕨科鳞毛蕨属。其生境极其特殊，生于海拔700-2400米的林下或高寒地区的滑石坡、森林中 的碎石坡上和火山周围的岩浆缝隙中。主要分布于黑龙江省五大连池地质公园内、塔河县 白卡兽山、呼中的大白山的高山地带及小兴安岭北部地区。其中尤以生长于五大连池的香 鳞毛蕨活性最强。民间流传香鳞毛蕨对银肩病、头皮炎、干癣、痤疮等多种皮肤病有良好的 治疗效果。
[0003] 香鳞毛蕨的化学成分主要有间苯三酚类、黄酮类以及萜类等，具有多种药理作用， 是一种药用价值很高的植物。间苯三酚类不仅是鱗毛蕨属植物的主要特征性化学成分，也 是产生药理活性的主要成分。该类化合物主要由各种脂肪链取代的绵马酸片断和绵马酚片 断通过亚甲基连接而成。芳香环上的c-或〇-被不同的取代基取代形成了不同的化合物。黄 酮类化合物发现的数量不多，代表性的有4种，分别为(^38 8；[1'111201]10 81(16八、13、(]和 sutchuenos ide A。砲类化合物，包括倍半砲和三砲类。
[0004] 在黑龙江省北部的居民用香鳞毛蕨的水提取液涂擦患处治疗牛皮癣、皮疹、皮炎、 痤疮等，有的居民还用其水提取液洗头达到去头肩、止痒的目的。民间验方利用香鳞毛蕨已 有几十年的历史，通过多年的人体试验，证实香鳞毛蕨对老年性皮肤瘙痒、各种皮肤病的治 疗效果显著。现代药理研究表明香鳞毛蕨具有抗皮肤癣菌作用、治疗银肩病的作用、治疗痤 疮作用、止痒及抗过敏作用。

【发明内容】

[0005] 本发明的目的是提供一种从香鳞毛蕨的干燥地上部分中分离得到的一种具有治 疗慢性粒细胞白血病作用的羊毛留烷型三萜类化合物及其制备方法。
[0006] 本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的： 具有下述结构式的化合物（I)，
[0007] 所述的化合物（I)的制备方法，包含以下操作步骤：（a)将香鳞毛蕨的干燥地上部 分粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和 水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步骤 (a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再用75%乙醇洗脱10 个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（c)步骤(b)中75%乙醇洗 脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80 :1、45:1、25:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯 度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为15:1、 10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分;（e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键 合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱 液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(I)。
[0008] 进一步地，所述大孔树脂为D101大孔吸附树脂。
[0009] 进一步地，所述用乙醇热回流提取采用的乙醇浓度为80%。
[0010] -种药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物（I)和药学上可接受的载 体。
[0011] 所述的化合物(I)在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
[0012] 所述的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
[0013] 本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。
[0014] 该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物（I)，其余为药物学上可接受的、对 人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
[0015] 所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料 以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可 通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控 释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等;用于注射时，可制成灭菌的 水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。
【附图说明】
[0016] 图1为化合物(I)结构式。
[0017] 图2为化合物（I)理论ECD值与实验ECD值比较。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范 围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对 本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0019] 实施例1:化合物(I)分离制备及结构确证 试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试 剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。
[0020] 制备方法：（a)将香鳞毛蕨的干燥地上部分（10kg)粉碎，用80%乙醇热回流提取 (25LX3次），合并提取液，浓缩至无醇味（3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3 次)和水饱和的正丁醇（3LX 3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(431g)和 正丁醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用D101大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个 柱体积，再用75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸 膏（172g);(c)步骤(b)中75%乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1(8个柱体 积）、45:1 (8个柱体积）、25:1 (8个柱体积）、10:1 (10个柱体积)和1:1 (5个柱体积)的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(c)中组分4(65g)用正相硅胶进一步分离，依次用 体积比为15:1(8个柱体积）、10:1(10个柱体积)和5:1(8个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2(37g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百 分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8-12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的 化合物（I)(45mg)。
[0021] 结构确证：白色针状结晶；HR-ESMS显示[M+Na]+为m/z 551.2606,结合核磁特征 可得分子式为C3QH4Q〇8，不饱和度为11。核磁共振氢谱数据SH(ppm，DMSO-办，600MHz) :H-1 (2.87，m)，H-l(2.59，m)，H-2(3.ll，m)，H-5(3.29，m)，H-6(2.74，m)，H-12(2.88，m)，H-12 (2.72，m)，H-16(2.07，m)，H-16(1.85，m)，H-17(1.73，m)，H-18(1.40，s)，H-19(1.36，s)，H-20(2.38，m)，H-21(0.97，dJ=6.3)，H-22(2.61，m)，H-23(2.28，m)，H-24(3.15，m)，H-24 (2.52，m)，H-25(3.27，m)，H-27(1.28，dJ=7.2)，H-28(3.76，dJ=10.5)，H-28(3.64，dJ= 10.5)，11-29(1.09,8)，11-30(1.31，8) ;核磁共振碳谱数据5。(？?111，0150-办，1501他）：37.3 (CH2，1-C)，34.0(CH2,2-C)，215.7(C，3-C)，52.8(C，4-C)，44.1(CH，5-C)，37.6(CH 2,6-C)， 203.1(C，7-C)，151.2(C，8-C)，149.7(C，9-C)，39.1(C，10-C)，201.7(C，n-C)，52.8(CH2， 12-C)，46.5(C，13-C)，57.6(C，14-C)，207.2(C，15-C)，40.8(CH2，16-C)，49.5(CH，17-C)， 18.1(CH 3,18-0,18.3(CH3,19-0,33.2(CH, 20-0,19.7(CH3,21-0,50.2(CH2,22-C), 209.3(C，23-C)，47.2(CH2,24-C)，35.7(CH，25-C)，178.4(C，26-C)，18.2(CH 3,27-C)， 68.4CH2，28-C)，17.6(CH3，29-C)，24.3(CH 3，30-C);碳原子标记参见图 1。IR谱表明该化合物 含有羟基（3423cm-1)和a,不饱和羰基（1698cm-1)基团。此外，化合物在266和227 nm处有 最大紫外吸收。1H匪R谱显示四个单峰甲基信号SH1.40，1.36，1.31和1.09，二双峰甲基信 号 SHO. 97(J=6.3Hz)和 1.28(J=7.2Hz)，以及一个含氧亚甲基信号 SH3.64(dJ=10.5Hz)和 3.76((1，/=10.5抱）。130 NMR谱显示30个共振碳信号，六个甲基，八个亚甲基(一个含氧亚甲 基），四个次甲基，十二个季碳(六个羰基碳，两个烯烃季碳）。其中，共振信号SC203.UC-7)， 151 ? 2 (C-8 )，149 ? 7 (C-9 )和201 ? 7 (C-11)为共辄系统(C-7/C-8/C-9/C-11)的标志。HMBC 谱中 H2-l，H2-2，H-5，H2-28 和 Me-29 与 C-3，Me-29 和 H-5 与 C-28 的相关性，以及 ROESY 谱中 H2-28 和 H-5的相关性表明C-3为酮羰基，C-28为羟基亚甲基。HMBC谱中Me-21与C-17，C-20和C-22，H-20与C-22和C-23，H2-22与C-23和C-24，H-25与C-24和C-26，以及Me-27与C-24，C-25和C-26 的相关性表明C-23为酮羰基，C-26为羧基基团。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和R0ESY谱，以及文 献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验 确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0022]实施例2:化合物（I)药理作用试验 一、材料和仪器 K562细胞由中科院上海生物细胞所提供。化合物（I)为自制，HPLC归一化纯度大于98%。 RPMI-1640干粉培养基购于Gibco公司。小牛血清购于杭州四季青生物工程材料研究所。青 霉素、链霉素购于华北制药厂。Glutamine、MTT、DMSO购于AMRESCCLAnnexinv-FITC细胞凋亡 检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。M0PS，Rnasin、琼脂糖、嗅乙锭、溴酚兰华 美生物工程公司华美生物工程公司。
[0023] C02孵箱（美国Thermo公司），超净工作台（苏州净化设备厂），磁力搅拌器(上海南 汇电讯器材厂），倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），水平式离心机(上海安亭科学仪器厂），电 子分析天平(德国Sartorius公司），自动酶标仪(德国Humareader公司），U_3010型紫外分光 光度计（日本HITACHI公司），流式细胞仪（美国BECKMAN公司），Eppendorf Centrifuge 5417R离心机(德国Eppendorf公司）。
[0024]二、试验方法 1、K562细胞的培养 将新购买的细胞株的培养瓶表面用75%酒精擦拭3遍。将细胞悬液吸入离心管，lOOOrpm 离心10min。弃去上清，滴加含10%NBS的RPMI-1640完全培养基，轻轻吹打制备成细胞悬液。 接种于培养瓶中，置于37°C，5%C0 2培养箱中培养，每天换液传代。
[0025] 2、实验分组 正常对照组：10%NBS 的 RPMI-1640;实验组:D1:10%NBS 的 RPMI-1640+终浓度 100mg/L 化 合物（I) ;D2:10%NBS的即RPMI-1640+终浓度200mg/L化合物（I) ;D3:10%NBS的即RPMI-1640+ 终浓度400mg/L化合物（I) ; D4:10%NBS的即RPMI-1640+终浓度800mg/L化合物（I)。
[0026] 3、MTT法检测化合物（I)对K562细胞增殖的影响 (1)取生长状态良好的细胞，用含10%NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞悬液， 以5 X103细胞/孔接种于无菌96孔培养板中。（2)依实验分组，每组加入不同浓度的药物50ii L，设无细胞孔为空白对照组，每组设8个复孔，将96孔培养板放入⑶:^培养箱中培养;（3)24、 48和72h后取出96孔培养板，每孔加入20yL MTT(5mg/mL)，放入C02培养箱中孵育4h，即有紫 蓝色结晶物生成，在一定细胞数范围内，结晶物的生成量与细胞数成正比。（4)每孔加入酸 化的SDS 100yL放入C02培养箱中过夜。（5 )用酶标仪测定0D，比色时以空白孔调零。
[0027] 4、AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡 (1)取生长状态好的细胞，用含10%NBS的RPMI-1640培养液将细胞配制成细胞悬液，并 调整细胞浓度为5 X 105/mL，接种于无菌6孔培养板，每孔2mL细胞。（2)依实验分组加入不同 浓度药物，2mL/孔，将6孔培养板放入⑶:^培养箱中培养。（3)48h和72h后收集各孔细胞于离 心管中，lOOOrpm离心5min，弃上清。（4)用4°C预冷的PBS洗涤细胞两次，（1500rpm，离心 5min)，弃上清，用200iiL Binding Buffer悬浮细胞，并移入流式管中。（5)每管加入5yL Annexinv-FITC混合后，加入5yL PI，混匀。（6)室温，避光反应lOmin，用流式细胞仪检测。 [0028] 5、统计学处理 实验组和对照组均重复3次操作，结果用(x±s表示，P〈0.05示有显著性差异。组间比较 采用单因素方差分析。所有数据用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。
[0029]三、结果及结论 1、MTT法检测化合物（I)对K562细胞的增殖抑制作用 化合物（I)作用K562细胞24h、48h、72h后，用酶标仪检测0D49Q显示:作用24h后D1和D2实 验组对细胞K562细胞抑制作用不明显（？>0.05，？>0.05)，03和04可明显抑制562结果（卩〈 0.05，P〈0.01)，作用48h和72h后，不同浓度的化合物（I)均可抑制K562细胞增殖，且随剂量 和时间的增加抑制细胞增殖的作用增强。结果见表1 (*:和对照比P〈〇.05;:和对照比P〈 0.01)〇
[0030] 2、Annexinv-FITC/PI双染流式细胞仪分析结果 磷脂酞丝氨酸(Phosphotidyl Serine，PS)外翻是细胞凋亡的早期事件。AnnexinV是一 种Ca2 +依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。先后标记了 FITC和PI (Propidium Iodide)的双染细胞，可通过流式细胞仪将活细胞、早期凋亡细胞(双参数散点 图右下象限）、晚期凋亡细胞及坏死细胞区分开。结果表明不同浓度的化合物（I)作用K562 细胞48h和72h均可明显诱导K562细胞早期凋亡，这种效应随化合物（I)的浓度增加和作用 时间延长而明显增强。结果见表2(*:和对照比P〈0.05; #:和对照比P〈0.01)。
[0031]结论，化合物（I)可直接抑制K56 2细胞的增殖，抑制能力随浓度的增加和作用时间 的延长而增强。同时，化合物（I)可诱导K562细胞凋亡，且这种促凋亡的效应随着浓度和时 间的增加而增加。研究结果显示，化合物（I)可能为慢性粒细胞白血病的治疗提供一种潜在 的手段。
[0032] 表1不同浓度的化合物（I)作用K562细胞后的MTT值(x土s，N=8)
表2不同浓度化合物（I)作用K562细胞后早期凋亡率(x土s，N=3)
实施例3 片剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(I )，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或 甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:7的比例 加入赋形剂，制粒压片。
[0033] 实施例4 口服液制备:按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或 甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。
[0034] 实施例5 胶囊剂或颗粒剂的制备:按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比 为1:7的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0035] 实施例6 注射液的制备:按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸 或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封 灭菌制成注射液。
[0036] 实施例7 无菌粉针的制备:按实施例1方法先制得化合物(I)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬 酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅 拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉 针剂。
[0037] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I)，2. 权利要求1所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于包含W下操作步骤：（a)将香鱗 毛藤的干燥地上部分粉碎，用75~85%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用 石油酸、乙酸乙醋和水饱和的正下醇萃取，分别得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下 醇萃取物；（b)步骤(a)中乙酸乙醋萃取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱8个柱体积，再 用75%乙醇洗脱10个柱体积，收集75%乙醇洗脱液，减压浓缩得75%乙醇洗脱物浸膏；（C)步骤 (b)中75%乙醇洗脱物浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为80:1、45:1、25:1、10:1和1:1的 二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到5个组分；（d)步骤(C)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用 体积比为15:1、10:1和5:1的二氯甲烧-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤(d)中组分2用 十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为75%的甲醇水溶液等度洗脱，收集8~ 12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得纯的化合物(I)。3. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述大孔树脂为D101大 孔吸附树脂。4. 根据权利要求2所述的化合物（I)的制备方法，其特征在于:所述用乙醇热回流提取 采用的乙醇浓度为80%。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物（I) 和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I)在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的应用。
【文档编号】A61K31/575GK105968158SQ201610386891
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】郑巧丹
【申请人】郑巧丹