一种具有转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种转糖苷活性耐热β?半乳糖苷酶突变体，该突变体是通过对β?半乳糖苷酶BgaB催化氨基酸位点E303由原谷氨酸(Glu)定点突变为半胱氨酸(Cys)，再将半胱氨酸巯基氧化为?SOO?所得。本发明还设计所述突变体的制备方法与应用。本发明以嗜热脂肪芽孢杆菌来源β?半乳糖苷酶BgaB为对象，采用定点突变体与化学修饰结合的方法，显著加快了转糖苷活性的功能进化效率，并提高了低聚半乳糖的合成量，实现在中温、中性环境下的低聚半乳糖合成量由野生型酶的0％提高到11.5％，突破了现有技术中需要在酸性环境下进行反应的局限，同时避免了在低聚半乳糖合成的同时发生底物或产物的水解。
【专利说明】一种具有转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体及其制备方法 【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种具有转糖苷活性耐热β-半 乳糖苷酶突变体，还涉及一种具有转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体的制备方法。 【【背景技术】】
[0002] 0-半乳糖苷酶（0-〖3]^〇1:〇8 1(^86)全称为0-〇-半乳糖苷半乳糖水解酶（0-〇- galactoside galacto hydrolase，EC3.2.1.23)，具有催化乳糖水解和转糖苷两种功能。食 品工业多以乳糖作为底物，通过β-半乳糖苷酶的转糖苷作用制备低聚半乳糖(G0S)。本发明 所涉及嗜热脂肪芽孢杆菌来源的β-半乳糖苷酶BgaB属于GH42家族，是一种具有工业应用潜 力的耐热型酶，可以在较高温度溶解高浓度反应底物乳糖，进行乳糖水解与转糖苷催化反 应。但是，由于β-半乳糖苷酶转糖苷活性较弱，特别是GH42家族β-半乳糖苷酶，由于进化过 程中以乳糖作为碳源进行代谢的机会较少，因而对乳糖利用能力普遍较低;另外，β-半乳糖 苷酶在催化底物合成低聚半乳糖的同时也会催化底物及产物水解反应。半乳糖苷酶的这 种催化特点，严重制约了低聚半乳糖合成量，并成为阻碍低聚半乳糖产业化发展的主要技 术瓶颈问题。
[0003] 近年来，虽然人们也对β-半乳糖苷酶转糖苷活性进行了基础理论研究和功能改 造，但对G 0 S合成能力的分子改良方法还存在许多不足。如，中国发明专利申请C Ν 201410148999公开了一种半乳糖苷酶突变体。该突变体是通过对亮白曲霉或米曲霉β-半乳 糖苷酶基因进行点饱和突变制得。由于亮白曲霉或米曲霉来源半乳糖苷酶为适酸性半 乳糖苷酶，其最适pH在ρΗ2.5~5.5，这一催化特性一定程度上限制了其作为催化剂在高温 及中性条件下合成低聚半乳糖;另外，在突变体的基因改造及制备方法方面，该突变体酶的 获得是通过同源建模及底物对接的方法，对可能具有催化功能的位点进行预测，并对这些 预测位点进行饱和突变。因此，其功能优化突变体还需要通过对上百个突变体的酶活性进 行筛选与活性分析后才能获得。这种方法的主要缺陷为，突变体的成功获得需要依靠生物 信息学及预测算法的准确性，同时还需要配合高灵敏度较高的高通量筛选方法。不仅操作 繁杂而且成功率相对较低，另外，在该方法应用于转糖苷活性的改造时，由于筛选的单向 性，不能有效的兼顾水解活性对转糖催化效率的影响作用，导致筛选所得转糖苷活性提高 突变体存在水解活性同时提高的现象。
[0004] 对于β-半乳糖苷酶，随着对其结构与功能研究的不断发展，已知β-半乳糖苷酶氨 基酸序列数目已达上千个，分属于糖苷水解酶GH1、GH2、GH35、GH42、GH50和GH59家族。特别 是GH42家族酶，多具有耐热、耐酸等适应工业化生产需要的酶学特性，从而越来越受到人们 的关注。从2002年GH42家第一个三维结构被解析开始，发展到现在已有4个晶体结构被陆续 发表。
【申请人】围绕BgaB功能位点开展了多年的研究，并在发明CN 201110170088.8中对BgaB 的突变体的催化氨基酸位点的进行过推测，在本项发明中第一次通过试验确认氨基酸位点 E303为催化氨基酸位点。
[0005] 已有研究证明，亲核氨基酸在酶结构中的位置及类型对酶的催化活性至关重要。 如2010年0&1'代11￥.&3〇1<:13111'11等人米用同样方法对0611111〇1]1〇11&8；1^111；[来源纤维素酶0611八 的两个推测催化位点Asp392和Asp216进行半胱氨酸替换和化学修饰。研究结果表明， Asp216并不是催化碱，同时也确认了 Asp392的催化碱作用。类似的方法对Thermobif ida fusca来源保持型水解酶Cel5A的催化氨基酸位点Asp252进行改造和化学修饰，没有得到具 有活性的酶。以上研究结论共同表明，无论是保持型还是反转型催化机制水解酶，通过对催 化残基进行半胱氨酸替换及巯基氧化，可以改变酶的催化活性，包括提高转糖苷活性。但同 时，也并不是所有推测催化位点均具有以上催化作用，还需要对催化氨基酸进行确认。同时 该方法仅应用于少数水解酶的功能改造及研究中，对其他水解酶的催化改变是否具有作用 均未有验证。 【
【发明内容】
】
[0006] 基于以上研究背景，针对本领域基因改造理论问题及G0S合成中存在的实际技术 难题，本发明以GH42家族嗜热脂肪芽孢杆菌来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB为研究对象，期望 将定点突变与化学修饰相结合的基因改造方法应用于半乳糖苷酶的功能改造中，实现转 糖苷活性的高效定向改造。在本发明中，先通过试验确认氨基酸位点Ε303为催化氨基酸位 点，为半乳糖苷酶的基因工程改造与应用提供理论支持，再通过半乳糖苷酶功能进化 方法获得具有高转糖苷活性β-半乳糖苷酶突变体。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供一种转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体，该突 变体是通过对β-半乳糖苷酶BgaB催化氨基酸位点Ε303由原谷氨酸(Glu)定点突变为半胱氨 酸(Cys)，再将半胱氨酸巯基氧化为-S0(T所得。
[0008] 在本发明中，所述β-半乳糖苷酶BgaB是嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷 酶BgaB。
[0009] 本发明还提供一种转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体的制备方法，其特征在于 该制备方法的步骤如下：
[0010] Α、突变体酶的构建
[0011]以含有嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热半乳糖苷酶基因 BgaB的质粒ρΚΚ223-3-bgaB为模板，以快速全质粒扩增突变法对位点E303构建半胱氨酸Cys替换单点突变体，得到 突变体E303C;
[0012] B、突变体酶的表达与纯化
[0013]将全质粒扩增得到的突变PCR片段经胶回收及双酶切后，与pKK223-3载体的双酶 切产物进行连接，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞（由江南大学食品生物技术中心菌种库 Culture Collection of Food Microorganisms , Jiangnan University CCFM提供）；挑取 重组菌单克隆接种于5mL LB抗性培养基中，37°C下培养过夜，按以体积比计1%接种量将种 子液接种于含有氨节青霉素的LB液体培养基中，37 °C振荡培养，当0D6QQ达到0.6~1.0时，加 入诱导剂IPTG，20°C过夜诱导表达后，对发酵液进行离心，去上清、收集菌体，再以5~10倍 体积磷酸缓冲液重悬，加入蛋白酶抑制剂后进行超声波破壁，得到破胞液;将破胞液进行热 处理去除不耐热的杂蛋白后，离心收集上清液，得到粗酶液；
[0014]将上述粗酶液用镍亲和柱纯化分离后收集洗脱液，然后用50mM pH 7.0磷酸缓冲 液透析去除咪唑，再用聚乙二醇包埋浓缩制得未经氧化的突变体酶；
[0015] C、突变体酶的氧化
[0016] 将步骤B得到的未经氧化的突变体酶进行氧化反应，氧化反应体系如下：100yL 0.25M pH6.5磷酸盐缓冲溶液、0~300mM ΚΙ溶液、ΙΟμΜ Br、3yM突变体酶，在温度25°C条件 下处理30h，得到所述转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体。
[0017] 在本发明中，步骤Α中，全质粒扩展产物可直接用于转化表达，然而，优选地进行基 因构建可以防止载体发生突变干扰正常表达。
[0018] 在本发明中，步骤A中PCR反应条件为:94°C预变性2min;95°C变性30s;63°C~65°C 30s ;68°C7min，进行16个循环，最后68°C延伸15min;
[0019] ?〇?反应体系为：(1町？8(2111]\〇541^、10\1(00?1118 81^.541^、1(00?1118 141^、]\%5〇4 2 yL、上游引物1.5yL、下游引物1.5yL、模板lyL、去离子水33yL，总体积50yL。其中，引物序列 如下所示，
[0020] E303C上游引物：
[0021 ] 5 ' -GTCAACCGTTTATTTTGATGTGCCAGGTAACCTCACATGTTAA-3 ' E303C 下游引物：
[0022] 5 '-TTAACATGTGAGGTTACCTGGCACATCAAAATAAACGGTTGAC-3，
[0023]根据一种优选的实施方式，步骤B中超声波破壁的工作条件为：功率400W循环工 作，每个循环包括工作Is和停止9s，总破壁时间为30min。
[0024] 优选地，步骤B中，用镍亲和柱纯化分离后收集洗脱液的过程如下：向4mL镍亲和柱 加入5倍柱体积去离子水至柱顶端自然洗脱后用2~3倍体积的Binding buffer自然洗脱； 再将经0.22μπι滤膜过滤的粗酶液上柱，慢流使样品与柱充分结合，待样品流干后分别用6倍 柱体积的Washing buffer连续梯度洗脱(共3次)洗脱杂蛋白质，最后用4倍Elution buffer 洗脱目的蛋白，收集洗脱液；
[0025] 所述Binding buffer含20mM咪唑；所述Washing buffer分别含咪唑20mM、80mM、 100mM;所述Elution buffer含250mM咪挫。
[0026] 根据一种优选的实施方式，步骤C中ΚΙ溶液为200-300mM，即突变体氧化反应体系 组成浓度为0.25M pH6.5磷酸盐缓冲溶液100yL、0.2-0.3M KI溶液、10μΜ Br、3yM突变体酶。
[0027] 本发明还涉及上述转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体在生产低聚半乳糖中的 用途。
[0028]研究结果表明，β-半乳糖苷酶的氨基酸位点Glul48和Glu303为催化活性位点。其 中，将Ε303位点通过半胱氨酸替换，并采用200-300mM ΚΙ对突变体酶进行氧化处理，将半胱 氨酸巯基氧化为_S0(T，可将野生型酶在乳糖初始浓度为350mM，55°C，30h下低聚半乳糖合 成量由0%提高到11.5%，显著提高转糖苷催化活性，增加了产物G0S合成量。
[0029] 针对目前基于半理性分子设计对酶进行功能改造这种方法中存在的不足，本发明 以嗜热脂肪芽孢杆菌来源半乳糖苷酶BgaB为对象，采用定点突变体与化学修饰结合的方 法，无需依靠氨基酸位点功能预测、省去了突变体库高通量功能筛选的繁杂过程，显著加快 了转糖苷活性的功能进化效率，并提高了低聚半乳糖的合成量，实现在中温、中性环境下的 低聚半乳糖合成量由野生型酶的〇%提高到11.5%，突破了现有技术中需要在酸性环境下 进行反应的局限，同时避免了在低聚半乳糖合成的同时发生底物或产物的水解。
[0030] 本发明基于催化氨基酸位点的构建方法适用于所有采用保持型(Retaining)催化 机制β-半乳糖苷酶进行转糖苷活性改造。 【【附图说明】】
[0031]图1半乳糖分子与β-半乳糖苷酶BgaB活性口袋结合模型；
[0032]图2野生性及突变酶的蛋白质凝胶电泳图（SDS-PAGE);
[0033] 其中，WT表示野生型β-半乳糖苷酶，泳道1为E303A，泳道2为E303C
[0034] 图3 ΚΙ氧化处理对E303C突变体活性的影响；
[0035] 其中:Α.ΚΙ浓度对突变体酶活的影响;Β.氧化时间对突变体酶活的影响
[0036] 图4野生型及突变体酶反应产物的薄层色谱图（TLC);
[0037] 其中，
[0038]图5野生型酶及0X-E303C突变体催化乳糖反应产物的HPLC图谱；
[0039]其中，Α.野生型酶催化乳糖水解产物;B. 0X-E303C突变体催化乳糖水解产物;C、初 始底物。 【【具体实施方式】】
[0040]在本发明中如无特别声明，用于表示浓度的"％"均为重量百分比。
[0041 ] 实施例1
[0042] 1.E303C突变体的构建
[0043]通过对BgaB进行分子模拟及半乳糖、乳糖分子与酶的对接，预测了 β-半乳糖苷酶 催化关键位点及参与底物结合的关键氨基酸位点为Glul48和Glu303(如图1)。其中，根据序 列比对Glu303为亲核(Nucleophile)氨基酸的同源位点。在保持型和反转型催化机制水解 酶中，催化残基对酶的活性起到关键作用。由此，推测Glu303位点可能对β-半乳糖酶BgaB催 化活性具有调控作用，因此将Glu303氨基酸位点作为研究和改造目标位点。
[0044] 对此，以含有嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶基因 bgab的质粒 pKK223-3-bgaB为模板(该质粒由江南大学食品生物技术中心菌种库(Culture Collection of Food Microorganisms Jiangnan University CCFM)提供，或参考中国发明专利申请 CN 102250856A，或参见文献Dong YN等人，Enhancement of the hydrolysis activity of beta-galactosidase from Geobacillus stearothermophilus by saturation mutagenesis . JDairy Sci 2011,94(3):1176-1184)，采用快速全质粒扩增突变法（ QuickChange:⑩site-directed mutagenesis protocol)针对选择位点构建Cys和Ala替 换单点突变体，分别构建了单点突变体E303C和E303A。引物设计如表1所示。
[0045] 表丨定点突变引物核酸序列
[0047]突变PCR反应体系组成如表2所示：
[0048] PCR反应条件为：94°C预变性2min; 95°C变性30s;63°C~65°C，30s;68°C7min，16个 循环，最后68°C延伸15min。
[0049] 表2突变PCR反应体系
[0051]通过序列与结构比对推测得知E303位点的催化作用，因此E303A突变体可作为 E303C的对照，是以无侧链基团的Ala氨基酸替换E303位点所得，相当于E303位点缺失突变 体。因此，E303A突变体活性变化可用于验证E303位点的催化关键点作用。
[0052] 2.突变体的表达与纯化
[0053]扩增得到的PCR片段经回收后，与pKK223-3载体连接转化至大肠杆菌JM109感受态 细胞（由江南大学食品生物技术中心菌种库Culture Collection of Food Microorganisms,Jiangnan University CCFM提供）。
[0054]嗜热脂肪芽孢杆菌来源的野生型β_半乳糖苷酶及突变体酶的C-端均融合有6 X His标签用于纯化。分别挑选含有野生型β-半乳糖苷酶与突变体E303C和E303A的重组大肠 杆菌单克隆接种于5mL含有100yg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C下摇床振荡培养过夜。 按1% (体积比）接种量将饱和种子液接种于200mL添加有氨苄青霉素（100yg/mL，购自上海 生工)的LB液体培养基中，37 °C振荡培养。当0D6QQ达到0.6~1.0时，加入诱导剂IPTG (终浓度 达ImM)。20"€过夜诱导表达后，将发酵液于3000rpm下离心20min，去上清、收集菌体。用5~ 10倍体积lOOmM磷酸缓冲液(pH7.0)重悬，加入蛋白酶抑制剂（1 X Cocktai 1)后，采用VCX500 超声波破碎仪(Sonics&Materials)超声波破壁。破壁工作条件为:工作ls，停9s，总工作时 间为30min。将破胞液55°C热处理30min去除不耐热的杂蛋白后，采用5415R/5804R冷冻离心 机(Eppendorff) 12000rpm离心20min收集上清，分别得到野生型β-半乳糖苷酶及突变体酶 Ε303Α和E303C的粗酶液。
[0055] LB液体培养基配方:蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠 10g/L，余量为水。
[0056] LB抗性培养基:在LB培养基中加入氨卞青霉素至终浓度为100yg/mL，用于重组菌 的培养和筛选。
[0057] 将野生型、单点突变体酶E303A和E303C的粗酶液分别进行镍亲和柱（Ni- Chelating Column，购自Qingen公司）纯化：向4mL镍亲和柱加入5倍柱体积去离子水至柱顶 端自然洗脱后用2~3倍体积的Binding buffer(含咪唑浓度20mM)自然洗脱;再将经0.22μπι 滤膜过滤的粗酶液上柱，慢流使样品与柱充分结合，待样品流干后分别用6倍柱体积的 Washing buffer(分别含咪唑浓度20mM、80mM、100mM)连续梯度洗脱洗脱杂蛋白质，最后用4 倍Elution buffer(含250mM咪唑）洗脱目的蛋白，收集洗脱液。然后用50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)透析除去咪唑，再用聚乙二醇包埋浓缩，分别制得纯化的野生型β_半乳糖苷酶及突变 体酶蛋白Ε303Α和E303C样品。
[0058]米用Basic 041BR蛋白质电泳仪（Bio-Rad Laboratories)SDS_PAGE，经Geldoc 2000凝胶成像系统(Bio-Rad Laboratories)，显示野生型及突变体酶均得到大小为70kDa 单一的蛋白条带（如图2所示）。表明突变体酶E303A和E303C的分子量相对野生型酶均并未 发生明显改变。
[0059] 3.耐热β-半乳糖苷酶比酶活测定
[0000] 按中性乳糖酶的酶活检测方法Gist-Bracades法测定野生型耐热β-半乳糖苷酶、 突变体酶Ε303Α和E303C的酶活并略有改动。
[0061 ]以ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷)为底物，一个中性乳糖酶单位定义为:在温 度70°C、pH6.5条件下，每分钟水解产生Ιμπιο?的oNP(邻硝基苯酚)所需的酶量为一个中性乳 糖酶活性单位(NLU或U)。
[0062] 分别取0. lmL酶液和0.9mL磷酸盐缓冲液(pH=6.5)加入10mL离心管中，混合，调温 至70°C。加5. OmL 0.25%的oNPG，混匀，同时开始计时。反应10min后迅速取出置于冰水浴中 并加入2.OmL 5%Na2C03终止反应。室温下用分光光度计(420nm，UV-2100可见分光光度计， 购自尤尼柯上海仪器有限公司）以空白值为参比测定样品吸光度。
[0063] 空白值:将0 . lmL酶液、0.9mL磷酸盐缓冲液(pH = 6.5)和2. OmL Na2C03混合后加 5 · OmL底物溶液，于420nm处测定吸光度。
[0064]按以下公式计算酶活：
[0066]其中：
[0067] E420-420nm处的吸光度值;Ew-0. lmL所用酶液含酶的重量(g) ;8-反应总体积； 10一反应时间(min);4.45-在实验条件下Ιμπιο? oNP/mL的吸光度值。
[0068] 4.蛋白质含量测定
[0069] 采用BCA法测定野生型耐热β-半乳糖苷酶、突变体酶E303A和E303C的蛋白质含量。 BCA蛋白定量试剂盒购自北京庄盟生物基因科技有限公司。
[0070] 测定步骤如下：
[0071] (1)试剂Α:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒石酸钠、0.4%氢氧化钠、 0.95 %碳酸氢钠，将上述液体混合后调pH至11.25。
[0072] (2)试剂B:4%硫酸铜。
[0073] (3)BCA工作液:试剂A 100mL+试剂B 2L，混合。
[0074] (4)蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为 1.5mg/mL的蛋白质标准液。反应体系如3所示，
[0075]表3BCA法测定蛋白质含量
[0077] (5)待测样品
[0078] 将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。以蛋白质 含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。用测定管光吸收值在标准曲线上查找相 应的蛋白质含量，再计算出待测样品中蛋白质浓度(g/L)。
[0079] 比较野生型耐热β-半乳糖苷酶、突变体酶E303A和E303C的比酶活，结果如表4所 不。
[0080] 表4野生型及突变体酶以ONPG为底物的转糖苷活性比较分析
[0082]结果表明，作为对照的突变体E303A未检测到水解活性，而突变体E303C的比酶活 较野生型大幅降低，仅为野生型酶活的0.6%，这一试验结果确认了 E303在催化过程中具有 关键作用，与试验假设相符。
[0083] 5.E303C巯基侧链的氧化
[0084]根据分子对接的预测结果，所有参与底物结合的氨基酸位点中无半胱氨酸，因此 对E303C突变体进行氧化，以研究其巯基氧化对酶活性的影响，并以野生型酶的氧化体作为 对照。
[0085] 为了获得最佳氧化条件，选择浓度范围为0-300mM KI对E303C突变体及野生型酶 进行氧化处理(反应体系为l〇〇yL，含0.25M磷酸盐缓冲溶液(pH6.5)，ΙΟμΜ Br，KI浓度为0-300mM，余量为水。分别向反应体系中加入野生型和突变体酶3μΜ，25Γ处理），得到经过氧化 的野生型和经过氧化的E303C突变体0X-E303C。
[0086] ΚΙ浓度及处理时间对野生型及0X-E303C突变体酶活性影响如图3所示。
[0087]结果表明，随着ΚΙ浓度的增大，其对野生型酶(WT)活性的影响并不显著，野生型酶 活保持在34.1-37.2U/mg。表明ΚΙ氧化处理对野生型酶的水解活性影响极弱。而巯基氧化突 变体0X-E303C酶活性随KI浓度的增大而增加。当KI浓度为200mM时，突变体酶活最高，达到 3.85U/mg;当KI浓度继续增大时，酶活略有降低，并维持不变。以上试验结果表明巯基氧化 能够显著降低突变体酶0X-E303C的水解活性，且200mM KI处理可以得到稳定的酶活。因此， 选择以200mM ΚΙ作为氧化处理浓度。
[0088] 由图3Β可知，当处理时间达到8天时，0x-E303C活性达到最大，为3.98U/mg。而在相 同处理条件下，野生型(WT)酶活随处理时间的延长酶活变化不显著。
[0089] 6.转糖苷活性的定性分析
[0090] 为了对反应产物进行定性分析，反应混合物采用薄层色谱(TLC)进行分离。在标准 反应条件下，以乳糖为底物的反应体系，乳糖浓度为350mM，酶用量150mM。取lh反应混合产 物(4μ〇滴加在TLC平板上进行薄层色谱分析。
[0091] 其中，薄层色谱(TLC)分析方法如下：
[0092] (1)制备显色剂
[0093] 3，5-二羟基甲苯和硫酸：取0.25g的3，5-二羟基甲苯溶于400mL水中溶解，加入 10mL的浓硫酸，转移到500mL的容量瓶中，水洗烧杯2-3次，把洗液倒入容量瓶中，定容备用。 [0094] 苯胺-二苯胺和磷酸:称取4g二苯胺、4mL苯胺，量取20mL85 %磷酸共溶于200mL丙 酮中备用。
[0095]苯胺-二苯胺-丙酮:称取4g二苯胺、4mL苯胺溶解于200mL丙酮中。
[0096] (2)制备展开剂
[0097]低聚半乳糖易溶于水，极性较大，本发明通过对展开剂进行选择及溶剂系统比例 优化，获得最优展开系统为(体积比）正丁醇：乙醇:水=5:3:2。
[0098] (3)薄层条件
[0099]取20mL配制好的展开剂倒入放层析缸中，盖上磨口玻璃盖。取出硅胶预制板，利用 铅笔和直尺在距离底部1厘米处划一道直线，沿直线用毛细管点样器点样，点样点的直径不 超过5厘米。将点好样的硅胶板放入层析缸中，跑样一个小时，跑样结束后用吹风机把硅胶 板吹干。用喷瓶将显色剂以雾状喷在硅胶板上，至整个板面均匀喷湿为止。随后，将硅胶板 置于80°C的鼓风干燥箱中烘干lOmin，拿出硅胶板观察显色情况。
[0100] 结果如图4所示。
[0101] 图4为野生型酶及突变体酶反应产物的薄层色谱分析图。其中，左1为对照，左2为 0X-E303C，左3为E303C，左4为野生型酶。由图可知，只有突变体0X-E303C的反应产物中出现 了转糖苷产物色斑，而突变体E303C和野生型酶产物在相应位置均未出现产物色斑。试验结 果表明，0X-E303C突变体提高了野生型酶的转糖苷催化能力。
[0102] 7.转糖苷产物的液相色谱分析(HPLC)
[0103]对前述的野生型酶和0X-E303C的转糖苷产物的定量比较分析，并与底物进行对 比。以乳糖为底物的转糖苷反应标准体系包括500mM乳糖和92mU酶。取30h反应混合产物20μ L，采用95°C5min终止反应。将反应体系进行梯度稀释后，分别进行高效液相色谱分析。
[0104] 色谱参考条件:柱温35°C;流动相为乙腈-水(65+35，￥八）；流速1.〇111171^11;进样量 20yL〇
[0105] 图5中各峰值面积数值如下：
[0106] A野生型酶产物的峰面积数值表
[0108] B OX-E303C产物的峰面积数值表
[0110] C底物的峰面积数值表
[0112] 由液相色谱结果可知，图5A的野生型酶的反应产物中，乳糖全部被水解为半乳糖 和葡萄糖，二者在液相中很难被完全分离，显示为一个峰。
[0113] 而图5B的0X-E303C催化反应体系中，形成了新的产物峰，分子量大于单糖和双糖。 其具体聚合度通过液相暂不能确定，但可以表明其应为大于二糖的低聚糖，同时由于其水 解能力低于野生型酶，在体系中残留了一部分乳糖。根据图5B和图5C液相色谱的产物峰面 积(722499)与初始底物样品峰面积(83087)计算，得知G0S产物量为11.5 %。
[0114] 结果表明突变体0X-E303C可将野生型酶在乳糖初始浓度为350mM，55°C，30h下低 聚半乳糖合成量由〇%提高到11.5%，显著提高转糖苷催化活性，增加了产物G0S合成量，优 于其他现有技术。
[0115] 基于以上研究，本发明以GH42家族嗜热脂肪芽孢杆菌来源耐热β-半乳糖苷酶BgaB 为研究对象，将定点突变与化学修饰相结合的基因改造方法，首次成功应用于半乳糖苷 酶的功能改造中。在本发明中第一次通过试验确认氨基酸位点Ε303为催化氨基酸位点，为 β-半乳糖苷酶的基因工程改造与应用提供理论支持。更提出了一种高效的β-半乳糖苷酶功 能进化方法，并获得了具有高转糖苷活性β-半乳糖苷酶突变体。
【主权项】
1. 一种具有转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体，其特征在于该突变体是通过对β-半 乳糖苷酶BgaB催化氨基酸位点Ε303由原谷氨酸(Glu)定点突变为半胱氨酸(Cys )，再将半胱 氨酸巯基氧化为-SOO-所得。2. 根据权利要求1所述的β_半乳糖苷酶突变体，其特征在于所述β_半乳糖苷酶为嗜热 脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶BgaB。3. -种转糖苷活性耐热β_半乳糖苷酶突变体的制备方法，其特征在于该制备方法的步 骤如下： Α、突变体酶的构建 以含有嗜热脂肪芽孢杆菌来源的耐热β-半乳糖苷酶BgaB基因的质粒pKK223-3-bgaB为 模板，以全质粒扩增突变法对E303位点进行定点突变，将谷氨酸（Glu)突变为半胱氨酸 (Cys)，得到突变体E303C; B、 突变体酶的表达与纯化 将全质粒扩增得到的定点突变PCR片段经胶回收及双酶切后，与PKK223-3载体的双酶 切产物进行连接，转化至大肠杆菌JM109感受态细胞;挑取重组菌单克隆接种于5mL LB抗性 培养基中，37 °C下培养过夜，按以体积比计1 %接种量将种子液接种于含有氨节青霉素的LB 液体培养基中，37°C振荡培养，当OD6qq达到0.6~1.0时，加入诱导剂IPTG，20 °C过夜诱导表 达后，对发酵液进行离心，去上清、收集菌体，再以5~10倍体积磷酸缓冲液重悬，加入蛋白 酶抑制剂后进行超声波破壁，得到破胞液;将破胞液进行热处理去除不耐热的杂蛋白后，离 心收集上清液，得到粗酶液； 将上述粗酶液用镍亲和柱纯化分离后收集洗脱液，然后用50mMpH 7.0磷酸缓冲液透析 去除咪唑，再用聚乙二醇包埋浓缩制得未经氧化的突变体酶； C、 突变体酶的氧化 将步骤B得到的突变体酶进行氧化处理，氧化反应体系为0.25M pH6.5磷酸盐缓冲溶液 100yL、0~300mM KI溶液、ΙΟμΜ Br、3yM突变体酶，在温度25°C条件下处理30h，得到所述β- 半乳糖苷酶突变体。4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤A中扩增引物为： E303C上游引物： 5 '-GTCAACCGTTTATTTTGATGTGCCAGGTAACCTCACATGTTAA-3' E303C下游引物： 5 '-TTAACATGTGAGGTTACCTGGCACATCAAAATAAACGGTTGAC-3， PCR 反应条件为：94°C 预变性 2min;95°C 变性 30s;63°C ~65°C30s;68°C7min，进行 16 个 循环，最后68°C延伸15min; PCR反应体系为：dNTPs(2mM)5yL、10XK0D plus Buf.5yL、K0D plus lyL、MgS〇4 2yL、上 游引物1.5yL、下游引物1.5yL、模板IyL、去离子水33yL，总体积50yL。5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤B中超声波破壁的工作条件为：功 率400W，总破壁时间为30min，其中超声破壁工作ls，停止9s。6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤B中，用镍亲和柱纯化分离后收集 洗脱液的过程如下：向4mL镍亲和柱加入5倍柱体积去离子水至柱顶端自然洗脱后用2~3倍 体积的Binding buffer自然洗脱;再将经0.22μηι滤膜过滤的粗酶液上柱，慢流使样品与柱 充分结合，待样品流干后分别用6倍柱体积的Washing buffer连续梯度洗脱洗脱杂蛋白质， 最后用4倍Elution buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱液。 所述Binding buffer含20mM咪唑；所述Washing buffer分别含咪唑20mM、80mM、IOOmM; 所述Elution buffer含250mM咪挫。7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤C中KI溶液为200-300mM。8. 权利要求1或2所述的转糖苷活性耐热β-半乳糖苷酶突变体或根据权利要求3-7中任 一项制备方法得到的转糖苷活性耐热半乳糖苷酶突变体在生产低聚半乳糖中的用途。
【文档编号】C12P19/14GK105950589SQ201610580177
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】陈海琴, 董艺凝, 陈卫, 赵建新, 陈永泉, 张灏
【申请人】江南大学