一种猪溶菌酶来源的饲用抗菌十二肽及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种猪溶菌酶来源的饲用抗菌十二肽及其制备方法，属于生物工程领域。本发明的制备方法包括了粗提液的制备，凝胶过滤色谱柱Superdux Peptide 10/300GL的分离，和反相柱Phenomenex luna C18分离纯化。经LC?MS鉴定，该抗菌十二肽的氨基酸序列为：G?V?S?L?A?N?W?V?C?L?A?K，此抗菌肽属于碱性肽，对革兰氏阴性菌具有明显抗性，是对猪溶菌酶的抗菌谱的良好补充和拓展。经与抗菌肽数据库(The Antimicrobial Peptide Database)等数据库比对，此种抗菌肽并未见报道。本发明制备工艺具有简单、高效的特点，产物纯度经质谱鉴定可达95％以上。
【专利说明】
一种猪溶菌酶来源的饲用抗菌十二肽及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种猪溶菌酶来源的饲用抗菌十二肽及其制备方法，属于生物工程领 域。
【背景技术】
[0002] 几十年来，抗生素通过抑制病原微生物增殖，减少其代谢毒素对动物的毒害作用 而在防治动物的疾病、促进动物的生长、提高畜禽产品的产量等方面起到了积极的作用。但 是长期的使用抗生素，尤其是饲养过程中使用抗病药物、促生长添加剂等，会造成药物的残 留超标，产地的环境污染，导致肌肉的品质和加工产品的质量下降。除此之外，禽畜长期使 用抗生素作饲料添加剂，可使某些菌群变为耐药菌株，从而带来预防与治疗人畜某些疾病 的困难。
[0003] 欧盟监管委员会决定，自2006年1月起在动物养殖业中禁用抗生素生长促进剂。从 2013年12月开始，美国FDA发布了《兽医饲料指令》，要求有执照的兽医监督抗生素的使用， 计划从2014年起，用3年时间禁止在牲畜饲料中使用预防性抗生素，最大限度地减少食用牲 畜带给消费者抗生素耐药性问题。韩国也计划在2018年7月全面禁止饲用抗生素的使用。
[0004] 随着细菌对抗生素耐药性和抗生素的残留问题日益严重，研究和开发绿色饲料添 加剂产品已经成为世界性的研究课题，大量研究表明，中草药提取物、微生物制剂、酶制剂、 益生元、抗菌肽、酸化剂等新型饲料添加剂能有效减少或者替代饲用抗生素的使用。其中， 溶菌酶来自动物体内，因为其同源性和高效性而备受人们亲睐。
[0005] 猪溶菌酶是猪体内抵抗外源微生物侵染的一道重要屏障，是其非特异性免疫的重 要组成部分。鉴于猪在畜牧业中的重要地位，猪溶菌酶的规模化生产问题已经提上日程。然 而，与其他C-型溶菌酶的作用类似，猪溶菌酶的抗菌谱主要集中在革兰氏阳性菌，对革兰氏 阴性菌基本没有抑菌作用，这也限制了它的应用。
【发明内容】
[0006] 为了解决上述问题，本发明利用蛋白酶将猪溶菌酶水解成不同的片段，利用超滤 和色谱等技术，制备得到了对革兰氏阴性菌具有明显抗性的活性肽并得到了抗菌肽的氨基 酸序列。本发明的制备工艺简单、分离效果好、操作条件温和，获得的抗菌肽纯度高、具有较 高的抗菌活性，可作为生物防治使用，是对猪溶菌酶抗菌谱的有效补充和完善。
[0007] 本发明的第一个目的是提供一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为:G-V-S-L-A-N-W-V-C-L-A-K(如SEQ ID N0.1 所示），命名为SSL-LP。
[0008] 所述抗菌肽是利用蛋白酶将猪溶菌酶水解，然后经分离纯化得到的。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种所述抗菌肽的制备方法，是将猪溶菌酶进行胰蛋 白酶水解得到粗提液，然后经凝胶过滤色谱Superdux Peptide 10/300GL和反相柱 CisPhenomenex luna分离纯化得到抗菌十二肽SSL-LP。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述猪溶菌酶由重组大肠杆菌发酵而来，发酵产品 经胰蛋白酶，于35~38°C水解12~16h，酶解结束后煮沸灭酶，酶解液超滤浓缩，得到粗提 液。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌，是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿 主，表达编码基因（NCBI-ID:1174173)，以pET-28a( + )为表达载体，在25°C、200r/min条件 下，利用O.lmmol/L的IPTG诱导8h，离心发酵液获得菌体。对其进行超声破碎获得重组蛋白 包涵体，然后对包涵体进行复性，冷冻干燥后最终获得了具有生物活性的猪溶菌酶。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，胰蛋白酶相对发酵产物的添加量为15-30mg/g。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述超滤浓缩是采用截留分子量3000Da的超滤装置 浓缩8~10倍。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述分离纯化是：（1)将粗提液用磷酸盐缓冲液透析 后，用Superdux Peptide 10/300GL凝胶色谱分离，收集对大肠杆菌、铜绿假单细胞菌、肺炎 克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性峰V(指色谱图上出现的第5个峰，下同），用截留分子量 为3000Da的超滤膜超滤浓缩，取分子量较小的部分透析后冷冻干燥；（2)将上一步得到的冷 冻干燥的样品用5 %的乙腈(含0.1 % TFA，下同）溶解，并经5 %的乙腈(含0.1 % TFA)平衡的 CisPhenomenex luna柱，用浓度为5-50 %的线性梯度递增的乙腈洗脱，收集对大肠杆菌、铜 绿假单细胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性洗脱峰Π (指色谱图上出现的第3个 峰），并经旋转蒸发和冷冻干燥后，得到产品抗菌十二肽。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述磷酸盐缓冲液为20mmol/L ΡΗ7.0。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述Superdux Peptide 10/300GL凝胶色谱分离得 到6个洗脱峰。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，产品使用LC-MS进行鉴定；用Mill-Q水溶解后经LC-MS分离与鉴定；其中流动相为A(乙腈:水：甲酸= 30:970:1(V:V:V))和B(乙腈：水：甲酸= 700:300:1 (V:V:V));洗脱程序如下：0-10min，100%A，0%B;20min，70%A，30%B;30min， 0%A，100%B ;35min，100%A，0%B;flow rate，lmL/min;柱温30°C。质谱条件：毛细管电压 3.88kV。圆锥体电压20V，离子源温度120°C，去溶温度300°C，流速lmL/min，分流比50:1。结 果用软件MassLynx 4.1分析。
[0018] 本发明的第三个目的是提供所述抗菌肽的应用，是作为饲料添加剂。
[0019] 所述应用，是将抗菌肽与猪溶菌酶或其他溶菌酶联合使用。
[0020] 本发明的第四个目的是提供一种抑制革兰氏阴性菌的方法，是使用所述的抗菌 肽。
[0021] 所述革兰氏阴性菌，为大肠杆菌、铜绿假单细胞菌、肺炎克雷伯氏菌等。
[0022]本发明的有益效果：
[0023] (1)本发明的抗菌肽SSL-LP属于碱性肽，与抗菌肽数据库（The Antimicrobial Peptide Database)等数据库比对，此种抗菌肽是首次被报道。
[0024] (2)本发明的抗菌肽SSL-LP，对大肠杆菌、铜绿假单细胞菌、肺炎克雷伯氏菌等革 兰氏阴性菌均有明显抑制作用，是对猪溶菌酶抗菌谱的良好补充和拓展。
[0025] (3)本发明获得的抗菌肽可作为饲料添加剂与猪溶菌酶或其他溶菌酶联合使用， 有望在将来替代抗生素和解决食品安全问题中发挥重要作用。
[0026] (4)本发明制备工艺具有简单、快速、高效的特点，所涉及的各种缓冲液配方均可 以在实验手册中查到，制备得到的产品纯度高，经质谱鉴定其纯度可达95%以上。
【附图说明】
[0027]图1:十二肽的质谱鉴定图。
【具体实施方式】
[0028]实施例1:抗菌十二肽的制备
[0029] 1 .溶菌酶产品经重组大肠杆菌BL21(DE3)发酵而来，编码基因（NCBI-ID: 1174173)，通过BamHI和HindIΠ 双酶切之后与载体pET-28a( + )连接，转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达。在25°C、200r/min条件下，利用0.1mmol/L的IPTG诱导8h，离心发酵液获 得菌体。对其进行超声破碎获得重组蛋白包涵体，然后对包涵体进行复性，冷冻干燥后最终 获得具有生物活性的猪溶菌酶。发酵产品经胰蛋白酶（15-30mg/g，胰蛋白酶/发酵产品））， 于35~38 °C水解12~16h，酶解结束后煮沸10分钟灭酶，酶解液超滤(截留分子量3000Da)浓 缩8~10倍，得到粗提液。
[0030] 2.经凝胶过滤色谱Superdux Peptide 10/300GL的分离:将粗提液用缓冲液Π (磷 酸盐缓冲液，20mmol/L ρΗ7·0)进行透析，经Superdux Peptide 10/300GL凝胶色谱分离得 到6个洗脱峰，收集对大肠杆菌、铜绿假单细胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性 峰，并将收集的活性峰V，经截留分子量为3000Da的超滤杯浓缩，并经Mi 11-Q水充分透析后 冷冻干燥。
[0031] 3.反相C18柱的分离:将上一步冷冻干燥的样品用5 %的乙腈(含0.1 % TFA，下同）溶 解，并经5%的乙腈平衡的C18柱，用浓度为5-50%的线性梯度递增的乙腈洗脱，收集活性洗 脱峰II，并经旋转蒸发和冷冻干燥后，最终得到产品。纯度达95%以上。
[0032] 采用LC-MS对上述最终得到的产品进行鉴定。LC-MS的鉴定方法如下：
[0033]将上述步骤得到的具有抑菌活性的冷冻干燥样品，用Mill-Q水溶解后经LC-MS鉴 定，流动相为A(乙腈:水：甲酸=30:970:1 (V:V:V))和B(乙腈:水：甲酸= 700:300:1 (V:V: V));
[0034] 洗脱程序为 0-10min，100%A，0%B;20min，70%A，30%B;30min，0%A，100%B; 35min，100%A，0%B;flow rate，lmL/min;柱温3CTC。
[0035] 质谱条件:毛细管电压，3.88kV;圆锥体电压，20V;离子源温度，120°C ;去溶温度， 300°C ;流速，lmL/min;分流比，50:1。结果用软件MassLynx 4.1分析。
[0036] LC-MS鉴定结果显示，此抗菌肽的抗菌肽的分子量为1260.51Da，其氨基酸序列为 G-V-S-L-A-N-W-V-C-L-A-K。经与抗菌肽数据库（TheAntimicrobial Peptide Database)等 数据库比对，此种抗菌肽并未见报道。
[0037] 实施例2:抗菌十二肽的抗菌性能检测
[0038] 抗菌十二肽的抑菌活性测定参照文献的方法进行。测试菌经过二级活化之后，以 1 %的接种量接种至含30mL TSB培养基的三角瓶中培养至OD600为0.6，取0.2mL菌液与0.4mL TSB培养基混合后加入0.2mL含有抗菌十二肽(猪溶菌酶作对照）的PBS(0.05mol/L，pH 7.0) 缓冲液混匀，使抗菌肽(或对照）的终浓度为2.5 X 10-7mol/L。混合体系于37°C、200r/min条 件下培养2h后，稀释涂布至TSB平板上，待长出菌落后进行计数。计算抑菌系数log Νο/Λ，其 中No是指空白组的菌落数，即只加 PBS溶液;见是实验组(或对照组)的菌落数。
[0039]表1本发明的十二肽的抑菌效果
[0041] 此抗菌肽对大肠杆菌、铜绿假单细胞菌和肺炎克雷伯氏菌等革兰氏阴性菌具有明 显的抗菌活性。
[0042] 实施例3:抗菌十二肽的应用
[0043 ]将此抗菌肽与猪溶菌酶编码基因进行融合表达，获得了对革兰氏阴性菌和阳性菌 均有明显杀菌作用的产品，较好的弥补了猪溶菌酶抗菌谱较窄的缺陷，为其进一步应用奠 定了基础。
[0044]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 根据权利要求1所述的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽是利用蛋白酶将猪溶菌酶水 解，然后经分离纯化得到的。3. -种权利要求1所述的抗菌肽的制备方法，其特征在于，所述方法是将猪溶菌酶进行 胰蛋白酶水解得到粗提液，然后经凝胶过滤色谱Superdux Peptide 10/300GL和反相柱 CisPhenomenex Iuna分离纯化得到抗菌十二肽。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述猪溶菌酶由重组大肠杆菌发酵而来， 发酵上清液经胰蛋白酶，于35~38 °C水解12~16h，酶解结束后煮沸灭酶，酶解液超滤浓缩， 得到粗提液。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分离纯化是：（1)将粗提液用磷酸盐缓 冲液透析后，用Superdux Peptide 10/300GL凝胶色谱分离，收集对大肠杆菌、铜绿假单细 胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用的活性峰V，用截留分子量为3000Da的超滤膜超滤浓 缩，取分子量较小的部分透析后冷冻干燥；（2)将上一步得到的冷冻干燥的样品用含0.1% TFA的5%乙腈溶解，并经5%的乙腈平衡的C18Phenomenex Iuna柱，用浓度为5-50%的线性 梯度递增的乙腈洗脱，收集对大肠杆菌、铜绿假单细胞菌、肺炎克雷伯氏菌等均有抑菌作用 的活性洗脱峰Π ，并经旋转蒸发和冷冻干燥后，得到产品抗菌十二肽。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，胰蛋白酶相对发酵产物的添加量为15-30mg/g〇7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述超滤浓缩是采用截留分子量3000Da的 超滤装置浓缩8~10倍。8. -种权利要求1所述的抗菌肽的应用，是作为饲料添加剂。9. 根据权利要求8所述的应用，是将抗菌肽与猪溶菌酶或其他溶菌酶联合使用。10. -种抑制革兰氏阴性菌的方法，其特征在于，所述方法是使用权利要求1的抗菌肽。
【文档编号】A23K20/195GK105950587SQ201610369095
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】陆健, 蔡国林, 朱德伟
【申请人】江南大学