一种低温木糖苷酶hj14gh43及其耐盐突变体的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开一种低温木糖苷酶HJ14GH43及其耐盐突变体，木糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码木糖苷酶HJ14GH43的木糖苷酶基因hJ14GH43的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；耐盐突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明木糖苷酶HJ14GH43的最适pH为7.0，最适温度为25℃；本发明在木糖苷酶HJ14GH43的基础上进性定点突变，将其322位的缬氨酸突变为天冬氨酸，获得突变体V322D，突变体V322D在NaCl中的活性和稳定性都得到了提高。本发明的HJ14GH43及其耐盐突变体V322D可应用于食品行业及水产饲料中。
【专利说明】
一种低温木糖苷酶HJ14GH43及其耐盐突变体
技术领域
[0001] 本发明公开一种低温木糖苷酶及其耐盐突变体，属于基因工程及蛋白质改造技术 领域。
【背景技术】
[0002] 木聚糖是半纤维素中最丰富的一种多糖，完全水解木聚糖需要多种酶的协同作 用，包括内切木聚糖酶（endo-1，4-0-D-xylanase，EC3.2. 1 .8)和木糖苷酶（β-D-xylosidase，EC 3.2.1.37)等（Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3_23.)〇内 切木聚糖酶可随机地切割木聚糖的主链骨架，生成低聚木糖，而木糖苷酶可将低聚木糖水 解为木糖(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29:3-23·)。木聚糖酶在饲料、食品、 酿酒、纺织及造纸等领域都具有应用价值(Collins et al.FEMS Microbiol Rev,2005,29: 3-23.)〇
[0003] 耐盐酶在高浓度NaCl下仍然具有催化活性和稳定性，可应用于高盐食品和海产品 加工及其它高盐环境生物技术领域，在高盐环境下加工食品还可以防止微生物的污染、节 省灭菌等所消耗的能源(Margesin et al .Extremophiles,2001,5:73-83.);低温酶在低温 环境中具有较高的酶活，可用于低温到中温的生境或加工过程，如水产生境常常为10-25 °C，将中温或者高温加工的过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用（Beg et al .Appl Microbiol Biotechnol，2001,56:326-338 ·)。近年来，低温内切木聚糖酶和耐盐 内切木聚糖酶已有报导，但低温木糖苷酶和耐盐木糖苷酶都无报导。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种低温木糖苷酶HJ14GH43及其耐盐突变体V322D。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种具有低温活性的木糖苷酶 HJ14GH43，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明低温木糖苷酶HJ14GH43可得自芽孢杆 菌（Bacillus sp.)〇
[0006] 本发明还提供一种编码木糖苷酶HJ14GH43的木糖苷酶基因 hJ14GH43,其核苷酸序 列如SEQ ID No.2所示。
[0007] 本发明通过基因组测序的方法克隆了木糖苷酶基因 hJ14GH43。本发明还提供一种 包含有木糖苷酶基因 W14GH43的重组载体。优选为pEasy-El-hJ14GH43。将本发明的木糖苷 酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最 优选的实施方案，将本发明的木糖苷酶基因和表达载体pEasy-El通过T-A方式相连接，得到 重组大肠杆菌表达质粒pEasy-E 1 -h J14GH43。
[0008] 本发明还提供一种包含有木糖苷酶基因 hJ14GH43的重组菌，所述重组菌为大肠杆 菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种。重组菌株BL21 (DE3) /hjl 4GH43。
[0009] 本发明制备木糖苷酶HJ14GH43的方法按以下步骤进行：
[0010] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0011] 2)培养重组菌株，诱导重组木糖苷酶表达；
[0012] 3)回收并纯化所表达的木糖苷酶HJ14GH43。
[0013] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3) /hJ14GH43。
[0014] 本发明木糖苷酶HJ14GH43的最适pH为7.0;最适温度为25 °C，在0 °C、10 °C和40 °C分 别具有14.5%、46.2%和12.8%的酶活;该酶在30% (w/v)的NaCl中仍具有62.0%的活性； 但是该酶在5.0-30.0%(?八）的似(：1中稳定性很差，经5.0-30.0%(￥八）的似(：1处理111后， 只有大约30 %的活性。
[0015]本发明还提供一种具有低温活性的木糖苷酶HJ14GH43在水产饲料及其食品工业 中的应用。
[0016] 为了提高所述木糖苷酶HJ14GH43在NaCl中的稳定性，本发明通过蛋白质改造技 术，将木糖苷酶HJ14GH43的第322位氨基酸由缬氨酸突变为天冬氨酸，获得了该木糖苷酶的 突变体V322D。V322D的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，V322D的基因序列v322d如SEQID No. 4所示。
[0017] 本发明提供了包含上述木糖苷酶突变体基因 v322d的重组载体，优选为pEasy-El-v322d。以表达质粒pEasy-El-hJ14GH43为模板，通过PCR技术，将hJ14GH43第965位核苷酸T 突变为A，得到pEasy-El-hJ14GH43的突变重组质粒pEasy-El-v322d。
[0018] 本发明还提供了包含上述木糖苷酶突变体基因 v322d的重组菌株，优选所述菌株 为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/v322d。
[0019] 本发明制备木糖苷酶突变体V322D的方法按以下步骤进行：
[0020] 1)用上述的突变重组质粒转化宿主细胞，得重组菌株；
[0021] 2)培养重组菌株，诱导突变重组木糖苷酶表达；
[0022] 3)回收并纯化所表达的木糖苷酶突变体V322D。
[0023] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大 肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3)/v322d。
[0024] 本发明木糖苷酶突变体V322D的最适pH为7.0;最适温度为25°C，在0°C、10°C和40 °(：分别具有19.1 %、48.8%和43.1 %的酶活;与HJ14GH43相比，突变体V322D在NaCl中的活 性和稳定性都得到了提高。在20.0-30.0% (w/v)的NaCl中，V322D比HJ14GH43的活性提高约 15% ;经5.0-30.0% (w/v)的NaCl处理lh后，V322D比HJ14GH43的活性最小提高49%，最大提 尚 113 % 〇
[0025] 本发明还提供一种木糖苷酶突变体V322D在水产饲料及其食品工业中的应用。 [0026] 本发明的HJ14GH43及其耐盐突变体V322D可应用于食品行业及水产饲料中。突变 体V322D比HJ14GH43更适合应用于高盐食品和海产品加工及其它高盐环境生物技术领域。
【附图说明】
[0027]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本 发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1:在大肠杆菌中表达的重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的SDS-PAGE分 析，其中，Μ:蛋白质Marker; W:纯化的重组HJ14GH43; V:纯化的突变体V322D;
[0029]图2:纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D水解木二糖（X2)、木三糖 (X3)、木四糖(X4)、木五糖(X5)及木六糖(X6)的产物分析，其中，XI:木糖;CK:底物和失活的 酶(煮沸1 Omin); S:反应组；
[0030]图3:重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的pH活性；
[0031]图4:重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的pH稳定性；
[0032]图5:重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的热活性；
[0033]图6:重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D的热稳定性；
[0034] 图7:重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D在NaCl中的活性；
[0035] 图8:重组木糖苷酶HJ14GH43及其突变体V322D在NaCl中稳定性。
【具体实施方式】
[0036]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037] 1、菌株及载体:芽孢杆菌(Bacillus sp.)分离于云南省楚雄彝族自治州黑井镇盐 矿土土样，保藏于云南省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为YMF 3.00191;大肠杆菌 Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pEasy-El购自北京全式金生物技术有限公司。
[0038] 2、酶类及其它生化试剂:DNA聚合酶、dNTP及Fast Mutagenesis System购自北京 全式金生物技术有限 & 3，pNP(p-nitrophenol)、pNPX(p-nitrophenyl-0_d-xylopyranoside) 4-]1；[1：1'(^1161171-€[-1^-&抑13；[110;1^11抑1108丨(16、桦木木聚糖、山毛棒木聚糖、 羧甲基纤维素纳和葡聚糖购自Sigma公司，阿拉伯木聚糖、木二糖、木三糖、木四糖、木五 糖及木六糖购自Megazyme公司，Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒购自Zymo Research公司，Tureseq DNA Sample Preparation Kit购自 Illumima公司，其它都为国产 试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0039] 3、培养基：
[0040] LB培养基：Peptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，加蒸馈水至 1000ml，pH自 然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0041] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0042] 实施例1:木糖苷酶基因 hJ14GH43的克隆
[0043] 提取芽孢杆菌基因组DNA:将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入lmL溶菌酶，37°C 处理60min，再加入裂解液，裂解液组成为：50mM Tris，20mM EDTA，500mM NaCl，2%(w/v) SDS，pH8.0，70°C水浴裂解60min，每隔lOmin混勾一次，在4°C下lOOOOrpm离心5min。取上清 于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4°C下 lOOOOrpm离心10min。弃上清，沉淀用70%的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入适量TE溶解，置 于-20°C备用。
[0044] 用超声打断仪Biorupter将5yg的芽孢杆菌基因组打断为400-600bp的片段，用 Genomic DNA Clean&Concentration试剂盒对打断的DNA片段进行纯化，纯化后用Tureseq DNA Sample Preparation Kit进行DNA片段的末端补平、3'端加 A碱基和加接头、及DNA片段 的PCR扩增(操作按试剂盒说明书进行）。用MiSeq基因组测序仪(Illumima公司）对上述制备 好的文库进行基因组测序。
[0045] 基因组测序得到的数据经读码框预测和本地BLAST比对，得到木糖苷酶基因 hJ14GH43，该基因序列如SEQIDN0.2所示。
[0046] 实施例2:重组木糖苷酶HJ14GH43的制备
[0047] 以5'ATGAAGATTACCAATCCAGTGCT 3'和5'TTATTCGTCTGTTTCCTCATAGC 3'为引物对， 芽孢杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94°C变性5min;然后94°C变性 30sec，52°C退火30sec，72°C延伸lmin 30sec，30个循环后72°C保温lOmiruPCR结果得到木 糖苷酶基因 hJ14GH43，并在该基因3 '端引入突出的A碱基。将木糖苷酶基因 hJ14GH43和表达 载体pEasy-El通过T-A方式相连接，获得含有hJ14GH43重组表达质粒pEasy-El-hJ14GH43。 将pEasy-El-hJ14GH43转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/ hJ14GH43〇
[0048] 取含有重组质粒pEasy-El-hJ14GH43的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/hJ14GH43， 以〇. 1%的接种量接种于LB(含100yg ml^Amp)培养液中，37°C快速振荡16h。然后将此活化 的菌液以1 %接种量接种到新鲜的LB(含100yg mdmp)培养液中，快速振荡培养约2-3h (0D6QQ达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.111^的1?16进行诱导，于20°(：继续振荡培养约2011。 12000rpm离心5min，收集菌体。用适量的pH7 . OTris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下 超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液经13,000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0-500mM的咪唑分别亲和和纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1)表明，重组木 糖苷酶HJ14GH43在大肠杆菌中得到了表达，经纯化后，产物为单一条带。
[0049] 实施例3:木糖苷酶HJ14GH43定点突变以及突变体V322D的制备方法
[0050] 通过对木糖苷酶HJ14GH43的高级结构进行分析，发现氨基酸V322位于一段无规则 卷曲中，将322位氨基酸由缬氨酸突变为天冬氨酸，有可能增加酶的亲水能力，从而使酶的 耐盐性增强。
[0051 ]以表达质粒pEasy-El-hJ14GH43为模板，利用北京全式金生物技术有限公司的 Fast Mutagenesis System进行点突变，将hJ14GH43第965位核苷酸T突变为A，得到了 pEasy-El-hJ14GH43的突变重组质粒pEasy-El-v322d。突变引物为5' AGATCGAAGAAAAGG^ITTTGCACCAAC 3 ' 和5'ICCTTTTCTTCGATCTTTGGCGCTTC 3 '（下划线为突变 点hPCR反应参数为：94°C变性5min;然后94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸3min 30sec，30个循环后72°C保温10min 1CR产物经DMT酶消化后转化大肠杆菌BL21 (DE3)，获得 重组大肠杆菌菌株BL21 (DE3)/v322d。
[0052] 取重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)/v322d，以0.1%的接种量接种于LB(含100yg mL一 Imp)培养液中，37 °C快速振荡16h。然后将此活化的菌液以1 %接种量接种到新鲜的LB (含 100yg ml^Amp)培养液中，快速振荡培养约2-3h(0D6Q()达到0.6-1.0)后，加入终浓度0.111^的 IPTG进行诱导，于20°C继续振荡培养约20h<a2000rpm离心5min，收集菌体。用适量的 pH7. OTris-HCl缓冲液悬浮菌体后，于低温水浴下超声波破碎菌体。以上胞内浓缩的粗酶液 经13，000rpm离心10min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose和0-500mM的咪唑分别亲和 和纯化目的蛋白。SDS-PAGE结果（图1)表明，突变体V322D在大肠杆菌中得到了表达，经纯化 后，产物为单一条带。
[0053]实施例4:纯化的木糖苷酶HJ14GH43以及突变体V322D的性质测定 [0054] 1、纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43以及突变体V322D的活性分析
[0055] 纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43以及突变体V322D的活性测定方法采用pNP法：将 pNPX溶于缓冲液中，使其终浓度为2mM;反应体系含50yL适量酶液，450yL的2mM底物;底物在 反应温度下预热5min后，加入酶液再反应适当时间，然后加2mL 1M Na2C03终止反应，冷却至 室温后在405nm波长下测定释放出的pNP;l个酶活单位(U)定义为每分钟分解底物产生1μ mol pNP所需的酶量。对底物p-nitrophenyl-a-L-arabinofuranoside的测定也采用pNP法。 结果表明：在ΡΗ7.0及25°C下，HJ14GH43以及突变体V322D对ρΝΡΧ的比活分别为2.37 ±0.08U mg-1和2 · 66±0 ·08U mg-1，对底物。-]1；[1：1'(^1161171-€[-1^-&抑13；[110;1^11抑1108丨(16的比活分别为 0.030±0.001U mg-1 和0.012±0.001U mg-、
[0056] 对底物桦木木聚糖、山毛榉木聚糖、阿拉伯木聚糖、羧甲基纤维素纳、普鲁兰多糖 和葡聚糖的活性测定方法采用3,5 -二硝基水杨酸(DNS)法:将底物溶于缓冲液中，使其 终浓度为〇. 5 % (w/v);反应体系含100yL适量酶液，900yL底物;底物在反应温度下预热5min 后，加入酶液后再反应适当时间，然后加1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min，冷却至室温后在 540nm波长下测定0D值;1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟分解底物产生Ιμπιο? 还原糖（以木糖计)所需的酶量。结果表明：在ΡΗ7.0及25 °C下，HJ14GH43以及突变体V322D对 底物桦木木聚糖、山毛榉木聚糖、阿拉伯木聚糖、羧甲基纤维素纳、普鲁兰多糖和葡聚糖 皆无活性。
[0057]对底物木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木六糖的活性测定方法采用薄层层析法 (TLC)，反应体系含45yL 0.5% (w/v)的底物，5yL适当稀释酶液（约0.06U酶液），在ρΗ7.0及 20°C下，反应150min后终止反应并分析水解产物(使用青岛海洋化工有限公司的高效薄层 层析硅胶板G型）。
[0058]薄层层析步骤如下所示：
[0059] (1)配制展开剂（冰醋酸20mL，双蒸水20mL，正丁醇40mL，混匀），取适量倒入展开 槽，静置30min左右；
[0060] (2)将硅胶板放在110 °C烘箱中活化30min，冷却后划线，点样(每次0.5yL，吹干，共 点3次）；
[0061] (3)将点样的一端硅胶板朝下放入展开槽中，点样点不要没入展开剂；
[0062] (4)待展开剂到距硅胶板上沿1.5cm时，取出硅胶板，吹干，再展开一次；
[0063] (5)第二次展开结束后，硅胶板直接浸入适量显色剂（lg二苯胺溶于50mL丙酮中， 溶解后加入lmL苯胺及5mL 85%的磷酸，混勾，现用现配）；
[0064] (6)几秒钟后，立即取出硅胶板并放置于90°C烘箱中10_15min，使斑点显色。
[0065]结果表明：HJ14GH43以及突变体V322D能水解木二糖、木三糖、木四糖、木五糖及木 六糖，水解产物几乎都为木糖(图2)。
[0066] 2、纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43以及突变体V322D的pH活性和pH稳定性测定：
[0067] pH活性和pH稳定性测定采用pNP法。酶的最适pH测定:将木糖苷酶HJ14GH43以及突 变体V322D在20°C下和pH5.0 -10.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定:将酶液置 于PH5.0-10.0的缓冲液中，在20°C下处理lh，然后在pH7.0及20°C下进行酶促反应，以未处 理的酶液作为对照。缓冲液为：Me I lvaine buff er(pH5.0-8.0)和0.1M glycine-NaOH (pH9.0-10.0)。以pNPX为底物，反应lOmin，测定纯化的HJ14GH43以及突变体V322D的酶学性 质。结果表明：HJ14GH43以及突变体V322D的最适都为7.0，但在pH6.5时，V322D的酶活比 HJ14GH43高约20%，在pH7.5时，HJ14GH43的酶活比V322D高约 12% (图3);HJ14GH43以及突 变体V322D在pH7.0-8.0的缓冲液较稳定，经pH7.0-8.0缓冲液在20 °C下处理lh，两个酶的酶 活剩余达70%以上，但在？!16.0和？!18.0条件下，￥3220比耵146!143更稳定，其酶活比 HJ14GH43分别提高25%和18%(图4)。
[0068] 3、纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43以及突变体V322D的热活性及热稳定性测定：
[0069]热活性及热稳定性测定采用pNP法。酶的热活性测定:在pH7.0的缓冲液中，于0-40 °C下进行酶促反应。酶的热稳定性测定:将同样酶量的酶液分别置于20°C、25°C和30°C，处 理0-60min后，在pH7.0及20°C下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNPX为底物， 反应lOmin，测定纯化的HJ14GH43以及突变体V322D的酶学性质。结果表明：HJ14GH43的最适 温度为25°(：，在0°(：、10°(：和40°(：分别具有14.5%、46.2%和12.8%的酶活（图5) ;突变体 V322D的最适温度也为25 °C，在0 °C、10 °C和40 °C分别具有19.1 %、48.8 %和43.1 %的酶活 (图5);HJ14GH43以及突变体V322D在20°C下稳定，在30°C时半衰期小于lOmin(图6)。
[0070] 4、纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43以及突变体V322D的动力学参数测定：
[007? ] 动力学参数测定采用pNP法。酶的动力学参数一级反应时间测定：在pH7 · 0及20°C 下，以ImM pNPX为底物，依次在酶促反应的1 -30min内终止反应并测定酶活性，计算出酶活 性与反应时间的比值，若在一定时间内该比值保持稳定，则此时间为一级反应时间。用 0.05-2 · 5mM pNPX为底物，在pH7.0、20°C和一级反应时间下，根据Lineweaver-Burk方法测 定Km、V max和kcat。经测定，在20°C及ρΗ7·0条件下，HJ14GH43对pNPX的Km、V max和kcat分别为 1 · 43mM、3 · 30ymol min-Vg-1和3 · 50s-1，V322D 对 pNPX的Km、VmajPkcat分别为 1 · 99mM、4 · 30μ mol min-Vg-1和4.55s-1。
[0072] 5、不同金属离子及化学试剂对纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43以及突变体V322D活 力的影响：
[0073 ]在酶促反应体系中加入1. OmM的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在 20°C及pH7.0条件下，以pNPX为底物，通过pNP法测定酶活性。结果(表1)表明，1. OmM的SDS、 HgCl2及AgN03可完全抑制HJ14GH43以及突变体V322D;ZnS〇4对HJ14GH43以及V322D的抑制较 强；CuS〇4对V322D的抑制较强，但是对HJ14GH43的抑制很弱；其余金属离子和化学试剂对 HJ14GH43以及V322D的影响很小或几乎无影响。
[0074] 表1.金属离子及化学试剂对纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43以及突变体V322D活力 的影响
[0077] 6、纯化的重组木糖苷酶HJ14GH43以及突变体V322D在NaCl中的活性及稳定性：
[0078]酶在NaCl中的活性及稳定性测定采用pNP法。酶在NaCl中的活性测定:在酶促反应 体系中加入5.0-30.0 % (w/v)NaCl，于pH7.0及20°C下进行酶促反应。以pNPX为底物，反应 lOmin，测定纯化的HJ14GH43以及突变体V322D的酶学性质。结果表明：在反应体系中加入 5.0- 30.0% (w/v)的NaCl，HJ14GH43以及V322D都仍然具有60 %以上的酶活；但在20.0-30.0%(w/v)的NaCl中，V322D比HJ14GH43的活性提高约 15% (图7)。
[0079] 酶在NaCl中的稳定性测定:将纯化的酶液置于5.0-30.0% (w/v)NaCl水溶液中，在 20°C下处理60min，然后在pH7.0及20°C下进行酶促反应，以未加 NaCl但在20°C下保温60min 的酶液作为对照。以pNPX为底物，反应lOmin，测定纯化的HJ14GH43以及突变体V322D的酶学 性质。结果（图8)表明：HJ14GH43在5.0-30.0% (w/v)的NaCl中稳定性很差，该酶经5.0-30% (w/v)的NaCl处理60min后，只有大约30%的活性;而V322D在NaCl中稳定，甚至其酶活有所 提高，该突变体经5.0-30.0% (w/v)的NaCl处理lh后，酶活最低为77.0%，最高为146.9%。 与HJ14GH43相比，V322D在5.0-30%(￥八）的恥(：1中的稳定性大幅提高，耵146!143和￥3220经 5.0- 30%(?八）的恥(：1处理111后，￥3220比耵146!143的活性最小提高49%，最大提高113%。 [0080]本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术 语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该 理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意 义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
[0081]最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参 照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解:依然可以对本 发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均 应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【主权项】
1. 一种具有低温活性的木糖苷酶HJ14GH43,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No. I 所示。2. -种编码权利要求1所述的木糖苷酶HJ14GH43的木糖苷酶基因 hJ14GH43,其特征在 于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。3. 根据权利要求2所述的包含有木糖苷酶基因 hJ14GH43的重组载体。4. 根据权利要求2所述的包含有木糖苷酶基因 hJ14GH43的重组菌，其特征在于，所述重 组菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种。5. 根据权利要求1所述具有低温活性的木糖苷酶HJ14GH43在水产饲料及其食品工业中 的应用。6. -种耐盐的木糖苷酶突变体V322D，其特征在于，所述的木糖苷酶突变体V322D的氨 基酸序列为SEQ ID No.1的木糖苷酶的第322位氨基酸由缬氨酸突变为天冬氨酸，其氨基酸 序列如SEQ ID No.3所示。7. -种编码权利要求6所述的木糖苷酶突变体V322D的基因 v322d，其特征在于，其核苷 酸序列如SEQ ID No.4所示。8. 根据权利要求7所述的包含有木糖苷酶突变体基因 v322d的重组载体。9. 根据权利要求7所述的包含有木糖苷酶突变体基因 v322d的重组菌，其特征在于，所 述重组菌为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌中的一种。10. 根据权利要求6所述木糖苷酶突变体V322D在水产饲料及其食品工业中的应用。
【文档编号】C12N9/24GK105950586SQ201610557658
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】周峻沛, 黄遵锡, 张蕊, 刘钰, 唐湘华, 李俊俊, 吴倩, 慕跃林
【申请人】云南师范大学