Crk5蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用

Crk5蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
【专利摘要】本发明公开了一种CRK5蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。本发明所提供的应用具体为由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质(即CRK5蛋白)在如下a1)或a2)中的应用：a1)提高植物抗旱性；a2)选育抗旱性提高的植物品种。CRK5基因过表达植株，相比野生型对照植株，对干旱逆境胁迫的耐受性显著提高。本发明对植物抗干旱分子机制的研究具有重要意义；另外，该基因在培育耐旱植物品种中具有重要功能，从而为培育抗逆境作物新品种提供了重要的可能性，对农业生产具有重大意义。
【专利说明】
CRK5蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，涉及一种CRK5蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中 的应用。
【背景技术】
[0002] 干旱是人类面临的主要自然灾害之一，即使在科学技术如此发达的今天，它造成 的粮食生产损失和经济损失仍然比比皆是。在全球耕地面积逐渐减少和干旱灾害发生日益 频繁的今天，通过提高作物的抗旱性能来提高或者保持粮食产量具有重大意义。传统的育 种技术具有周期长、盲目性高和工作量大等缺点，而且通过传统育种来提高粮食产量已经 发展到一定瓶颈。近年来，随着植物分子生物学和遗传学等学科的发展以及植物抗逆分子 机制的深入研究，通过基因工程的方法向植物中导入抗逆相关基因来提高作物的抗逆性已 经变得日趋成熟。
[0003] 脱落酸(Abscisic Acid，ABA)是传统的五大植物激素之一，它于上世纪60年代首 先在干的棉铃壳中分离得到，因其具有促进棉铃脱落而命名为"脱落素"。随后从槭树中分 离纯化到一种能促进芽休眠的"休眠素"，经鉴定二者为同一种化学物质并统一命名为脱落 酸。ΑΒΑ可以促进种子成熟和休眠过程以及种子成熟过程中贮藏蛋白的积累、抑制种子萌发 和幼苗生长、抑制主根发育、促进侧根发育以及促进叶片衰老和脱落等。ΑΒΑ通过促进气孔 关闭和抑制气孔打开以及调节抗旱物质的积累等过程增强植物对干旱的抗性。此外，ΑΒΑ还 可以增强植物对低温和高盐等逆境的适应能力。近年来，随着遗传学、细胞生物学、分子生 物学和化学生物学等学科的飞速发展，人们对ΑΒΑ信号传递网络的研究有了长足的进步。 [0004]通过细胞表面的受体来感知外界环境的变化以及各种化学信号是所有生物最基 本的特点。在哺乳动物里，受体络氨酸激酶RTK(receptor tyrosine kinases)家族就是定 位于细胞表面来介导许多信号转导过程。在植物里，类受体蛋白激酶的结构及发挥功能的 作用方式跟RTK类似。类受体蛋白激酶家族是植物最大的膜受体家族，它在拟南芥和水稻中 的成员数分别超过了610和1100个。CRKs(Cysteine_rich receptor-like protein kinases)蛋白激酶是RLKs的一个亚家族，它在拟南芥中共有46个成员。除了具有RLKs的典 型结构特点之外，CRKs的胞外结构域含有两个拷贝的DUF26结构域(domain of unknown function 26)，每个DUF26结构域都包含3个保守的C-8X-C-2X-C结构域，但是这些结构域的 具体功能还未知，可能跟蛋白之间的互作有关系。CRKs广泛参与到植物对生物胁迫和非生 物胁迫的响应过程。富含半胱氨酸的类受体蛋白激酶CRK36和类受体胞质激酶ARCK1 (receptor-like cytosolic kinase 1)受渗透胁迫诱导，并且CRK36在体外可以磷酸化 ARCK1，并且形成复合体负调控ΑΒΑ信号转导和响应渗透胁迫。CRK5基因在拟南芥tair网站 上的基因号为AT4G23130(https: //www.arabidopsis · org/) 〇

【发明内容】

[0005]本发明的目的是提供一种CRK5蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。
[0006] 本发明所提供的应用，具体为如下A或B:
[0007] A.由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质（CRK5蛋白）在如下al)_a2) 任一中的应用：
[0008] al)提高植物抗旱性；
[0009] a2)选育抗旱性提高的植物品种。
[0010] B.由序列表中序列3所不的氣基酸序列组成的蛋白质(CRK5蛋白）的编码基因在如 下al)_a2)任一中的应用：
[0011] al)提高植物抗旱性；
[0012] a2)选育抗旱性提高的植物品种。
[0013] 在本发明中，以上a2)中的所述选育抗旱性提高的植物品种的方法，具体可包括将 所述CRK5蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法。
[0015] 本发明所提供的培育抗旱性提高的转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：向 受体植物中导入由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质（CRK5蛋白）的编码基 因，得到转基因植物;所述转基因植物与所述受体植物相比抗旱性提高。
[0016] 在上述应用或方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的 编码基因（即CRK5基因）是如下1)至5)中任一所述的DNA分子：
[0017] 1)编码序列为序列表中序列2自5'末端第1至1992位核苷酸所示的DNA分子；
[0018] 2)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0019] 3)序列表中序列1所示的DNA分子；
[0020] 4)在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；
[0021] 5)与1)-4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示 的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。
[0022] 上述严格条件可为用6 X SSC，0.5 % SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0023]其中，序列1由2537个核苷酸组成，为所述CRK5基因在拟南芥基因组中序列，其中 第818-892、1034-1103、1226-1314、1526-1599、1838-1909及 2064-2138位均为内含子序列； 序列2由2082个核苷酸组成，为所述CRK5基因的cDNA序列，其中第1-1992位为编码序列 (0RF);序列1和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由663个氨基酸残基组成。
[0024] 在所述方法中，所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基 因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述受体植物中的。
[0025] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农 杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA-1 300-221、pGreen0029、 pCAMBIA3301、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表达载体。 所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它 参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体 的3'端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强 型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因 1]1^911；[1:;[11启动子化1]13；〇、胁迫诱导型启动子1(1294等，它们可单独使用或与其它的植物启 动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译 增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但 必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密 码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区 域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载 体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具 有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接 以逆境筛选转化植株。
[0026]在本发明中，所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编码基因转录的启动子为 35S启动子。
[0027] 更为具体的，所述重组表达载体为将所述CRK5基因插入pCAMBIA-1300-221载体的 多克隆位点BamH I与Κρη I之间后得到的重组质粒。
[0028]在上述方法中，将携带有所述CRK5基因的所述重组表达载体导入所述受体植物， 具体可为:通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌 介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
[0029] 另外，由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在如下(a) 或(b)中的应用也属于本发明的保护范围：
[0030] (a)协同ΑΒΑ促进植物气孔关闭；
[0031] (b)协同ΑΒΑ抑制植物气孔开放。
[0032] 在所述应用中，所述ΑΒΑ的使用浓度具体可为30μΜ。
[0033] 在上述应用或方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。
[0034]进一步，所述双子叶植物可为十字花科植物。在本发明的一个实施例中，所述植物 具体为拟南芥，更加具体为拟南芥野生型(Col-Ο生态型）。
[0035]在本发明中，以上所有所述由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质均 可替换为序列3所示蛋白质与标签蛋白所形成的融合蛋白，具体如在pCAMBIA-1300-221载 体的酶切位点BamH I和Κρη I之间插入序列2的第1-1989位所示DNA片段后所得重组质粒表 达得到的融合蛋白。
[0036] 实验证明，CRK5基因过表达植株，相比野生型对照植株，对干旱胁迫的耐受性显著 提高。本发明对植物抗干旱分子机制的研究具有重要意义;另外，该基因在培育耐旱植物品 种中具有重要功能，从而为培育抗逆境作物新品种提供了重要的可能性，对农业生产具有 重大意义。
【附图说明】
[0037] 图1为实时荧光定量PCR检测CRK5过表达材料中CRK5mRNA的表达情况。
[0038]图2为CRK5过表达株系在ΑΒΑ促进气孔关闭和ΑΒΑ抑制气孔开放实验中的反应情 况。误差线表示标准误差（SE)，不同字母代表同一ΑΒΑ浓度下各处理之间差异显著（Ρ〈 0.05)。其中，Α为ΑΒΑ抑制气孔开放实验;Β为ΑΒΑ促进气孔关闭实验。
[0039]图3为CRK5过表达株系在干旱实验中的反应情况及在复水后的存活率情况。Α表示 野生型Col-Ο以及CRK5基因高表达株系0E-1和0E-2分别在正常浇水、干旱处理和干旱处理 后再复水实验。B是对A图中各基因型植株存活率的统计分析。误差线表示标准误差(SE)，不 同字母代表同一 ΑΒΑ浓度下各处理之间差异显著(P〈0.05)。
【具体实施方式】
[0040] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0041] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0042] 下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试 验，均设置三次重复试验，结果取平均值。
[0043] pCAMBIA-1300-221 载体：由清华大学提供(记载文献:Lijing Liu，Yiyue Zhang, Sanyuan Tang,et al.An efficient system to detect protein ubiquitination by agroinfiltration in Nicotiana benthamiana.The Plant Journal，2010(61):893-903.)。在pCAMBIA-1300-221载体中，位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为35S启动子。在 pCAMBIA-1300-221载体中，含有GFP基因。口0厶1?1厶-1300-221载体相关信息：11?口：// www.cambia.org/daisy/cambia/materials/vectors/585.html。
[0044] 拟南芥野生型（Col-〇生态型）：拟南芥野生型种子（Arabidopsis thaliana, ecotype Columbia-0)，为拟南芥生物研究中心（ABRC，https ://www.arabidopsis .org/)的 产品。
[0045] 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens):根癌农杆菌菌株GV3101，由清华大学 提供（记载文南犬：R.Berres，L.otten，B.Tinland et al.Transformation of vitis tissue by different strains of Agrobacterium tumefaciens containing the T_6b gene.Plant Cell Reports,1992(11):192-195.)〇
[0046] 大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5a(DE3)感受态:为全式金生物有限公司产 品。
[0047] 实施例1、CRK5转基因植物的获得及鉴定
[0048] 本实施例中所涉及的CRK5基因来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)，其在拟南 芥基因组中的序列如序列表中序列1所示，序列1由2537个核苷酸组成，为所述CRK5基因在 拟南芥基因组中序列，其中第818-892、1034-1103、1226-1314、1526-1599、1838-1909及 2064-2138位均为内含子序列；所述CRK5基因的cDNA序列如序列表中序列2所示，序列2由 2082个核苷酸组成，为所述CRK5基因的cDNA序列，其中第1-1992位为编码序列(0RF);序列1 和序列2均编码序列表中序列3所示的蛋白质，序列3由663个氨基酸残基组成。
[0049] 一、重组表达载体 pCAMBIA-1300-221-CRK5 的构建
[0050]提取拟南芥野生型(Col生态型）的总RNA，反转录后获得cDNA。以所得cDNA为模板， 通过引物1与引物2进行PCR扩增，反应结束后对其产物进行纯化，表明扩增得到约2000bp片 段，测序表明，该片段具有自序列表中的序列2自5'端起第1-1989位核苷酸序列。
[0051 ]引物1:5' -CGGGATCCATGTCTGCTTATACCTCATTAAAC-3 '（下划线部分为BamH I的识别 位点，该序列的第9-32位为序列2的第1-24位）；
[0052]引物2:5 ' -GGGGTACCACGAGGAGCTAAAATAGTAATCG-3 '（下划线部分为Κρη I的识别位 点，该序列的第9-31位为序列2的第1967-1989位的反向互补序列）。
[0053]用限制性内切酶BamH I和Κρη I双酶切以上所得PCR产物，胶回收酶切片段，与经 过同样双酶切的PCAMBIA-1300-221载体骨架相连，得到重组质粒。将所述重组质粒送样测 序，将经测序表明在pCAMBIA-1300-221载体的酶切位点BamH I和Κρη I之间插入序列2的第 1-1989位所示DNA片段的重组质粒命名为？041?14-1300-221-0狀5。在重组表达载体 PCAMBIA-1300-221-CRK5中，启动所述CRK5基因转录的启动子为35S启动子。
[0054] 在重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK5的构建过程中，也可以人工合成的序列 表的序列2所示的CRK5基因为模板。
[0055] 二、CRK5转基因拟南芥的获得及鉴定 [0056] 1、CRK5转基因拟南芥植株的获得
[0057] 将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA-1300-221-CRK5导入农杆菌GV3101感受 态。对转化后的重组农杆菌用由引物1和引物2(同上)组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定 表明含有CRK5基因（PCR目的条带大小为2000bp左右）的农杆菌GV3101命名为GV3101/ pCAMBIA-1300-221-CRK5〇
[0058] 采用用农杆菌花序侵染的方法（SJ Clough，AF Bent.Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal，1998，16(6): 735-743 ·)将上述所得的重组农杆菌GV3101/pCAMBIA-1300-221-CRK5转化拟南芥野生型(Col生态型）。
[0059]转化后进行潮霉素抗性筛选，在含40mg/L潮霉素的MS培养基上培养，收集具有潮 霉素抗性的转基因拟南芥的种子，获得具有潮霉素抗性的转基因苗，即转入PCAMBIA-1300-221-CRK5的拟南芥植株(1^代）。
[0060] 在以往的研究中，向拟南芥野生型（Col生态型）中转入pCAMBIA-1300-221空载体 的转基因株系对于植物的生长发育、激素响应以及植物抗干旱的能力均不产生任何影响， 其表现型与野生型一致，所以本实验以野生型Col-Ο作为了实验的对照部分。
[0061 ] 2、CRK5转基因拟南芥鉴定
[0062] (1)遗传学分离比方法鉴定插入拷贝数
[0063]根据遗传学原理，单拷贝插入之后自交后代会产生3:1的分离比。结合统计学的方 法，统计抗生素培养基上抗性苗和非抗性苗的数量。用分离比方法鉴定出转基因植株为单 拷贝插入的株系(单拷贝CRK5转基因拟南芥），从而用于纯合体的筛选。
[0064] (2)转基因拟南芥0E-1和0E-2纯合系的筛选
[0065]经上述鉴定分析后，从中随机选择二个单拷贝CRK5转基因拟南芥株系，分别记为 0E-1和OEKlMf)。播种于含40mg/L潮霉素 MS培养基上，经过连续2代筛选，以所有自交后 代均能正常生长（即所有后代均具潮霉素抗性)的亲本植株为纯合系，最终获得T 3代转基因 拟南芥0E-1和0E-2的纯合系植株，作为实验材料进行后续实验分析。
[0066] 三、转基因拟南芥0E-1和0E-2纯合系中CRK5基因表达量分析
[0067] 提取拟南芥野生型(Col-Ο生态型）和过表达植株(0E-1和0E-2)的总RNA，利用实时 荧光定量PCR检测材料中CRK5基因在转录水平上表达情况。具体如下：
[0068] 1、转录水平分析(RNA表达量）
[0069]以上述获得的转基因拟南芥植株(0E-1和0E-2)及拟南芥野生型(Col-Ο生态型）为 实验材料。取生长4周左右的拟南芥幼苗，提取RNA并且反转录cDNA，然后通过实时荧光定量 PCR方法分析CRK5基因在各实验材料中的表达情况。
[0070]其中，扩增CRK5基因的引物序列为：
[0071 ] CRK5RT-F1:5' -TTCAACAAAGTTGGAGGAAGA-3'（序列2的第664-684位）；
[0072] CRK5RT-R1:5'-ACACAAATAAGAACTGAGATAGCG-3'（序列2的第867-890位的反向互补 序列）。
[0073]以Actin2/8作为内参基因，扩增内参Actin的引物序列为：
[0074] Actin-F:5 '-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3 '；
[0075] Actin-R:5'-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3'。
[0076]上述引物的反应条件如下：
[0077] (1)反应体系的建立
[0078]实时荧光定量PCR反应体系
[0080] (2)三个重复，轻甩混匀，用Bio-Rad CFX96荧光定量PCR仪进行实验。
[0081] (3)反应程序的设定：
[0082] 实时荧光定量PCR反应程序
[0084] (4)数值分析，以作为衡量基因转录水平的相对差值，对各株系中CRK5基因的 表达进行分析比较。Ct值为PCR反应荧光信号达到设定阈值时的循环数，△ Ct值为特异引物 Ct值与Act in引物Ct值之差。
[0085] CRK5相关遗传材料的实时荧光定量PCR检测结果如图1所示，CRK5基因的表达均为 相对值，以拟南芥野生型（Co 1 -0)中CRK5基因的表达为1。从图中可以看出，转基因拟南芥 0E-1和0E-2中CRK5mRNA表达量均显著高于野生型(Col-Ο)中CRK5mRNA表达量(P〈0.05)。 [0086]实施例2、CRK5转基因植物抗干旱性分析试验
[0087] ΑΒΑ是植物抵抗外界逆境胁迫的重要信号分子。在干旱条件下，ΑΒΑ能够通过调节 气孔保卫细胞的离子通道促进气孔关闭以减少水分流失。钙离子、蛋白激酶、磷酸酶等均参 与ΑΒΑ介导的保卫细胞信号转导及ΑΒΑ相关抗逆基因的信号调控。因此利用ΑΒΑ诱导气孔运 动实验和干旱实验检测CRK5在ΑΒΑ调控植株干旱胁迫响应的过程中是否发挥作用。
[0088] -、ΑΒΑ抑制气孔开放和ΑΒΑ促进气孔关闭实验
[0089] (l)ABA抑制气孔开放实验
[0090]以拟南芥野生型(Col-Ο生态型），实施例1得到的两个T3代纯合体CRK5转基因株系 0Ε-1和0Ε-2为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在MS培养基上(每种实验材料播种 80-100粒）。4°(：下低温层积3天后移入光照培养箱中。取生长4周左右各基因型植物黑暗下 放置24h以确保气孔关闭；然后取状态一致的叶片浸泡在无 ΑΒΑ和含有30μΜ ΑΒΑ的表皮条缓 冲液(配方：50mM KCl、10mM MES-K0H，pH 6.15)中；最后，在冷光源下照射211后观察并记录 气孔孔径。实验重复了 5次，结果一致，每个样本均记录约60个气孔孔径，误差线表示标准误 差(SE)，不同字母代表同一 ΑΒΑ浓度下各处理之间差异显著(P〈0.05)。
[0091] 结果如图2中A所示，从图中可以看出，黑暗处理24小时后，野生型Col-Ο和CRK5转 基因株系（0E-1和0E-2)气孔关闭的程度基本一致(P>0.05);光照2小时后，不含ΑΒΑ组中， CRK5转基因株系0Ε-1和0Ε-2气孔的孔径与野生型Col-Ο基本一致(Ρ>0.05)，但是ΑΒΑ处理组 中，CRK5转基因株系0Ε-1和0Ε-2气孔孔径相对于野生型Col-Ο变得更小(Ρ〈0.05)，即0Ε-1和 0Ε-2气孔开放较Co 1-0受到显著抑制，对ΑΒΑ抑制气孔开放过程更加敏感，表现出对ΑΒΑ超敏 的表型。
[0092] (2)ΑΒΑ促进气孔关闭实验
[0093]以拟南芥野生型(Col-Ο生态型），实施例1得到的两个Τ3代纯合体CRK5转基因株系 0Ε-1和0Ε-2为实验材料。将各实验材料的种子分别播种在MS培养基上(每种实验材料播种 80-100粒）。4°(：下低温层积3天后移入光照培养箱中。取生长4周左右各基因型植物的叶片 浸泡在表皮条缓冲液(配方:50mM KCl、10mM MES-K0H，pH 6.15)中，在冷光源下照射311以使 气孔完全打开;然后再分别用〇μΜ和30μΜ ΑΒΑ处理叶片2h;最后，在冷光源下观察并记录气 孔孔径。实验重复了 5次，结果一致，每个样本均记录约60个气孔孔径，误差线表示标准误差 (SE)，不同字母代表同一 ΑΒΑ浓度下各处理之间差异显著(P〈0.05)。
[0094] 结果如图2中B所示，在冷光源照射3h后，CRK5转基因株系0E-1和0E-2气孔的起始 孔径与野生型Col-Ο基本一致(P>0.05)，但是30μΜ ΑΒΑ继续处理2小时后，CRK5转基因株系 0Ε-1和0Ε-2气孔孔径相对于野生型Col-Ο变得更小(Ρ〈0.05)，即0Ε-1和0Ε-2气孔关闭的程 度大于Col-Ο，对ΑΒΑ诱导气孔关闭更加敏感，表现出对ΑΒΑ超敏的表型;表明CRK5在ΑΒΑ诱导 气孔关闭过程中具有正调节作用。
[0095]综合以上结果，相对于野生型Col-Ο，实施例1得到的Τ3代纯合体CRK5转基因株系 (0Ε-1和0Ε-2)在ΑΒΑ促进气孔关闭和ΑΒΑ抑制气孔开放过程中气孔关闭的程度均高于野生 型Co 1 -0，表现出对ΑΒΑ超敏的表型，说明CRK5在ΑΒΑ诱导气孔关闭和ΑΒΑ抑制气孔开放过程 中具有正调节作用。
[0096] 二、干旱实验
[0097]以拟南芥野生型（Col-Ο生态型）及实施例1得到的两个Τ3代纯合体CRK5转基因株 系(0Ε-1和0Ε-2)为实验材料。将生长两周的各基因型植株的幼苗由培养皿移至土中之后， 干旱实验组一直保持不浇水，对照组正常浇水。等出现表型后拍照记录实验结果，然后复 水。复水24h后，拍照记录实验结果，并且统计存活率。实验重复了 5次，每个基因型每次均用 至少30株，结果一致，误差线表示标准误差（SE)，不同字母代表同一 ΑΒΑ浓度下各处理之间 差异显著(Ρ〈0.05)。
[0098]结果如图3中Α所示，在正常浇水的对照组中，各植株生长没有明显差异。而干旱组 中，CRK5转基因株系0E-1和0E-2植株较Col-Ο生长相对正常，对干旱胁迫的敏感性降低，表 现出抗旱性。如图3中B所示，干旱组复水24小时后，CRK5转基因株系0E-1和0E-2存活率显著 高于野生型Col-0(P〈0.05)。因此，高表达CRK5使得植物的抗旱性增强。
【主权项】
1. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质在如下al)-a2)任一中的应用： al)提高植物抗旱性； a2)选育抗旱性提高的植物品种。2. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因在如下al)_a2)任一 中的应用： al)提高植物抗旱性； a2)选育抗旱性提高的植物品种。3. 培育抗旱性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入由序列表 中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到转基因植物;所述转基因植物与 所述受体植物相比抗旱性提高。4. 根据权利要求1-3中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述由序列表中序列3所 示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下1)至5)中任一所述的DNA分子： 1) 编码序列为序列表中序列2自5'末端第1至1992苷酸所示的DNA分子； 2) 序列表中序列2所示的DNA分子； 3) 序列表中序列1所示的DNA分子； 4) 在严格条件下与1)-3)任一所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列3所示的氨 基酸序列组成的蛋白质的DNA分子； 5) 与1)_4)任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列3所示的氨 基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:在所述方法中，所述由序列表中序列3 所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表 达载体导入所述受体植物中的。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述蛋白质的编 码基因转录的启动子为35S启动子。7. 由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在如下(a)或(b)中 的应用： (a) 协同ABA促进植物气孔关闭； (b) 协同ABA抑制植物气孔开放。8. 根据权利要求1-7中任一所述的应用或方法，其特征在于:所述植物为双子叶植物或 单子叶植物。9. 根据权利要求8所述的应用或方法，其特征在于:所述双子叶植物为十字花科植物。
【文档编号】A01H5/00GK105950583SQ201610382213
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】张大鹏, 路凯, 王小芳
【申请人】清华大学