一种无信号肽胞外生产淀粉分支酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种无信号肽胞外生产淀粉分支酶的方法，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于热葡糖苷酶地芽孢杆菌(Geobacillus thermoglueosidan)的不含自身信号肽序列的淀粉分支酶基因表达于大肠杆菌中，并采用一些培养策略，实现了淀粉分支酶的无信号肽胞外生产。相比于淀粉分支酶的胞内生产，产量明显提高，并简化了分离纯化步骤，重组淀粉分支酶在E.coli中的胞外表达有利于其工业化大规模生产。
【专利说明】
一种无信号肽胞外生产淀粉分支酶的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种无信号肽胞外生产淀粉分支酶的方法，属于基因工程和酶工程领 域。
【背景技术】
[0002] 淀粉分支酶（1，4-a-glucan branching enzyme;GBE;EC 2·4· 1 · 18)是一种属于糖 苷水解酶家族13的糖基转移酶，是合成糖原及支链淀粉的关键酶。它首先将底物分子上某 一 α_1，4糖苷键水解，切下一个直链葡聚糖片段，继而通过转糖基作用将该片段转移至余下 底物分子上某一葡萄糖残基的第6位碳原子上，形成α_1，6糖苷键。由于经淀粉分支酶改性 的淀粉即高支化淀粉具有特殊理化特性、生理功能及更高的安全性，因此在食品、医药等工 业中具有广阔的应用前景。
[0003] 大肠杆菌表达系统与其它表达系统相比，具有较清楚的遗传性状、操作简便、生长 快、表达量大、培养成本低，适于大规模发酵培养的特点，是现阶段最常用的表达系统。目前 已有大量有关重组蛋白在该系统高效表达的研究，但是异源蛋白表达的同时，容易出现被 宿主蛋白酶降解或者形成包涵体、表达效率难以较大程度的提高、活性不够等问题，而分泌 到细胞周质或培养基中要比定位于细胞质有多个优点，包括简化蛋白下游加工、促进蛋白 折叠与稳定、提高蛋白可溶性与生物学活性等。微生物来源的淀粉分支酶是胞内酶，本身不 含信号肽，因此，目前淀粉分支酶的异源表达主要是在大肠杆菌中的胞内表达，鲜有报道淀 粉分支酶融合了分泌信号肽后的胞外表达，更没有关于无信号肽的淀粉分支酶胞外表达的 报道。
[0004] 异源表达淀粉分支酶突出的问题是，蛋白表达量低、淀粉分支酶酶活低。因此，构 建重组大肠杆菌进行胞外分泌淀粉分支酶，对于满足淀粉分支酶工业化成产需求和降低生 产成本有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种产淀粉分支酶的重组大肠杆菌。
[0006] 所述重组大肠杆菌是将淀粉分支酶基因插入去除了 pelB信号肽的质粒pET-20b ( + )，将重组质粒在大肠杆菌中进行表达得到的重组大肠杆菌。
[0007] 在本发明的一种实施方式中，编码所述淀粉分支酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌是E.coli BL21(DE3)。
[0009] 编码所述淀粉分支酶的基因来源于Geobacillus thermoglueosidan STB02。
[0010] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述重组大肠杆菌的方法，是将 淀粉分支酶基因插入质粒PET-20M + )的T7启动子序列下游，构建了不含pelB信号肽表达载 体pET-20b( + )/gbe，并将其转化至宿主E.coli BL21(DE3)中进行表达。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：
[0012] (1)获取不含信号肽的序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，将目的基因连接至 pMD18_T simple vector，获得质粒pMD18_T simple/gbe;
[0013] (2)将质粒pMD18-T simple/gbe和pET-20b( + )进行双酶切，用连接酶连接得到重 组质粒 pET_20b( + )/gbe;
[0014] (3)将步骤(2)得到的重组质粒转化到宿主E. coli BL21 (DE3)，即得到重组大肠杆 菌。
[0015] 本发明还提供一种应用所述重组大肠杆菌发酵产淀粉分支酶的方法，是将重组大 肠杆菌以TB培养基为发酵培养基，在30-37 °C、180-200r/min培养，当0D6QQ达到0.5-0.6时， 添加0-0.4mM的IPTG后，在25-37 °C、180-200r/min条件下发酵产酶。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，以LB培养基活化重组大肠杆菌得到种子液。
[0017]在本发明的一种实施方式中，将重组大肠杆菌以TB培养基为发酵培养基，在35-37 °C、180-200r/min培养，当0D6QQ达到0 · 5-0 · 6时，添加0-0 · OlmM的IPTG后，在25-37°C、180-200r/min条件下发酵产酶。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，将重组大肠杆菌种子液以2%的接种量接种到TB培 养基，在37 °C、200r/min条件下培养，当0D6QQ达到0 · 6时，添加 0 · 0ImM的IPTG，在30 °C、200r/ min条件下发酵产酶。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 本发明通过构建不含有信号肽的重组大肠杆菌，实现了淀粉分支酶的高效胞外分 泌表达，生产强度显著提高，例如不需要添加诱导剂，不需要超声破碎，胞外淀粉分支酶表 达量是胞内的1.75倍，胞外酶活可达175U/mL，胞外酶活占总酶活的比例达到74.7%。
【附图说明】
[0021] 图1:克隆表达载体构建图
[0022] 图2:发酵培养基对重组淀粉分支酶胞外生产的影响
[0023] 图3:诱导剂浓度对重组淀粉分支酶胞外生产的影响
[0024] 图4:诱导温度对重组淀粉分支酶胞外生产的影响
【具体实施方式】
[0025]实施例1重组大肠杆菌的构建
[0026]热葡糖苷酶地芽孢杆菌淀粉分支酶基因 （Gene Bank)全长1938bp。按照如图1所示 的构建方法，首先获取不含信号肽的序列是SEQ ID NO. 1所示序列的基因片段，将目的基因 连接至pffl)18-T simple vector，获得质粒pMD18_T simple/gbe。将质粒pMD18_T simple/ gbe和pET-20b( + )进行双酶切，用连接酶连接得到重组质粒pET-20b( + )/gbe。将重组质粒 pET-20b( + )/gbe通过热激法转化BL21(DE3)感受态细胞。转化液涂布含氨苄青霉素 （100yg/ mL)LB平板，提取质粒测序验证构建的重组质粒。测序工作由上海生工完成。
[0027]实施例2重组大肠杆菌摇瓶培养
[0028] 挑取含有重组质粒的E.coli BL21(DE3)的单克隆于含100yg/mL氨苄青霉素的LB 培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以体积比2%的接种量接种到含100yg/mL氨苄 青霉素的TB培养基中，在30°C、200r/min下发酵48h;将发酵液于4°C、10000rpm离心15min以 除去菌体，收集上清液。
[0029]实施例3酶活测定分析
[0030] 用0 · 9mL的50mmo 1/L磷酸缓冲液(pH 7 · 5)配制0 · 25 % (w/v)马铃薯支链淀粉标准 溶液，加入〇. lmL酶液，在50°C下反应15min。反应结束后沸水浴灭酶lOmin，并以10000r/min 离心2min待显色用。显色体系为0.3mL反应上清液与5. OmL显色液(0.05% (w/v)KI，0.005% (w/v)l2，pH 7.5)于7mL离心管中混合，显色15min后在530nm处测定吸光值。酶活定义：在 530nm处，吸光值每分钟降低1 %所需的酶量为一个酶活单位。
[0031]实施例4发酵培养基的选择
[0032] 挑取含有重组质粒的E.coli BL21(DE3)的单克隆于含100yg/mL氨苄青霉素的LB 培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以体积比2%的接种量接种到含100yg/mL氨苄 青霉素的4种典型的大肠杆菌培养基SOB、S0C、LB、TB培养基中，开始培养温度为37 °C、摇床 转速为200r/min，当菌体浓度培养至0D600至0.6时，加入0.0 lmM的IPTG后迅速转至在30 °C、 200r/min下继续诱导48h，将发酵液于4°C、lOOOOrpm离心15min以除去菌体，收集上清液测 定淀粉分支酶酶活，结果见图2。在这些培养基中，TB培养基最有利于重组淀粉分支酶的胞 外生产。E. co 1 i在TB培养基中发酵48h，胞外酶活达到120. lU/mL，是在LB培养基中的大约15 倍。分析其原因可能是，TB培养基有相对高的pH缓冲能力，有利于菌体的生长和重组酶的稳 定;TB培养基中酵母粉含量更高，营养成分更加丰富，适合菌体生长。
[0033] LB 培养基:酵母粉 5g/L，胰蛋白胨 10g/L，NaCl 10g/L，pH7.0
[0034] SOB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨20g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 2.5mM，MgCl210mM， ρΗ7·0
[0035] S0C培养基:酵母粉5g/L，胰蛋白胨20g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 2.5mM，MgCl210mM，葡 萄糖 20mM，pH7.0
[0036] TB培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，KH2P〇4l7mM，K2HP〇472mM， ρΗ7·0
[0037] 实施例5诱导剂浓度对重组淀粉分支酶胞外生产的影响
[0038] 挑取含有重组质粒的E.coli BL21(DE3)的单克隆于含100yg/mL氨苄青霉素的LB 培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以体积比2%的接种量接种到含100yg/mL氨苄 青霉素的TB培养基中，开始培养温度为37°C、摇床转速为200r/min，当菌体浓度培养至 0D600至0.6时，加入0-0.4mM的IPTG后迅速转至在30°C、200r/min下继续诱导48h，将发酵液 于4°C、1 OOOOrpm离心15min以除去菌体，收集上清液测定淀粉分支酶酶活，结果见图3。较低 的IPTG浓度有利于重组酶的胞外生产，以IPTG浓度为0.0 lmM为最佳，培养基中淀粉分支酶 的酶活达到133.8U/mL。
[0039] 实施例6诱导温度对重组淀粉分支酶胞外生产的影响
[0040] 挑取含有重组质粒的E.coli BL21(DE3)的单克隆于含100yg/mL氨苄青霉素的LB 培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以体积比2%的接种量接种到含100yg/mL氨苄 青霉素的TB培养基中，开始培养温度为37°C、摇床转速为200r/min，当菌体浓度培养至 0D600至0 · 6时，加入0 · 0ImM的IPTG后迅速转至在25 °C、30 °C、37 °C、200r/min下继续诱导74h 取样测淀粉分支酶酶活，结果见图4。当诱导温度为30°C最有利于重组淀粉分支酶的胞外生 产，培养基中淀粉分支酶的酶活达到175U/mL。
[0041]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种产淀粉分支酶的重组大肠杆菌，其特征在于，将在核苷酸序列是SEQ ID NO. 1所 示序列的淀粉分支酶基因插入去除了PelB信号肽的质粒pET-20b( + )中，将重组质粒在宿主 菌E.coli BL21(DE3)中进行表达得到的重组大肠杆菌。2. 编码权利要求1所述重组大肠杆菌的核苷酸序列。3. 含有权利要求3所述核苷酸序列的载体或细胞。4. 一种获得权利要求1所述重组大肠杆菌的方法，其特征在于，所述方法具体是:将SEQ ID N0.1所示序列的淀粉分支酶基因插入质粒pET-20b( + )的T7启动子序列下游，构建了不 含PelB信号肽表达载体pET-20b( + )/gbe，并将其转化至宿主E.coli BL21(DE3)中进行表 达。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：（1)获取不含信号肽的序 列是SEQ ID N0.1所示序列的基因片段，将目的基因连接至pMD18-simple vector，获得质 粒pMD18_T simple/gbe; (2)将质粒pMD18_T simple/gbe和pET_20b( + )进行双酶切，用连接 酶连接得到重组质粒pET-20b( + )/gbe;(3)将步骤2得到的重组质粒转化到宿主E.coli BL21(DE3)，即得到重组大肠杆菌。6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，挑取含有重组质粒的E.coli BL21 (DE3)的 单克隆于含lOOyg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在37°C、200r/min下培养8~12h，以体积比 2%的接种量接种到含lOOyg/mL氨苄青霉素的TB培养基中，开始培养温度为37°C、摇床转速 为200r/min，当菌体浓度培养至0D600至O . 6时，加入O . OImM的IPTG后迅速转至在30 °C、 200r/min下继续诱导48h;将发酵液于4°C、1000 Orpm离心15min以除去菌体，收集上清液。7. 根据权利要求1-6任一所述方法得到的淀粉分支酶。8. 权利要求2所述的重组大肠杆菌在淀粉分支酶胞外生产方面的应用。
【文档编号】C12R1/19GK105950579SQ201610345583
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】李兆丰, 顾正彪, 刘艺婷, 李才明, 程力, 洪雁
【申请人】江南大学