固体型微生物肥料中有效活菌的菌体洗脱液及其洗脱方法
【专利摘要】固体型微生物肥料中有效活菌的菌体洗脱液及其洗脱方法，它涉及一种固体肥料中有效活菌的菌体洗脱液及其洗脱方法。它解决了固体型微生物肥料中因固体载体与解磷细菌之间存在着复杂的吸附作用，导致菌体回收率一直严重偏低的问题。菌体洗脱液由吐温80和pH值7.2～8.0的加NaCl磷酸盐缓冲液组成。洗脱方法：取固体型微生物肥料加入带玻璃珠并盛有本发明菌体洗脱液的容器中静置，然后在转速为220rpm的条件下震荡培养，即完成固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱。本发明方法与现有洗脱方法相比有效活菌的洗脱率提高了36.1％以上，误差更小，更为接近真实情况。
【专利说明】
固体型微生物肥料中有效活菌的菌体洗脱液及其洗脱方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种固体肥料中有效活菌的菌体洗脱液及其洗脱方法。
【背景技术】
[0002] 为了实现农业的可持续发展，改良土壤环境、增加产量、提高作物品质，微生物肥 料已经成为关注的热点，被广泛应用于农业生产中。与其他剂型微生物肥料相比，固体型微 生物肥料具有易储存和运输、施用方法简单及节约劳动成本等优点，受到农业生产者的青 睐。
[0003] 有效活菌的数量是评价微生物肥料质量的关键因素。目前测定微生物肥料中的有 效活菌数的方法依然采用平板计数法。褐煤是目前固体型微生物肥料中最为主要和常见的 载体，巨大芽孢杆菌为固体型微生物肥料中具有代表性解磷微生物菌体，因此需要将固体 型微生物肥料中的解磷细菌洗脱下来。但由于固体型微生物肥料中固体载体与解磷细菌之 间存在着复杂的吸附作用，包括分子间力、静电力、疏水作用力、氢键和空间位阻效应等多 种作用力。所以，参照现有国家标准GB 20287-2006进行固体型微生物肥料中细菌的洗脱， 回收率一直严重偏低、误差较大，不利于固体型微生物肥料的后续的研究和利用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决固体型微生物肥料中固体载体与解磷细菌之间存在着 复杂的吸附作用，导致细菌洗脱率一直严重偏低的问题，而提供的一种固体型微生物肥料 中有效活菌的菌体洗脱液及其洗脱方法。
[0005] 本发明固体型微生物肥料中有效活菌的菌体洗脱液由5ml的吐温80和95ml的pH值 7.2~8.0的加 NaCl磷酸盐缓冲液组成;95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷酸盐缓冲液由85ml 浓度是0.2mol/L的Na2HP04溶液和l〇ml浓度是0.3mol/L的NaH 2P04溶液组成；菌体洗脱液中 NaCl的浓度为18~22mmol/L。
[0006] 利用上述菌体洗脱液洗脱固体型微生物肥料中有效活菌的方法按以下步骤进行：
[0007] 取固体型微生物肥料加入带玻璃珠并盛有本发明上述菌体洗脱液的容器中静置， 然后在转速为220rpm的条件下震荡培养，即完成固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱。 [0008]细菌在载体粘粒表面的吸附是热力学自发过程，与微生物和载体的表面性质如表 面电荷、疏水性以及所处的环境条件如PH、电解质浓度、温度等都有着密切的关系。本发明 通过改变洗脱过程中固体型微生物肥料的微环境，从而减弱细菌与载体之间的吸附作用， 增强菌体由载体表面的释放，进而提高固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱效率，更为真 实的反映固体型微生物肥料的质量。
[0009]本发明方法与现有洗脱方法相比有效活菌的洗脱率提高了30%以上，误差更小， 更为接近真实情况。
【具体实施方式】
[0010] 本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
【具体实施方式】 [0011] 一:本实施方式洗脱固体型微生物肥料中有效活菌的方法按以下步 骤进行：
[0012] 取固体型微生物肥料加入带玻璃珠并盛有菌体洗脱液的容器中静置，然后在转速 为220rpm的条件下震荡培养，即完成固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱；
[0013] 其中，菌体洗脱液由5ml的吐温80和95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷酸盐缓冲液 组成;95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷酸盐缓冲液由85ml浓度是0.2mol/L的Na2HP〇4溶液和 10ml浓度是0.3mol/L的NaH2P〇4溶液组成;菌体洗脱液中NaCl的浓度为18~22mmol/L。
【具体实施方式】 [0014] 二:本实施方式与一的不同点是：固体型微生物肥料 与菌体洗脱液的比例为l〇g: l〇〇ml。其它与实施方式一相同。
【具体实施方式】 [0015] 三：本实施方式与一或二的不同点是：静置时间为 20min。其它与实施方式一或二相同。
【具体实施方式】 [0016] 四：本实施方式与一至三之一的不同点是:震荡培养 时间为30min。其它与实施方式一至三之一相同。
【具体实施方式】 [0017] 五:本实施方式与一至四之一的不同点是：固体型微 生物肥料是以褐煤为载体的固体型微生物肥料。其它与实施方式一至四之一相同。
[0018] 褐煤是目前固体型微生物肥料中最为主要和常见的载体。
【具体实施方式】 [0019] 六:本实施方式与一至五之一的不同点是：固体型微 生物肥料是以巨大芽孢杆菌为堆肥发酵菌的固体型微生物肥料。其它与实施方式一至五之 一相同。
[0020] 巨大芽孢杆菌为固体型微生物肥料中具有代表性微生物菌体。
[0021] 对比试验
[0022] -、菌液的制备:活化巨大芽孢杆菌，然后接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于 30 °C、120r/min环境中培养48h，保存备用。
[0023]二、载体的处理:褐煤来自鸡西，腐殖酸含量43.5%;将褐煤pH值调节至7.0、高压 121°C蒸汽灭菌lh，检查无菌后备用。
[0024]三、吸附：按1.8 X 108cfu/g的接菌数将巨大芽孢杆菌与经高压蒸汽灭菌的褐煤载 体均匀混合，再用无菌水调水分为30%~35%，密封室温放置。
[0025]四、洗脱：
[0026] 方法1、参照国家标准GB 20287-2006,称取步骤三吸附有巨大芽孢杆菌的褐煤10g 加入带玻璃珠并盛有l〇〇ml无菌水的三角瓶中静置20min，然后200rpm震荡培养30min后进 行洗脱。
[0027]方法2、采用本发明方法，称取步骤三吸附有巨大芽孢杆菌的褐煤10g加入带玻璃 珠并盛有l〇〇ml菌体洗脱液的三角瓶中静置20min，然后220rpm震荡培养30min;其中，菌体 洗脱液为pH值7.6的加 NaCl及吐温80的磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液由85ml浓度是0.2mol/ L的Na2HP〇4和10ml浓度是0.3mol/L的NaH2P〇4组成；菌体洗脱液中NaCl的浓度为20mmol/L， 每100ml菌体洗脱液中表面活性剂吐温80的加入量为5ml。
[0028] 五、稀释平板法计数，每组测定重复10次，结果如表1所示。
[0029] 方法1测定本实验固体型微生物肥料样品的有效活菌数为7.2X107cfu/g。
[0030] 方法2测定本实验固体型微生物肥料样品的有效活菌数平均值为1.37 X 108cfu/ g°
[0031] 本发明固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱方法显著提高了载体褐煤上巨大芽 孢杆菌的菌体洗脱率，有效活菌的菌体洗脱率在现有技术的基础上提高了36.1%，与原有 洗脱方法相比，具有显著性差异(P〈〇.05)。
[0032] 表1固体型微生物肥料中有效活菌数洗脱测定结果
[0033]
[0034] 有效活菌数单位107cfu/g
【主权项】
1. 固体型微生物肥料中有效活菌的菌体洗脱液，其特征在于该菌体洗脱液由5ml的吐 温80和95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷酸盐缓冲液组成;95ml的pH值7.2~8.0的加 NaCl磷 酸盐缓冲液由85ml浓度是0.2mol/L的Na2HPO4溶液和IOml浓度是0.3mol/L的NaH 2PO4溶液组 成;菌体洗脱液中NaC 1的浓度为18~2 2mmo I /L。2. 固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱方法，其特征在于洗脱固体型微生物肥料中有 效活菌的方法按以下步骤进行： 取固体型微生物肥料加入带玻璃珠并盛有权利要求1所述菌体洗脱液的容器中静置， 然后在转速为220rpm的条件下震荡培养，即完成固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱。3. 根据权利要求2所述的固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱方法，其特征在于固体 型微生物肥料与菌体洗脱液的比例为I Og: I OOml。4. 根据权利要求2所述的固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱方法，其特征在于静置 时间为20min。5. 根据权利要求2所述的固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱方法，其特征在于震荡 培养时间为30min。6. 根据权利要求2所述的固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱方法，其特征在于固体 型微生物肥料是以褐煤为载体的固体型微生物肥料。7. 根据权利要求2所述的固体型微生物肥料中有效活菌的洗脱方法，其特征在于固体 型微生物肥料是以巨大芽孢杆菌为堆肥发酵菌的固体型微生物肥料。
【文档编号】C12N1/02GK105950470SQ201610373523
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年5月31日
【发明人】安琦, 殷博, 曹亚彬, 郭立姝, 樊川, 张欣, 牛彦波, 吴皓琼, 王笑庸
【申请人】黑龙江省科学院微生物研究所