一种特异性肿瘤抗原cea的ctl识别表位肽及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种CEA来源的抗肿瘤CTL表位肽，为九肽，其氨基酸序列为Thr?Gly?Phe?Tyr?Thr?Leu?His?Val?Ile。本发明还包括上述肽在制备肿瘤治疗性DC?CIK中的应用。本发明所制备的特异性的DC?CIK细胞对结肠癌细胞Lovo显示出一定的杀伤率，可用于制备结肠癌等CEA阳性的相关肿瘤的特异性自体免疫细胞的制备。
【专利说明】
一种特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及表位肽技术领域，尤其涉及一种特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽 及其应用，还涉及一种肿瘤抗原CEA特异性DC细胞的制备方法及其应用，以及一种肿瘤抗原 CEA特异性DC-CIK细胞的制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 癌胚抗原（carcino-embryonic antigen CEA)是大肠癌组织产生的一种糖蛋白， 作为抗原可引起患者的免疫反应。1965年，CEA最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，CEA升高 主要见于结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌，其他恶性肿瘤也有不同程度的 阳性率。但吸烟、妊娠期和心血管疾病、糖尿病、非特异性结肠炎等疾病，15~53%的病人血 清癌胚抗原也会升高。虽然CEA不是恶性肿瘤的特异性标志，但对于肿瘤的早发现具有重要 意义。
[0003] 目前临床上肿瘤治疗方法主要包括手术，放化疗等。手术和放疗对局部肿瘤有较 好的疗效，而对全身性、转移性以及微小病灶的治疗主要依靠化疗和免疫治疗。最新研究表 明，其实肿瘤在发生的早期就有部分肿瘤细胞转移到其他组织，暂时潜伏起来，这可能是很 多肿瘤在治疗后，出现复发和转移的主要原因。因此肿瘤的治疗需要作为全身性疾病进行 治疗，不仅要去除局部病灶的肿瘤，还要防止肿瘤的复发、转移及对脏器的侵袭。但是传统 的化疗药物因其毒副作用，患者无法耐受，肿瘤患者并没有明显改善。其毒副作用限制其临 床使用，因此需要更好的全身治疗的手段。
[0004] 目前临床上治疗肿瘤最有效的方法应当属肿瘤细胞免疫治疗，是采集患者外周血 淋巴细胞进行体外诱导和培养，获得足够数量具有免疫活性的T细胞，再回输给患者，可特 异性识别和杀伤肿瘤细前在国内胞。临床应用的肿瘤T细胞治疗技术多为(：11(((^1 〇1^116-induced killer，CIK)、DC(dendritic cells，DC) 'DC-CIK^DC-CIK表现出更好的革巴向性和 特异性，对肿瘤的治疗更为有效，无毒副作用，对提高生命质量、延长生存期有显著地效果， 是目前肿瘤全身治疗的最佳手段之一，具有巨大的临床潜力。
[0005] 然而，目前在诱导特异DC-CIK细胞的抗原仍有待改进，缺乏能够高效刺激肿瘤特 异性DC-CIK的CTL表位多肽抗原。
【发明内容】
[0006] 基于【背景技术】存在的技术问题，本发明目的在于提供一种特异性肿瘤抗原CEA的 CTL识别表位肽。
[0007] 本发明目的还在于提供上述特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽的应用。
[0008] 本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原CEA特异性DC细胞的制备方法。
[0009] 本发明目的还在于提供一种肿瘤抗原CEA特异性DC-CIK细胞的制备方法。
[0010] 本发明目的还在于提供上述肿瘤抗原CEA特异性DC细胞和DC-CIK细胞的应用。
[0011] 为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：
[0012] 本发明提出的一种特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽，所述CTL识别表位肽为 九肽，其氨基酸序列如下:Thr-Gly-Phe-Tyr-Th;r-Leu-His-Val-Ile 〇
[0013] 上述特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽采用固相合成法进行合成。基本流程如 下:首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱 掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上;其次将第二个氨基被Fmoc基团保护 的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固相载体的第一个氨 基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基的二肽。重复上述 的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割得到目的 肽，再经HPLC纯化，其纯度大于90 %。
[0014] 本发明还提出的上述特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽在制备具有CEA表达的 肿瘤治疗性多肽疫苗的应用。
[0015] 优选地，上述特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽在制备结肠癌治疗性多肽疫苗 中的应用，尤其对结肠癌细胞Lovo具有杀伤力。
[0016] 本发明还提出的一种肿瘤抗原CEA特异性DC细胞的制备方法，采用上述特异性肿 瘤抗原CEA的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。
[0017] 本发明还提出的上述肿瘤抗原CEA特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞 在制备治疗CEA阳性相关肿瘤药物中的应用。
[0018] 本发明还提出的一种肿瘤抗原CEA特异性DC-CIK细胞的制备方法，采用上述特异 性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽进行诱导得到。
[0019] 本发明还提出的上述肿瘤抗原CEA特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性 DC-CIK细胞在制备治疗CEA阳性相关肿瘤药物中的应用。
[0020] 本发明巧妙利用CEA在结肠癌、肺癌等癌组织中高表达，而在正常组织中表达很 低，从而采用理论和实验相结合的方法筛选得到肿瘤相关抗原的表位肽，所得表位肽未见 文献报道，为研制基于抗原CEA的肿瘤疫苗或肿瘤特异性CTL细胞的制备提供理论基础，并 为后续多价的抗原肽疫苗构建奠定基础。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明提出的一种特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽的质谱分析图。 [0022]图2为本发明实施例1所得P1、P2、P3……P20各自诱导得到的特异性CTL细胞分泌 INF-γ的能力对比图。
[0023]图3为本发明实施例1所得?2、？3、？6116各自诱导得到的特异性(：1^细胞对结肠癌 细胞Lovo杀伤能力对比图。
[0024]图4为由本发明提出的一种特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽所制备得到的特 异性CTL细胞免疫细胞群的流式细胞仪检测数据的统计分析图。
【具体实施方式】
[0025]下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0026]实施例1:合成表位肽
[0027]采用理论与实践相结合的方法，根据抗原的一级结构，综合运用免疫信息学手段， 运用SYFPEITHI、B頂AS、NetCTL、WAPP和EpiJen综合对CEA的抗原CTL表位进行预测分析，选 取评分前20的多肽序列进行试验筛选，一次命名为PI、P2、P3……P20。
[0028]基本流程如下:首先将一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体 Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上;其次将第二个氨 基被Fmoc基团保护的氨基酸的羧基缩合剂活化，活化后的第二个氨基酸羧基再与已接在固 相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，此时在固相载体上就生成了一个带有保护基 的二肽。重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度， 最后切割得到目的表位肽粗品。将目的表位肽粗品经HPLC纯化得到目的表位肽精肽，其纯 度大于90%，质谱分析证实其分子量符合理论值。
[0029]本发明提出的一种特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽采用Fmoc固相合成法进 行合成，所述CTL识别表位肽为九肽，编号为P3，其氨基酸序列如下:Thr-Gly-Phe-Tyr-Thr-Leu-His-Val-Ile。对P3进行质谱分析，其质谱分析结果如图1所示，可以证实其分子量为 1050.2071 g/mol，符合理论值。
[0030]实施例2:多肽功能检测
[0031]上述所得P3和其余19个表位肽，可用于制备具有CEA表达的肿瘤治疗性多肽疫苗， 其应用实验如下：
[0032] 1、上述CTL识别表位肽诱导特异性CTL细胞、IFN- 丫分泌及对肿瘤靶细胞的杀伤实 验检测：抽取患者的外周血经密度梯度离心分离，获得PBMCs，添加细胞因子培养DC细胞和 CTL细胞，进一步采用DC细胞负载本发明的CEA表位肽，与CTL共培养刺激特异的CTL扩增，进 一步在体外采用ELISA和LDH实验检测特异的CTL在特异抗原刺激下INF- γ的分泌及对结肠 癌细胞Lovo的杀伤作用。
[0033]具体方法如下：
[0034] (I)、PBMC的分离与诱导：
[0035] 1)将50mL抗凝处理的外周血，2000rpm离心10min;
[0036] 2)收集上层血浆冻存，用PBS(pH=7.4)稀释剩下的血细胞；
[0037] 3)将稀释的血细胞加入到等体积的淋巴分离液液面上；
[0038] 4)2(TC离心20min，关闭离心机刹车；
[0039] 5)离心后，分为四层，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜层(即第二层）；
[0040] 6)取出的白膜层用PBS洗涤两遍；
[00411 7)将细胞以2~5X106/mL接种到6孔板内，2h后，回收未贴壁的细胞，用预包被 &拉卜0)3186和&拉丨-0)28186的培养板进行激活培养；
[0042] 8)贴壁的细胞加入GM-CSF和IL-4刺激培养5天诱导成DC细胞，第三天半换液；
[0043] 9)第5天，收集DC细胞，将10yg实施例1所得目的表位肽精肽加入DC细胞中，lh后， 将DC细胞与激活的T细胞共培养，同时加入IL2及IL-15;
[0044] 10)继续培养5天后，得到抗原特异的CTL细胞进行细胞因子分泌及对肿瘤细胞的 杀伤实验。
[0045] (11 )、IFN-γ 细胞因子分泌检测：Human IFN-gamma Platinum ELISA( IFN-γ ELISA检测试剂盒，eBioscience公司)检测CTL细胞分泌的IFN-γ，步骤如下：
[0046] 1)将CTL细胞去除细胞因子培养24h后，接种到96孔板内；
[0047] 2)细胞中加入刺激对应的多肽再次刺激24h后，离心去除细胞，收集细胞上清；
[0048] 3)采用ELISA检测上清中IFN- γ的表达，选择IFN- γ分泌较多的CTL表位肽进行杀 伤实验。
[0049] 结果如图2所示，Ρ2和Ρ3、Ρ6、Ρ16负载的DC细胞均能够较好诱导出特异性CTL细胞， 分泌较高量的IFN-γ。
[0050] (III)、肿瘤细胞杀伤实验：采用乳酸脱氢酶（LDH)释放检测法，使用CytoTox 96Non_Radioactive Cytotoxicity Assay(细胞毒性检测试剂盒，Promega公司）进行LDH试 验检测细胞杀伤能力。步骤如下：
[0051] 1)设立检测培养板(100μL孔）
[0052] a.设立实验组：以CEA阳性表达的结肠癌细胞Lovo为靶细胞，按效应细胞和靶细胞 比为5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL细胞
[0053] b.设立效应细胞自发释放组
[0054] c.设立靶细胞自发释放组
[0055] d.设立靶细胞最大释放组
[0056] e.设立背景对照组 [0057] 2)细胞裂解及收获上清
[0058] &.37。〇5%0)2共培养511
[0059] b.靶细胞最大释放组中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min离心收集上清
[0060] 3)LDH 检测
[0061 ] a.转移50yL上清至另一个96孔板
[0062] b.每孔加入50yL稀释的底物混合物，室温避光孵育30min
[0063] c.每孔添加 50yL终止液
[0064] d.在490nm下检测吸光值0D [0065]细胞杀伤率计算公式如下：
[0066] 杀伤率（％ ) = [ (0D孅且-0D规_6酸；输齟-0Df_a自发稀齟)/(0D_mt稀齟-0D__发输齟)] X100%
[0067] 结果如图3所示，图3为本发明实施例1所得?213、？6116各自诱导得到的特异性 CTL细胞对结肠癌细胞Lovo杀伤能力对比图；由图3可知，P3诱导的CTL细胞对结肠癌细胞 Lovo杀伤效果最好。
[0068] 2、采用流式分析获得的特异CTL中各种免疫细胞所占的百分比，结果如图4所示。 由图4可知，本发明由P3制备获得的免疫细胞群中含有大量的CTL细胞，同时也含有一定比 例的NKT细胞，即该免疫细胞群具有较好的免疫活性，具有强大的杀伤特定肿瘤细胞的能 力。
[0069] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽，其特征在于，所述CTL识别表位肽为九 肽，其氨基酸序列为 Thr-Gly-Phe-Tyr-Thr-Leu-His-Val-I Ie 〇2. 权利要求1所述特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽在制备具有CEA表达的肿瘤治 疗性多肽疫苗的应用。3. 权利要求1所述特异性肿瘤抗原CEA的CEACTL识别表位肽在制备结肠癌治疗性多肽 疫苗中的应用。4. 一种肿瘤抗原CEA特异性DC细胞的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1所述特 异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽加入DC细胞进行培养得到。5. 根据权利要求4所述肿瘤抗原CEA特异性DC细胞的制备方法得到的特异性DC细胞在 制备治疗CEA阳性相关肿瘤药物中的应用。6. -种肿瘤抗原CEA特异性DC-CIK细胞的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1所 述特异性肿瘤抗原CEA的CTL识别表位肽进行诱导得到。7. 根据权利要求6所述肿瘤抗原CEA特异性DC-CIK细胞的制备方法得到的特异性DC-CIK细胞在制备治疗CEA阳性相关肿瘤药物中的应用。
【文档编号】A61K35/15GK105949303SQ201610483231
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】唐奇, 赵薇, 许国贞, 刘振云, 熊四平, 冯振卿, 朱进
【申请人】安徽未名细胞治疗有限公司